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方法文章

一种有效的手工去骨方法以制备保持解剖结构完整的小鼠鼻组织

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⸱

DOI：

10.3791/50538

⸱

2013年8月10日

 ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

哺乳动物的鼻子是一个具有复杂内部结构的多功能器官。鼻腔内衬有多种上皮组织，如嗅觉上皮、呼吸上皮和鳞状上皮，它们在解剖位置、形态结构和功能上存在显著差异。在成年小鼠中，鼻子被多种颅骨覆盖，限制了对内部结构（尤其是后部结构，如主嗅觉上皮（MOE））的实验操作。本文介绍一种有效的方法，可获取几乎完整且结构保持完整的鼻组织，同时保留其解剖学组织架构。在解剖显微镜下使用手术器械，我们依次去除包围鼻组织的颅骨。该方法适用于经多聚甲醛固定的以及新鲜剥离皮肤的小鼠头部。整个去骨过程约需20–30分钟，显著短于传统化学脱钙方法所需的实验时间。此外，我们提供了一种简便的方法，用于清除鼻甲之间滞留的气泡，这对于从鼻组织样本中获得完整、薄层的水平切面、冠状切面或矢状切面至关重要。采用本方法制备的鼻组织可用于整个上皮组织的全装片观察，以及形态学、免疫细胞化学、RNA分析 原位 杂交和生理学研究，特别是在需要进行区域特异性检测和比较的研究中。

引言

哺乳动物的鼻腔包含多种类型的组织和器官，具有不同的功能。鼻腔构成上呼吸道的入口部分，使空气能够进出肺部。吸入的空气经过鼻腔时，会经历温度和湿度调节1，同时通过清洁或过滤作用去除刺激性及有毒物质以及感染性微生物2。这些功能均由鼻腔上皮及上皮下组织（包括腺体和血管）完成，对于保护下呼吸道和肺部至关重要。除了在呼吸和上皮防御中的作用外，鼻腔组织还包含嗅觉系统和三叉神经系统的一部分外周感觉装置，可检测流经空气中的多种化学物质。根据被激活的系统不同，鼻腔对化学物质的感觉可引发嗅觉、刺激感或疼痛感3,4。

外周嗅觉系统结构复杂，由鼻腔内多个在解剖上相互分离的嗅觉感受器官组成。其中，主嗅上皮（MOE）是最大的部分，在啮齿类动物中约占鼻上皮总面积的45–52%5，位于鼻腔后部区域。在前腹侧区域，有一对管状结构，称为副嗅球器6，分别位于鼻中隔两侧。另外两组较小的嗅觉感觉神经元群，分别为马泽拉氏鼻中隔器官7,8和格吕内贝格神经节9，分别位于鼻中隔腹侧和鼻腔背侧入口区域。这些外周器官含有神经上皮组织，在形态结构、细胞标志物表达及生理功能方面具有各自独特的特征。它们共同作用，能够以极高的灵敏度检测成千上万种气味分子10–12。

除了嗅觉感受器官外，鼻腔还包含其他感觉系统。已知肽能三叉神经纤维存在于鼻上皮中，尤其是呼吸上皮13,14。其中部分纤维能够检测刺激性及有毒化学物质，并引发咳嗽和打喷嚏等保护性反射4,15。一些具有刺激性的气味物质和苦味化合物还可由 recently discovered 的一类孤立化学感受细胞（SCCs）检测，这些细胞中的许多由三叉神经纤维支配16-19。这些 SCCs 在鼻腔入口区域和犁鼻器入口导管中密度较高，提示其可能也具有保护功能16-18。因此，鼻上皮在功能、形态和细胞组成方面可因其解剖位置的不同而存在显著差异。

即使在单一且特化的上皮组织内，也存在区域差异。主嗅上皮（MOE）便是这样一个例子。MOE衬覆于多种复杂的卷曲结构——鼻甲上。由于这些结构的存在，MOE的不同区域经历不同的气流速度，因而空气中的气味分子在这些区域的扩散速率和清除速率也各不相同20。此外，已知表达特定气味受体的嗅觉感觉神经元（OSNs）位于MOE的四个环形区域之一21,22。然而，这种位置差异如何影响OSN对气味分子的反应，目前仍知之甚少。另外，某些OSN群体表现出区域偏好性。表达鸟苷酸环化酶-D（GC-D）的OSNs呈区带状分布，更倾向于分布于外侧鼻甲的盲端区域23,24。最近，我们发现了一类表达瞬时受体电位通道M5（trpM5）的经典OSN亚群，其优先定位于MOE的外侧和腹侧区域25。这些结果表明，MOE并非均一结构。然而，这些区域差异如何影响嗅觉编码，目前尚不清楚。部分原因在于，现有方法难以获取解剖结构完整且组织结构保持完好的鼻腔上皮，从而限制了对MOE及鼻腔的系统性生理学研究。

