测量靶向肿瘤的 S. Typhimurium 细菌的生长与基因表达动态

摘要

这些实验的目的是获取减毒伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）在肿瘤内生长时的定量时间序列数据，以研究其菌落生长和基因表达动态。本视频涵盖了肿瘤细胞的制备与移植、细菌的制备与注射、活体动物生物发光成像、肿瘤组织切除以及细菌菌落计数。

摘要

这些实验的目的是获取减毒伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）在肿瘤内生长过程中菌落生长和基因表达动态的定量时间序列数据。

通过皮下注射人卵巢癌细胞系OVCAR-8（NCI DCTD肿瘤库，美国马里兰州弗雷德里克），我们在小鼠体内建立了移植瘤模型。

我们将减毒的鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）菌株（ELH430:SL1344 phoPQ- ¹）转化，导入组成型表达的荧光素酶（luxCDABE）质粒，以实现可视化²。这些菌株可特异性定植于肿瘤组织，同时对小鼠基本保持无致病性¹。

肿瘤生长至可测量大小后，通过尾静脉以不同剂量静脉注射细菌。体内成像系统（IVIS）用于在60小时时间内实时监测肿瘤局部的细菌基因表达。在每个时间点，切除肿瘤组织，将其匀浆后接种培养，以定量细菌菌落数量，并与基因表达数据进行关联分析。

综合这些数据可定量评估细菌在肿瘤内生长及基因表达的 in vivo 动态。

引言

合成生物学在过去十年中迅速发展，现已具备解决能源与健康领域重要问题的潜力。然而，由于安全性的担忧以及缺乏临床应用设计标准，其在临床领域的拓展受到限制。 体内 基因回路。要加速具有高影响力医学应用的发展，需要采用能够直接与医疗基础设施对接的方法、在受控实验室环境之外仍能发挥作用的基因回路，以及安全且经临床认可的微生物宿主。

多种菌株因能够优先在肿瘤中生长而被研究用于癌症治疗。这些菌株包括 C. novyi，E. coli，V. cholorae，B. longum，以及 S. typhimurium^3-8. S. typhimurium 在多项人体临床试验中表现出安全性和耐受性，因此引起了特别关注^9-12这些细菌最初被发现可通过刺激宿主免疫系统以及消耗癌细胞代谢所需的营养物质来产生抗肿瘤效应。随后通过基因改造使其能够生产治疗性载荷。尽管这些研究代表了利用细菌进行肿瘤治疗的重要进展，但大多数现有研究依赖于高水平表达，通常导致高剂量递送、脱靶效应以及宿主抗性的产生。^13-16.

如今，合成生物学可能通过利用计算机设计的基因回路来实现可编程的货物生产，这些基因回路能够执行高级的感知与递送功能^17-20。这些回路可被设计为递送系统，能够感知肿瘤特异性刺激，并根据需要自我调控货物的生成。然而，迄今为止，在活体（in vivo）条件下研究这些回路功能仍具有挑战性。

由于质粒是合成回路的常用框架，本文介绍了一种用于表征基于质粒的基因表达动态的方法 体内 使用小鼠模型。这些方法利用延时生物发光成像和生物分布的定量测量。结合使用，这些方法为研究基于质粒的网络提供了框架 体内 用于临床应用。

方案

1. 细胞准备

1. 使用标准细胞培养技术传代细胞系。本实验中使用了 OVCAR-8 细胞（NCI DCTD 肿瘤储存库，Frederick，MD）。将细胞培养至目标融合度为 80 - 100%。
2. 用 5 ml 胰蛋白酶孵育细胞 5 分钟，然后加入 5 ml RPMI 培养基 + FBS 以灭活胰蛋白酶。
3. 在血细胞计数板上收集并计数细胞。将细胞重悬于无酚红的 DMEM 培养基中，目标浓度为 5 × 10⁷ 个细胞/ml，或每瓶约 200 μl。
4. 加入 15% 低生长因子 Matrigel（BD Biosciences），并将细胞悬液置于冰上直至植入。

2. 肿瘤移植

1. 使用 3% 异氟烷麻醉 4 周龄雌性 Ncr/Nu 小鼠，等待约 5 分钟以确保进入深度麻醉状态。麻醉期间在眼睛上涂抹兽用眼膏，防止角膜干燥。
2. 将细胞悬液（每瘤 100 μl）吸入 1 ml 注射器中，并安装 27½ 号针头。
3. 在两侧后外侧 flank 区域分别进行注射：用镊子轻轻提起皮肤形成帐篷状，将细胞注入皮下基底部。注意不要刺入过深，以免引起出血。注射完毕后用镊子轻轻拔出注射器，避免液体飞溅。
4. 每日监测肿瘤生长情况，持续 10 至 20 天，直至肿瘤直径达到 2 至 4 mm。

