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方法文章

无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

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DOI：

10.3791/50541

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2013年8月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

本文内容

摘要

微量热泳（MST）可广泛用于测定结合亲和力，而无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白。该方案包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白、裂解细胞，并在不同浓度配体存在下检测MST信号。

摘要

蛋白质相互作用的定量表征在几乎所有生命科学领域中都至关重要，尤其是在药物发现中。目前大多数KD测定方法都需要获得目标蛋白的纯化样品，而蛋白纯化过程可能耗时且成本高昂。我们开发了一种无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白即可通过微尺度热泳（MST）测定结合亲和力的实验方案。该方法包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白并进行细胞裂解。将该方法应用于瞬时表达于HEK293细胞中的STAT3-GFP蛋白，首次测定了这一被广泛研究的转录因子与不同序列寡核苷酸之间的亲和力。该实验方案操作简便，可广泛应用于研究蛋白质与小分子、多肽、DNA、RNA以及蛋白质之间的相互作用。

引言

分子间相互作用亲和力的定量表征在生物医学研究的许多领域中具有重要意义。结合解离常数（KD）不仅在药物发现中至关重要，也是表征任何生物系统中任意二元相互作用的重要参数。用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的生化方法，如免疫共沉淀和酵母双杂交筛选，无法提供这些相互作用紧密程度的信息，而亲和力决定了特定复合物在体内特定条件下是否真实存在。in vivo。在药物发现过程中，结合实验的建立是必要步骤之一，且常常是最耗时的环节。最常用的KD测定方法包括荧光偏振1、表面等离子共振（SPR）技术2、放射性配体结合3、等温滴定 calorimetry4、平衡透析（ED）5、超滤（UF）5和超速离心（UC）6。这些方法均需要大量纯化的靶蛋白。微尺度热泳（MST）是一种快速发展的技术，可检测分子在微观温度梯度中的定向移动。生物大分子水合层的任何变化都会导致其沿温度梯度移动的相对改变7。MST可用于测定结合亲和力，并已应用于研究配体与荧光标记蛋白的结合，或荧光配体与靶蛋白的结合8, 9。MST能够在溶液中直接测量相互作用，无需将分子固定于表面（即无固定化技术）。实际上，任何结合事件通常都会伴随MST信号的变化，尽管不同系统间信号变化幅度差异显著。为了通过MST检测分子运动，分子必须具有荧光性。这是该方法的主要限制，但也可转化为优势。若在任意表达系统中以GFP融合形式表达某蛋白，则该蛋白将成为唯一的荧光分子，因而无需从细胞裂解液或无细胞表达系统中分离即可直接进行研究。制备能够维持结合条件且干扰最小的细胞裂解液是主要挑战。本文中，我们描述了一种适用于多种可溶性蛋白和膜蛋白的细胞裂解液制备及MST实验方案。

STAT 蛋白是一类在细胞质中处于非活性状态的转录因子，可在细胞外信号刺激下通过酪氨酸磷酸化被激活，参与多种生物学过程，包括免疫、造血、炎症和发育10。在哺乳动物中，STAT 蛋白家族包括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B 和 STAT6。所有被激活的 STAT 蛋白均可结合相同的 DNA 序列，即所谓的 GAS 基序（IFN-γ 激活序列）。然而，不同 STAT 蛋白所产生的转录效应却存在显著差异11。尽管 STAT 蛋白参与多种病理过程，且已有超过 17,000 篇相关研究发表，但其与不同 DNA 序列结合的解离常数（KD）至今尚未被测定。目前仅对不同 STAT 蛋白与 GAS 基序变体之间的相对亲和力进行了表征11。蛋白表达与纯化方面的困难是研究 STAT 蛋白 DNA 结合选择性的主要障碍。尽管大多数研究集中于“激活态”STAT 蛋白（通常等同于酪氨酸磷酸化的转录因子），但非磷酸化 STAT 蛋白（U-STATs）在转录调控中的作用正日益受到关注12。然而，这些机制仍不清楚，此前尚不确定 U-STATs 是否能够直接结合 DNA，还是通过与其他转录因子相互作用而发挥作用。我们近期研究表明，U-STAT3 能够以更高的亲和力结合不同于 GAS 基序的 DNA 序列13。这一发现对深入理解该重要蛋白的生物学功能具有重要意义。我们采用微量热泳技术测定了 STAT3 与 GAS 序列及富含 AT 的寡核苷酸 S+100 的相对结合亲和力（图 4）。几乎相同的操作流程也被用于测定另一种 STAT3 配体——脂肽抑制剂的 KD 值14。实验中未检测到与作为阴性对照的相关转录因子 GFP-STAT1 发生结合，从而证实了该相互作用的选择性14。