鼻上皮主要被颅骨的前部骨骼所包围，包括鼻骨、上颌骨、腭骨、颧骨和筛骨。在成年小鼠及其他啮齿类动物模型中，这些骨骼坚硬，难以在不损伤邻近的鼻组织（尤其是 delicate 的鼻甲）的情况下将其去除。通常采用基于化学试剂的脱钙方法来软化骨骼，以便对鼻组织进行冷冻切片，用于形态学、免疫组织化学以及原位杂交研究；然而，脱钙过程的持续时间取决于动物的年龄，可能需要过夜至长达7天24,26-28。该方法还存在局限性，因为它要求组织必须经过固定剂保存。此外，化学脱钙过程可能较为剧烈，会影响某些敏感抗体的免疫标记效果29,30。对于生理学研究，则需要活体组织，因此这类实验通常使用新生动物的嗅觉感觉神经元（OSNs）或嗅觉上皮（MOE）切片，因为新生动物的颅骨较薄且柔软17,31,32。生理学研究也可采用将头部切开制备整体装片的方法25,33,34，但通常仅鼻腔内侧表面易于接触，限制了对其他区域的生理记录。

本文介绍一种有效的手工去骨方法，用于制备保持原有解剖结构和形态完整性的鼻组织。我们在解剖显微镜下依次去除前颅的主要骨骼，以暴露几乎完整的鼻上皮，同时保留纤细的鼻甲骨，除非小鼠年龄较大且需要进行冷冻切片。我们还进一步改进该方法，以保留鼻组织与嗅球以及其余脑组织之间的连接，从而便于同时研究外周和中枢神经环路。本方法可用于制备经多聚甲醛固定的以及新鲜的活体鼻组织。因此，该方法有望促进对呼吸、嗅觉以及鼻部损伤与疾病进行形态学、免疫组织化学和生理学研究。

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方案

1. 小鼠鼻部制备

本研究使用成年C57BL/6背景小鼠。所有动物护理和操作程序均经马里兰大学巴尔的摩分校动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

1.1 从多聚甲醛固定的 小鼠 中获取鼻部

颅骨解剖图；标注骨骼部位，额面和侧面视图；用于教学。
图1. 小鼠颅骨的骨骼。 A： 颅骨的背侧视图。B： 去除下颌骨后的颅骨腹侧视图。颅骨样本来自一只40日龄的小鼠。不同骨骼以不同颜色标示，以便更清晰地观察。 点击此处查看高清大图。

  1. 按照林的方案对小鼠进行经心脏灌注以实现个体固定， 等, (2008)16小鼠经三溴乙醇（Avertin）深度麻醉后，简要操作如下： 250 μg/g 体重），经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，30–50 mL），随后灌注含3%多聚甲醛、19 mM盐酸赖氨酸和0.23%偏高碘酸钠的磷酸盐缓冲固定液（约35–50 mL）。也可参照JoVE文章中关于动物灌注的步骤进行操作。 35.
  2. 使用剪刀剪除下颌骨（或下颌），并去除头部的皮肤。
  3. 将整个头部与身体其余部分分离。
  4. 去除腭部，并清理并去除颅骨表面残留的结缔组织和肌肉，以获得如图所示的标本 图1A 和 1B.
  5. 在解剖显微镜下，移除覆盖脑组织和嗅球的颅骨，修剪掉多余的组织和骨骼。注意，在保留脑组织与鼻部相连的扩展组织制备过程中，仅去除颅骨。对于免疫组织化学实验，组织需在1.5小时内进行后固定，并转移至含25%蔗糖的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜。在整个解剖过程中，应通过多次将鼻组织浸入缓冲蔗糖溶液中以保持其湿润。

1.2 从新近安乐死的小鼠获取鼻部组织

  1. 将单只小鼠转移至清洁笼中，暴露于CO2气体中，并在最后一次呼吸后5分钟进行颈椎脱位。为减少鼻组织中的血液，使用剪刀打开胸腔并剪开心脏，使血液流出。
  2. 重复步骤1.1.2至1.1.5，但省略25%蔗糖的后固定和 cryoprotection 步骤。标本应保持湿润，并用含有以下成分（单位为 mM）的Tyrode’s生理盐水维持：140 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、1 CaCl2、10 Na丙酮酸盐、10 D-葡萄糖和10 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液（HEPES，调节至pH 7.4）。或者，可将一片Kimwipes纸折叠后用Tyrode’s溶液浸湿，置于标本下方；在解剖过程中，可偶尔将标本浸入Tyrode's溶液中，或滴加溶液至组织上，以保持其湿润，从而维持细胞和组织的活性。

