代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

摘要

本文介绍了一种基于未标记与标记去污剂混合物的植物质膜分馏的稳健方法，可将质膜分离为去污剂抗性膜和去污剂可溶性膜 体内 完全 ¹⁵N标记 拟南芥 细胞培养。该方法适用于比较蛋白质组学研究，以理解信号传导过程。

摘要

质膜微区是基于脂质和甾醇环境物理特性形成的结构，在信号传导过程中具有特定作用。从植物细胞中提取富含甾醇的质膜微区用于蛋白质组学分析是一项具有挑战性的任务，主要由于制备步骤繁多，且容易受到其他细胞区室成分的污染。在植物细胞中，质膜仅占所有膜结构的约5-20%，因此获得高纯度的质膜组分十分困难。常用的一种方法是利用聚乙二醇和葡聚糖进行水相两相分离，该方法可获得纯度达95%的质膜囊泡¹。质膜中富含甾醇的微区在碱性pH条件下经冷的非离子型去污剂处理后不溶解。这种去污剂不溶性膜组分可通过蔗糖梯度超速离心与主要的质膜组分分离²。随后，可通过甲醇/氯仿沉淀法从蔗糖梯度的低密度条带中提取蛋白质。提取的蛋白质经胰蛋白酶消化、脱盐后，最终通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。我们针对富含甾醇微区的提取方案已优化，适用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）细胞培养物中纯净的去污剂不溶性膜组分的制备。

我们采用Arabidopsis thaliana悬浮细胞培养物的全代谢标记法，以K¹⁵NO₃作为唯一氮源，用于在特定生物学处理后进行定量比较蛋白质组学研究³。通过将标记与未标记的细胞培养物按等比例混合后共同进行蛋白质提取，可将样品制备步骤对最终定量结果的影响降至最低。此外，在提取过程中发生的材料损失会对对照组和处理组产生相同的影响，因此轻链与重链肽段的比例将保持恒定。在本方法中，标记或未标记的细胞培养物之一接受生物学处理，另一组则作为对照⁴。

引言

1972年，Jonathan Singer 和 Garth Nicolson 提出了流动镶嵌模型，这是一种细胞膜的结构模型，取代了20世纪60年代初普遍接受的蛋白质-脂质-蛋白质三明治模型。Singer 和 Nicolson 提出，生物膜可被视为一种二维液体，其中所有的脂质和蛋白质分子均可自由且容易地扩散⁵。自那时以来，质膜的结构模型及其组成知识变得更加复杂。特别是在质膜中，可以观察到诸如蛋白质复合物以及基于脂质/固醇的结构无序微区等结构。在人工模型膜^6,7中，固醇和鞘脂能够从其他脂质种类中发生侧向分离，形成具有不同物理特性的区域。细胞膜内的这种分离主要源于固醇与磷脂和鞘脂的高度饱和烃链之间的自缔合特性⁸。特别是，刚性的固醇环倾向于与更僵硬且更直的饱和脂质种类相互作用，这些相互作用迫使邻近的烃链采取更伸展的构象，从而增加膜的厚度和硬度。

富含固醇的膜微区的一个常见特征是，其在经非离子型去污剂（如 Triton X-100 或 Brij 35）处理后仍保持不溶性。这些组分曾被认为与膜微区完全相同，并根据其生化制备方法被称为去污剂抗性膜（detergent resistant membranes, DRM）²。然而，由于生化方法制备的 DRM 可能并不直接对应于活细胞内的任何特定膜区室，因此在 DRM 提取过程中使用非离子型去污剂的方法受到了一些质疑⁹。特别是，在此类制备....