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方案

1. 细胞裂解液的制备

本实验方案适用于表达任何GFP融合蛋白的贴壁细胞。所需细胞数量根据蛋白表达水平的不同，可从低至106到高达20 × 106个细胞不等。例如，通过使用1 ml裂解缓冲液处理在10个T75培养瓶中生长至约70%汇合度的HEK细胞，制备了过表达GFP-STAT3的细胞裂解液。然而，该裂解液需稀释150倍，才能为MST实验提供最佳的荧光强度。细胞裂解方案在很大程度上取决于目标蛋白的性质及其在细胞内的定位。如果由于蛋白不稳定而不宜使用去垢剂，则下文所述的超声处理可能是最佳选择。可在裂解缓冲液中添加不同的添加剂以防止蛋白发生修饰反应：EDTA可防止磷酸化，钒酸钠可抑制酪氨酸蛋白磷酸酶，氟化钠是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的抑制剂。

  1. 配制裂解缓冲液。对于易于提取的胞质蛋白，以下组分效果良好：25 mM Tris HCl，pH 8.0，以及100倍稀释的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich P2714，包含2 mM AEBSF、0.3 μM 抑肽酶、130 μM 亮抑蛋白酶肽、1 mM EDTA、14 μM E-64、1 μM 亮抑酶肽）。对于溶解度较低的蛋白，可选用含有蛋白酶抑制剂混合物和非变性去垢剂的商用RIPA缓冲液。将缓冲液置于冰上保存。
  2. 用预冷的PBS短暂洗涤细胞，每T75培养瓶使用10 ml缓冲液。将细胞置于冰上5分钟，或直至细胞开始从瓶壁脱落。必要时使用细胞刮刀刮下细胞以促进脱落。
  3. 将细胞重悬于10 ml预冷的PBS中，并转移至预冷的14 ml圆底离心管中。
  4. 在4 °C条件下，以400–600 ×g离心5分钟收集细胞沉淀。如需，可在此步骤合并多个培养瓶的细胞。
  5. 吸除PBS上清液，将细胞沉淀重悬于200 μl预冷裂解缓冲液中，并将悬液转移至预冷的1.5 ml Eppendorf管中。
  6. 将细胞保持在冰上以尽量减少局部过热。使用预冷的2–3 mm探头，在30%振幅下进行3次、每次10秒的超声处理以裂解细胞。探头应保持在液面以下，以减少起泡。若使用含去垢剂的缓冲液，则省略此步骤，改为在冰上孵育30分钟。
  7. 如有需要，使用5 M NaCl将裂解液调节至生理盐浓度（100 mM NaCl）。
  8. 在4 °C条件下，以约26,000 ×g离心10分钟，收集裂解产物。
  9. 确定裂解液的最佳稀释倍数（如下文第3节所述）以及一次滴定所需的裂解液体积（通常约为300 μl预稀释裂解液）。
  10. 将裂解液分装，并在适合待研究蛋白的温度下保存（大多数情况下为-80 °C）。

2. MST 缓冲液的选择与制备

  1. 由于蛋白质-配体相互作用依赖于缓冲液条件，因此MST缓冲液的组成应根据特定系统的性质进行选择。通常建议至少测试两种不同的缓冲液。
  2. 配制2种5倍浓度的MST缓冲液。我们在此两种缓冲液组成中获得了良好的实验效果：HEPES缓冲液（250 mM HEPES，pH 7.4；25 mM MgCl2；500 mM NaCl；0.25% NP-40）和Tris HCl缓冲液（250 mM Tris HCl，pH 7.4；750 mM NaCl；50 mM MgCl2；0.05% Tween-20）。在最终结合反应体系中加入BSA（5%）有助于防止蛋白质吸附到塑料管和玻璃毛细管上。还可添加NaN3（0.5 mM）以防止微生物生长。