2. 切牙、前部犁骨和上颌骨的去除

  1. 从腹侧视角开始。找到犁骨，并使用咬骨钳或带齿镊子沿其长度方向折断犁骨，以去除该骨最腹侧的部分。
  2. 使用锯齿镊子，轻轻将断裂的犁骨碎片从犁鼻器（VNO）上剥离并移除。注意：对于年龄小于一个月的小鼠，或仅关注主嗅上皮（MOE）的情况，可省略上述两个步骤。
  3. 用镊子牢固夹住头部。使用咬骨钳折断两侧门齿的前部以及两门齿之间前上颌骨与犁骨连接的区域。
  4. 在颧弓前方紧邻区域，沿至背侧颧骨板水平，折断右侧上颌骨的腹侧部分。
  5. 将鼻部翻转至背侧视角。使用咬骨钳在背侧颧骨板前方折断右侧上颌骨。此时，颧骨板前方的整个右侧上颌骨应已松动。用精细镊子轻轻分离上颌骨下方残留的鼻部组织，然后轻柔地将骨碎片提起并移除。
  6. 重复步骤 2.4 和 2.5，松解左侧门齿及左侧前上颌骨，在鼻骨已被移除后将其一并去除。

3. 鼻骨和背侧颧骨板的去除

  1. 使用锯齿镊或咬骨钳去除鼻骨后方的额骨残余部分。去除该骨片后，可用镊子夹住鼻骨的尾侧部分。
  2. 使用咬骨钳折断与颧骨板相连的颧弓前部。
  3. 用精细镊子夹住颧骨板背侧端的外侧边缘，轻轻翻转并移除该骨片。若骨片未松动，可使用咬骨钳轻轻夹持以松解，便于取出。
  4. 使用精细镊子或剃刀刀片松解左右鼻骨之间的中线缝合处。
  5. 用锯齿镊夹住右侧鼻骨的尾侧末端，轻轻左右移动以使其与下方组织分离。沿鼻骨尾侧三分之一处移动镊子，有助于左右摆动骨片。随着鼻骨逐渐分离，从尾侧末端缓慢抬起骨片。
  6. 当鼻骨略微抬起时，将其向外侧倾斜，以暴露骨片外侧突出的部分，该区域覆盖有薄层呼吸上皮组织。使用精细镊子轻轻将该组织从鼻骨上分离。继续抬起鼻骨，当骨片完全与下方组织分离后，使用剪刀在鼻骨的头侧端将其剪断。
  7. 重复步骤 3.1、3.5 和 3.6 以移除左侧鼻骨。
  8. 重复步骤 3.2 和 3.3 处理鼻部左侧。

4. 侧方颧骨板切除

  1. 逐侧移除颧骨板。可先移除任意一侧的颧骨板。
  2. 从腹侧观察，于颧弓下方折断上颌骨，直至断裂线延伸至颧弓。
  3. 从背侧观察，用精细镊子轻轻夹住颧弓，向前外侧抬起。若颧骨板仍与任何组织相连，使用精细镊子小心切断组织与骨骼之间的连接。
  4. 对鼻部另一侧的颧骨板重复上述操作。

5. 眶骨去除

  1. 从腹侧视角，在鼻部臼齿之间的腭骨处将其折断。
  2. 使用咬骨钳折断鼻部两侧的3颗臼齿及上颌骨。
  3. 折断并移除鼻腔两侧鼻甲腹侧和后侧残留的任何较厚骨块。

6. 筛骨去除

  1. 折断筛骨中任何向后突出至鼻甲后方的部分。此操作是必要的，以避免在去除覆盖鼻甲的薄层筛骨时造成鼻甲组织的丢失。
  2. 对于鼻腔右侧，将精细镊子置于筛骨前缘，轻柔地去除该部分骨组织。若仍有骨组织残留，需重复此操作，直至所有覆盖鼻甲的薄骨完全清除。在大多数样本制备过程中，无需去除鼻甲骨。在老龄小鼠中，筛板会变得脆弱。若需对鼻腔组织进行冷冻切片，可使用精细镊子去除筛板的小块碎片，以减少骨组织可能造成的损伤。
  3. 对鼻腔左侧重复步骤 6.2）。
  4. 在切片前去除所有残留的骨碎片。注意：在年龄超过一年的动物中，鼻中隔骨的后背侧区域较厚且坚硬。可使用精细镊子去除该部分组织。将镊子尖端插入骨组织两侧，以分离鼻中隔骨的背侧部分与其衬覆的上皮组织。用一对镊子夹住骨组织并固定样本，再用另一对镊子将鼻中隔上部的骨性部分与下部的软骨部分分离，并轻柔地将其移除。