方案

实验步骤

提取方案中常用的试剂和缓冲液：

1. JPL培养基用于 拟南芥 悬浮细胞培养
   • 3 μM H₃BO₃
   • 3 μM MnSO₄₄ x H₂O
   • 1.1 μM ZnSO₄₄ x 7 H₂O
   • 0.15 μM KJ
   • 0.03 μM Na₂MoO₄ x 2 H₂O
   • 3 nM CoCl₂ x 6 H₂O
   • 3 nM CuSO₄₄ x 5 H₂O
   • 0.9 mM CaCl₂ × 2 H₂O
   • 0.5 mM MgSO₄₄ x 7 H₂O
   • 0.5 μM FeSO₄ x 7 H₂O
   • 0.5 μM Na₂EDTA × 2 H₂O
   • 0.12 μM 盐酸硫....

结果

利用本方案中采用代谢标记的Arabidopsis细胞培养物，可从植物组织中分离质膜（步骤2，图2和图4），并进一步在质膜中富集去垢剂抗性膜组分（步骤3，图3和图5）。随后，本方案可从这些去垢剂抗性膜组分中提取蛋白质（步骤4），并对蛋白质进行消化以进行比较蛋白质组学分析（步骤5）。最后，磷酸化肽段的可选富集步骤（步骤8）在研究细胞信号转导过程时尤为有意义。最终步骤为对来自标记与未标记细胞培养物的膜组分中蛋白质丰度比值进行定量数据分析（步骤9，图6）。

两相系统混合（步骤2）并随后离心后的典型结果是形成清晰的有色上相和绿色的下相（图2）。质膜囊泡主要分布于上层聚乙二醇（PEG）相，而来自绿色叶绿体及其他内部膜结构的膜囊泡则进入下层葡聚糖相。如果未能观察到颜色分离，则说明步骤2操作不当，导致质膜被大量内膜成分污染。通过蛋白质组学分析两相系统中质膜组分的小量等分试样以及下相中的蛋白质，可验证质膜蛋白的富集情况。下相含有细胞的内膜系统。例如.......

讨论

本文所述方案包含多个步骤，所有步骤对于获得纯净且具有代表性的植物质膜分馏（分为去垢剂抗性膜和去垢剂可溶性组分）均至关重要。因此，必须严格按照说明执行每一步骤。

使用非离子型去污剂处理质膜组分（步骤 3.2）对膜微区分离的质量影响最大。为了在不同制备样品之间获得可重复的结果，并能够比较同一实验中的不同样品，精确测定质膜中的蛋白质浓度至关重要，并且必须始终按照相同的蛋白质含量比例加入去污剂，同时确保最终浓度一致。实际操作中意味着，有时需要对蛋白质浓度较高的样品进行稀释，或使用不同浓度的 Triton X-100 储存液。

在生物化学研究中，近期研究人员倾向于采用无去垢剂的方法来分离膜微区^28-30。这些方法通过极细针头进行剪切，以机械方式破坏质膜，类似于法国压榨细胞装置的原理。这些方法已成功应用于富含膜微区的哺乳动物细胞培养物，但尚未见报道将其应用于具有细胞壁的生物体（如酵母、植物细胞）。结合定量蛋白质组学与甾醇干扰试剂（如甲基-β-环糊精）的研究表明，从植物质膜制备的DRM组分确实含有作为膜微区标志物的蛋白.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
除特别注明外，所有化学品均购自 Sigma-Aldrich
氨水（25% 储备液）	WAKO	010-03166
TiO2 10 μm	GL-Science	5020-75010
Empore C18 萃取盘	Varian	12145004
聚乙二醇（PEG 3350）	Sigma	88276
葡聚糖 T500	Roth	9219.2
胰蛋白酶	Promega	V5113
蛋白酶抑制剂混合物（PIC）	Sigma	P9599
K15NO3	Cambridge Isotope Laboratories	NLM-765-PK
仪器
Optima L-80 XP 超速离心机	Beckman
酶标仪	BioTek
EASY-nLC II 纳升液相色谱仪	Thermo Scientific
LTQ-Orbitrap 质谱仪	Thermo Scientific
5810R 离心机	Eppendorf
5417R 离心机	Eppendorf
恒温混匀仪	Eppendorf
Speed Vac RVC 2-25 真空浓缩仪	Christ
Unimax 2010 摇床	Heidolph