3. 确定最佳裂解液稀释度

  1. 在 MST 仪器上选择波长 λ = 470 nm 的 LED 激发光源。
  2. 将细胞提取物用 MST 缓冲液稀释 2 倍和 10 倍后，装入毛细管中。
  3. 在 MST 仪器的控制软件上执行“寻找毛细管”操作。稀释裂解液中的最佳荧光范围为 400 至 1,500 荧光单位。

4. 确定最佳配体浓度范围

  1. 配体的最高浓度应至少比预期解离常数高20倍。
  2. 配体的最低浓度应低于荧光蛋白的摩尔浓度。

请参考 NanoTemper Technologies 的浓度查找工具以估算配体浓度范围。

5. 细胞裂解液和配体稀释液的制备

  1. 将一个装有适量（通常为10-16个）0.5 ml LoBind离心管的试管架置于冰上。用移液器向每根试管底部加入25 μl MST缓冲液。向第一根试管（#1，配体最高浓度）中加入25 μl配体储备溶液，并利用其余试管对配体进行连续两倍稀释。将装有配体样品的试管架保持在冰上。
  2. 在冰上缓慢解冻细胞裂解液。
  3. 用MST缓冲液稀释细胞裂解液，以在结合反应中提供适量的荧光标记靶蛋白。最终蛋白浓度应接近预期的KD值或更低，并应调整至在最终溶液中获得所需的荧光计数。为测定裂解液中GFP-STAT3的浓度，使用荧光素进行仪器校准。裂解液中GFP的摩尔浓度通过荧光素与EGFP的量子产率比值（分别为0.85和0.61）确定。15

6. 微尺度热泳结合研究

  1. 在MST仪器上选择波长λ = 470 nm的LED激发光源。
  2. 将0.5 ml LoBind离心管放置于配制了配体系列稀释样品的离心管对面的管架中。小心地将15 μl细胞裂解液加入每根离心管底部，避免接触管壁，以防样品损失。
  3. 向含有细胞裂解液的对应离心管#1中加入15 μl浓度最高的配体样品（#1）。充分混匀后更换移液器吸头。除最后一根不含配体的离心管外，对剩余各管重复此步骤。
  4. 向最后一根离心管中加入15 μl MST缓冲液，并充分混匀。
  5. 用离心管#1中的结合混合液填充第一根毛细管约2/3体积，倾斜毛细管使溶液移向中心位置，然后将毛细管放置于毛细管托盘的#1位置（最靠近托盘开口的位置）。对剩余毛细管重复此步骤。对于较长时间的实验，可用石蜡封住毛细管两端。
  6. 将托盘放入MST仪器中，并关闭仪器门。
  7. 执行“寻找毛细管”命令，使仪器确定毛细管的精确位置并测量样品的荧光强度。
  8. 根据荧光信号强度，调节LED功率（10–100%），使信号值处于400–1,500单位区间内。
  9. 点击“开始”按钮以进行热泳实验。可选择多个红外激光功率，以确定该特定系统的最佳温度梯度。对同一组毛细管重复2–3次实验以确保测量的可重复性。运行一组16根毛细管约需10–12分钟。

7. 微尺度热泳数据分析

  1. 打开分析软件。
  2. 加载项目文件夹。在弹出的信息运行查看器中，选择在特定红外激光功率下采集的热泳曲线。可以选择打开在不同条件下（如红外激光功率、LED功率、温度、浓度等）采集的所有热泳轨迹。 等等立即选择并通过开启或关闭曲线（点击实验名称）来选择任意曲线进行分析。
  3. 在“评估点”图表窗口中，选择热泳或含 T-jump 的热泳。确保蓝色和红色线条位置正确。为获得带标准偏差的平均数据点，请选择“使用平均值”，或选择“区分运行”以分别显示各次运行结果。
  4. 为绘制解离常数拟合曲线，选择“使用平均值”，输入并固定标记分子的浓度值（在拟合窗口菜单中勾选“浓度”选项），然后拟合曲线。KD 标准差值显示在单独的信息弹出窗口中。要使用Hill方法绘制拟合曲线，请选择“平均值”、Hill方法，然后拟合曲线。EC50 亲和力值及其标准偏差在本例中显示。K 的特征D 或当结合状态未达到饱和时，也可使用希尔“边界”（Hill "border"）。
  5. 将平均拟合数据保存为文本文件，并导入 Excel。
  6. 图 F标准 （归一化荧光），ΔF标准 （若比较不同实验，则为归一化荧光强度的差异），或作为未标记（滴定）分子浓度函数的结合分数（见下文公式）。

