哺乳动物的鼻子是一个具有复杂内部结构的多功能器官。鼻腔内衬有多种上皮组织，如嗅觉上皮、呼吸上皮和鳞状上皮，它们在解剖位置、形态结构和功能上存在显著差异。在成年小鼠中，鼻子被多种颅骨覆盖，限制了对内部结构（尤其是后部结构，如主嗅觉上皮（MOE））的实验操作。本文介绍一种有效的方法，可获取几乎完整且结构保持完整的鼻组织，同时保留其解剖学组织架构。在解剖显微镜下使用手术器械，我们依次去除包围鼻组织的颅骨。该方法适用于经多聚甲醛固定的以及新鲜剥离皮肤的小鼠头部。整个去骨过程约需20–30分钟，显著短于传统化学脱钙方法所需的实验时间。此外，我们提供了一种简便的方法，用于清除鼻甲之间滞留的气泡，这对于从鼻组织样本中获得完整、薄层的水平切面、冠状切面或矢状切面至关重要。采用本方法制备的鼻组织可用于整个上皮组织的全装片观察，以及形态学、免疫细胞化学、RNA分析 原位 杂交和生理学研究，特别是在需要进行区域特异性检测和比较的研究中。
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方法文章
一种有效的手工去骨方法以制备保持解剖结构完整的小鼠鼻组织
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
引言
哺乳动物的鼻腔包含多种类型的组织和器官，具有不同的功能。鼻腔构成上呼吸道的入口部分，使空气能够进出肺部。吸入的空气经过鼻腔时，会经历温度和湿度调节1，同时通过清洁或过滤作用去除刺激性及有毒物质以及感染性微生物2。这些功能均由鼻腔上皮及上皮下组织（包括腺体和血管）完成，对于保护下呼吸道和肺部至关重要。除了在呼吸和上皮防御中的作用外，鼻腔组织还包含嗅觉系统和三叉神经系统的一部分外周感觉装置，可检测流经空气中的多种化学物质。根据被激活的系统不同，鼻腔对化学物质的感觉可引发嗅觉、刺激感或疼痛感3,4。
外周嗅觉系统结构复杂，由鼻腔内多个在解剖上相互分离的嗅觉感受器官组成。其中，主嗅上皮（MOE）是最大的部分，在啮齿类动物中约占鼻上皮总面积的45–52%5，位于鼻腔后部区域。在前腹侧区域，有一对管状结构，称为副嗅球器6，分别位于鼻中隔两侧。另外两组较小的嗅觉感觉神经元群，分别为马泽拉氏鼻中隔器官7,8和格吕内贝格神经节9，分别位于鼻中隔腹侧和鼻腔背侧入口区域。这些外周器官含有神经上皮组织，在形态结构、细胞标志物表达及生理功能方面具有各自独特的特征。它们共同作用，能够以极高的灵敏度检测成千上万种气味分子10–12。
除了嗅觉感受器官外，鼻腔还包含其他感觉系统。....
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方案
1. 小鼠鼻部制备
本研究使用成年C57BL/6背景小鼠。所有动物护理和操作程序均经马里兰大学巴尔的摩分校动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1.1 从多聚甲醛固定的 小鼠 中获取鼻部
图1. 小鼠颅骨的骨骼。 A： 颅骨的背侧视图。B： 去除下颌骨后的颅骨腹侧视图。颅骨样本来自一只40日龄的小鼠。不同骨骼以不同颜色标示，以便更清晰地观察。 点击此处查看高清大图。
- 按照林的方案对小鼠进....
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结果
利用该方法，我们能够可靠地获得几乎完全完整的鼻腔组织。图2A展示了来自经多聚甲醛固定的头部样本的成年鼻腔标本图像。在此标本中，全部四种嗅觉下感觉器官，包括主嗅上皮（MOE）、鼻中隔器官、格吕内贝格神经节和犁鼻器（VNO），均保持完整。此外，呼吸上皮及上皮下组织（如腺体和血管）也得以保存。我们已在多项研究中成功应用该方法，用于分析各种特化感觉细胞群体的形态学、分布、神经支配以及细胞标志物表达16,17,36-38。
图2B 显示一个包含脑、嗅球和鼻部的标本。这种扩展制备方法在需要研究外周与中枢嗅觉系统之间神经连接的研究中尤为有用。我们在去除面部骨骼之前，先移除了包围脑部的颅骨骨片，从而制备了该标本。我们的扩展方法使研究人员能够在同一制备标本中对周围和中枢嗅觉系统同时开展实验。
所示鼻腔组织 图2 可用于整体观察以及组织切片的制备。 图 3A 显示穿过嗅觉上皮和呼吸区的水平.......
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讨论
在此，我们展示了一种逐步分离小鼠鼻腔中完整嗅觉组织和呼吸组织的实验方法，通过依次去除周围骨骼而保留下方组织。我们证明，通过精细的去骨操作，即使是最脆弱的组织也能被完整保存。我们还介绍了该技术可能的改进方式，即将脑组织与鼻腔组织一并分离，以保留神经连接。这一新方法可实现单个样本中完整嗅觉与呼吸组织的联合分离，便于后续进行免疫组织化学、RNA 原位 杂交，以及生理实验。
去骨的优点
在我们的方法之前，通常使用脱钙剂来软化骨骼，以便进行组织切片和免疫组织化学染色。然而，根据骨骼的大小和动物的年龄，脱钙可能是一个耗时较长的过程，需要将组织在骨脱钙剂中孵育数小时甚至数天29,30。常用的脱钙剂还含有酸类，可能对组织产生影响，从而改变或阻碍免疫标记29,30。为应对这一问题，一些研究人员使用乙二胺四乙酸（EDTA）溶液来螯合骨骼中的钙离子24,26-28。这种脱钙方法同样需要数天时间。而本文所示的解剖操作可在约20-30分钟内完成，且无需使用任何可能影响组织染色.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究得到了针对林卫红的科研资助（美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所资助编号009269、012831，以及美国复苏与再投资法案行政补充资助）。我们特别感谢马里兰大学巴尔的摩县分校的蒂姆·福特先生在视频拍摄和后期处理方面的技术支持。同时，我们还要感谢马里兰大学巴尔的摩县分校的达芙妮·布卢姆伯格博士、谢里·佩蒂女士以及奥林巴斯美国公司的尼古拉斯·麦科勒姆先生在视频拍摄设备方面提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 解剖 | |||
| 咬骨钳，1.0 mm 颚宽 | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| 精细镊子，Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| 精细镊子，Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| 精细镊子，Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| 标本镊，带齿 | VWR | 82027-440 | |
| 手术剪 | WPI | 501753 | |
| 虹膜剪，直型 | Miltex | V95-304 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| 组织包埋 | |||
| 最佳切割温度（OCT）包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | |
| 塑料包埋模具 | VWR | 15160-215 | |
| 吸引器真空泵 | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| 切片染色 | |||
| 中性红 | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | 细胞核染色 |
参考文献
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, Suppl 57. 26-30 (1999).
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重印与许可