3. 细菌制备

1. 从-80°C冻存菌种或冷藏平板中接种3 ml含氨苄青霉素的LB培养基，开始过夜培养细菌。本实验中使用的是S. typhimurium菌株ELH430（SL1344 PhoPQ- aroA-）。
2. 次日早晨，将过夜培养物按1:100比例稀释至过滤后的LB培养基中，培养至OD600为0.4–0.6。
3. 离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，最后重悬于PBS中，调整OD600至0.1（约1 × 10⁷ 个细胞/ml）。

4. 细菌注射

1. 麻醉动物，并将其侧卧放置，尾巴朝向你的惯用手。使用兽医用眼膏涂抹眼睛，以防止麻醉期间眼睛干涩。
2. 使用温水或加热灯扩张尾静脉。
3. 用1 ml注射器吸取细菌悬液（每只小鼠100 μl），并将针头尖端弯曲至略小于90度。
4. 将注射器针头对准尾静脉，以较浅的角度刺入（应无阻力感），然后注入细菌。观察到血液被推动的迹象表明注射成功。

5. 小鼠成像

1. 在诱导室中对动物进行麻醉，然后将每只小鼠放置在成像平台上。麻醉期间使用兽用眼膏保护眼睛，防止角膜干燥。保持精确的体位固定，以确保不同时间点之间定量结果的可比性。
2. 使用 IVIS Spectrum 成像系统（Caliper Life Sciences）对动物进行成像。若同时成像多只动物，需在动物之间放置遮光屏障，以避免交叉照明。应首先对动物进行腹侧成像，以确认细菌的定位情况。
3. 在整个实验过程中（36 小时），每 2 小时使用 IVIS 对动物进行一次背侧成像。针对选定的感兴趣区域（ROI）生成时间序列曲线。

6. 细菌生物分布的定量分析

1. 使用 CO₂ 处死动物，并将其仰卧放置在吸水垫上。
2. 转动动物以暴露两侧腹股沟皮下肿瘤。剪开周围皮肤组织，分离并取出肿瘤。用镊子夹住肿瘤，使用反向剪刀动作去除皮肤。当大部分皮肤已被分离后，用镊子将肿瘤完全取出。
3. 将器官放入预先称重的微量离心管中。由于这些管子的质量可能差异显著，为获得定量结果，预先称重至关重要。

7. 定量分析细菌的生物分布

1. 在每个时间点，切除肿瘤并称重。
2. 加入 500 μl PBS + 15% 甘油，使用组织捣碎器（Tissue-Tearor，BioSpec）进行匀浆。每处理一个样品之间，用乙醇冲洗匀浆器 3 次。
3. 进行系列稀释，并接种平板以进行细菌菌落计数。若需在单个平板上接种多个稀释度，可使用预先分隔的平板。

结果

使用本实验方案，我们能够获得有关 在体 肿瘤靶向细菌的生长与基因表达动态。整体工作流程总结如下 图1.

在第一阶段，我们注射细菌（绿色），并使用IVIS成像动物，以生物发光（蓝色）作为报告信号来检测基因表达。

然后，在第二阶段，我们切除肿瘤，将其匀浆并接种于培养基进行菌落计数，以确定肿瘤内生长的细菌数量。

使用IVIS可视化细菌菌株产生的生物发光（图2）。信号强度随注射剂量增加而增强，最低定植剂量约为5 × 10⁵（图2A）。在所有情况下，减毒细菌仅能特异性定植于肿瘤组织，或在小鼠体内无法生长。通过辐射通量单位对信号进行定量，以校正曝光时间的影响，通常当数值达到10^6或更高时，表明已实现细菌定植。

对于特定感染，信号在24-48小时内随时间逐渐增强（图2B<...

讨论

通过该实验流程，我们能够获得定植于肿瘤中的细菌在生长及基因表达动态方面的时程数据。这些测量通常可常规开展 体外 在批量培养或微流控装置中，它们的实施要困难得多 体内.

有多种方法可对这些实验方案进行修改。尽管我们使用了OVCAR-8细胞系来构建小鼠模型，但其他多种细胞系也可等效使用。例如，可使用经荧光素酶标记的细胞系，以实现肿瘤与细菌荧光素酶信号通道的三维共定位。此外，尽管我们采用了双侧后 flank 注射模型，但也可使用不同数量和位置的注射位点，以构建适用于研究不同现象的模型。例如，若肿瘤大小是一个重要变量，可制备细胞的系列稀释液并同时注射至不同位点，从而生成大小不一的肿瘤。最后，尽管我们使用了 S. typhimurium ELH430菌株，其他菌株 S. typhimurium 或其他细菌，例如 C. novyi，E. coli，V. cholorae，B. longum 可与这些方法等效使用，但注射用的细菌计数可能需要调整。

本...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	BD Biosciences	309602
3/10 cc 胰岛素注射器	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide 针头	BD Biosciences	301629
RPMI 1640 培养基（1X），液体，含 L-谷氨酰胺	Invitrogen	11875-119
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB 琼脂肉汤	Sigma Aldrich	L2897
LB 肉汤（Luria-Bertani 肉汤）	BD Biosciences	244610