结合分数（形成复合物的分子所占比例）= (Therm(C) - 未结合态)/(结合态 - 未结合态)，其中 Therm(C) 表示在浓度 C 下测得的热泳信号，未结合态表示分子未形成复合物时的热泳信号，结合态表示分子完全结合状态下的热泳信号。

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结果

测定非磷酸化STAT3蛋白与寡核苷酸结合的亲和力。

使用表达 STAT3-GFP 的 HEK293 细胞作为荧光标记 STAT3 的来源，用于 DNA 结合实验。细胞裂解液使用 RIPA 缓冲液制备（20×106 个细胞/ml）。在结合研究中，将裂解液用 MST DNA 结合缓冲液稀释 150 倍，以在结合反应中提供最佳浓度的荧光蛋白（约 20 nM）。未转染的 HEK293 细胞用于评估背景荧光，结果表明即使在未稀释的裂解液中背景荧光也检测不到。然而，在其他表达系统中背景荧光可能更显著，因此必须进行监测。制备了包含 11 个结合混合物以及不含配体的裂解液样本的滴定系列。每个样本包含 15 μl 稀释后的细胞裂解液和 15 μl 不同浓度的寡核苷酸溶液。最终缓冲液组成为：25 mM HEPES，pH 7.2；50 mM NaCl；2.5 mM MgCl2；以及 0.025% NP-40。在 Monolith NT.115 仪器上使用标准处理毛细管进行测量，采用 50% 红外激光功率和波长 λ = 470 nm ...

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讨论

蛋白质表达与纯化是一个耗时且昂贵的步骤，然而目前大多数常用方法在测定相互作用的KD值时仍需依赖此步骤。微量热泳动技术（MST）的应用可避免蛋白质纯化，从而显著简化并加速对相互作用的定量表征。对于难以表达和纯化的蛋白质（如膜蛋白和转录因子），该技术尤其具有重要意义。

MST 的主要局限性和要求是能够表达与绿色荧光蛋白融合的蛋白质。然而，大多数与 GFP 融合的人源和鼠源蛋白质的表达载体均可商业获得。GFP 融合蛋白也广泛用于运输和降解研究，因此可与 MST 研究结合，实现“双重用途”。

除了无需蛋白质纯化、所有试剂使用极为经济以及对缓冲液成分的微小变化不敏感外，与传统的KD测定方法相比，微量热泳动（MST）还具有其他优势。与表面等离子共振（SPR）不同，基于MST的实验耗时不到2小时，可在更宽的范围内测定KD值，且不受表面固定化带来的假象影响。例如，尽管我们投入了大量资金购买纯化的STAT3蛋白，但仍无法通过SPR测定STAT3与寡核苷酸结合的KD

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。本出版物的内容不一定反映卫生与公共服务部的观点或政策，提及商品名、商业产品或组织并不意味着美国政府的认可。

致谢

本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）、国家癌症研究所癌症研究中心院内研究计划的支持；国家癌症研究所（NCI）与Calidris Therapeutics之间的合作研究协议；美国癌症协会资助项目IRG 97-152-17（授予O.T）；以及根据合同号HHSN26120080001E，来自国家癌症研究所、NIH的联邦资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RIPA 裂解缓冲液Millipore20-188其他厂商的缓冲液同样适用
蛋白酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 毛细管托盘NanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 标准处理毛细管NanoTemper Technologies GmbHK002
NT Control 软件NanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT Analysis 软件NanoTemper Technologies GmbH1.4.27
台式制冷离心机Eppendorf5417R其他可提供
Protein LoBind 0.5 ml 离心管Eppendorf22431064

参考文献

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