7. 冷冻切片前的鼻部组织准备

  1. 安装吸气式真空泵。
  2. 将鼻部置于包埋模具中，并将其浸入OCT包埋剂中。
  3. 使用真空装置去除鼻组织内部滞留的气泡。此过程最长需要5分钟。
  4. 去除气泡后，将组织调整至所需的方向。
  5. 使用干冰将模具中的OCT和组织冷冻。包埋后的组织可立即进行冷冻切片，或于-80 °C保存以备后续使用。

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结果

利用该方法，我们能够可靠地获得几乎完全完整的鼻腔组织。图2A展示了来自经多聚甲醛固定的头部样本的成年鼻腔标本图像。在此标本中，全部四种嗅觉下感觉器官，包括主嗅上皮（MOE）、鼻中隔器官、格吕内贝格神经节和犁鼻器（VNO），均保持完整。此外，呼吸上皮及上皮下组织（如腺体和血管）也得以保存。我们已在多项研究中成功应用该方法，用于分析各种特化感觉细胞群体的形态学、分布、神经支配以及细胞标志物表达16,17,36-38。

图2B 显示一个包含脑、嗅球和鼻部的标本。这种扩展制备方法在需要研究外周与中枢嗅觉系统之间神经连接的研究中尤为有用。我们在去除面部骨骼之前，先移除了包围脑部的颅骨骨片，从而制备了该标本。我们的扩展方法使研究人员能够在同一制备标本中对周围和中枢嗅觉系统同时开展实验。

所示鼻腔组织 图2 可用于整体观察以及组织切片的制备。 图 3A 显示穿过嗅觉上皮和呼吸区的水平...

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讨论

在此，我们展示了一种逐步分离小鼠鼻腔中完整嗅觉组织和呼吸组织的实验方法，通过依次去除周围骨骼而保留下方组织。我们证明，通过精细的去骨操作，即使是最脆弱的组织也能被完整保存。我们还介绍了该技术可能的改进方式，即将脑组织与鼻腔组织一并分离，以保留神经连接。这一新方法可实现单个样本中完整嗅觉与呼吸组织的联合分离，便于后续进行免疫组织化学、RNA 原位 杂交，以及生理实验。

去骨的优点

在我们的方法之前，通常使用脱钙剂来软化骨骼，以便进行组织切片和免疫组织化学染色。然而，根据骨骼的大小和动物的年龄，脱钙可能是一个耗时较长的过程，需要将组织在骨脱钙剂中孵育数小时甚至数天29,30。常用的脱钙剂还含有酸类，可能对组织产生影响，从而改变或阻碍免疫标记29,30。为应对这一问题，一些研究人员使用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液来螯合骨骼中的钙离子24,26-28。这种脱钙方法同样需要数天时间。而本文所示的解剖操作可在约20-30分钟内完成，且无需使用任何可能影响组织染色...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了针对林卫红的科研资助（美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所资助编号009269、012831，以及美国复苏与再投资法案行政补充资助）。我们特别感谢马里兰大学巴尔的摩县分校的蒂姆·福特先生在视频拍摄和后期处理方面的技术支持。同时，我们还要感谢马里兰大学巴尔的摩县分校的达芙妮·布卢姆伯格博士、谢里·佩蒂女士以及奥林巴斯美国公司的尼古拉斯·麦科勒姆先生在视频拍摄设备方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
解剖
咬骨钳，1.0 mm 颚宽World Precision Instruments (WPI)501333
精细镊子，Dumont 3WPI503235
精细镊子，Dumont 55WPI14099
精细镊子，Dumont AAFine Science Tools (FST)11210-20
标本镊，带齿VWR82027-440
手术剪WPI501753
虹膜剪，直型MiltexV95-304
解剖显微镜OlympusSZ40
[header]
组织包埋
最佳切割温度（OCT）包埋剂Sakura Finetek4583
塑料包埋模具VWR15160-215
吸引器真空泵Fisher Scientific09-960-2
[header]
切片染色
中性红ACROS OrganicCAS 553-24-2细胞核染色

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