无需蛋白质纯化的微量热泳动结合亲和力测定方法

摘要

微量热泳（MST）可广泛用于测定结合亲和力，而无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白。该方案包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白、裂解细胞，并在不同浓度配体存在下检测MST信号。

摘要

蛋白质相互作用的定量表征在几乎所有生命科学领域中都至关重要，尤其是在药物发现中。目前大多数K_D测定方法都需要获得目标蛋白的纯化样品，而蛋白纯化过程可能耗时且成本高昂。我们开发了一种无需从细胞裂解液中纯化目标蛋白即可通过微尺度热泳（MST）测定结合亲和力的实验方案。该方法包括在非变性条件下过表达GFP融合蛋白并进行细胞裂解。将该方法应用于瞬时表达于HEK293细胞中的STAT3-GFP蛋白，首次测定了这一被广泛研究的转录因子与不同序列寡核苷酸之间的亲和力。该实验方案操作简便，可广泛应用于研究蛋白质与小分子、多肽、DNA、RNA以及蛋白质之间的相互作用。

引言

分子间相互作用亲和力的定量表征在生物医学研究的许多领域中具有重要意义。结合解离常数（K_D）不仅在药物发现中至关重要，也是表征任何生物系统中任意二元相互作用的重要参数。用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的生化方法，如免疫共沉淀和酵母双杂交筛选，无法提供这些相互作用紧密程度的信息，而亲和力决定了特定复合物在体内特定条件下是否真实存在。in vivo。在药物发现过程中，结合实验的建立是必要步骤之一，且常常是最耗时的环节。最常用的K_D测定方法包括荧光偏振¹、表面等离子共振（SPR）技术²、放射性配体结合³、等温滴定 calorimetry⁴、平衡透析（ED）⁵、超滤（UF）⁵和超速离心（UC）⁶。这些方法均需要大量纯化的靶蛋白。微尺度热泳（MST）是一种快速发展的技术，可检测分子在微观温度梯度中的定向移动。生物大分子水合层的任何变化都会导致其沿温度梯度移动的相对改变⁷。MST可用于测定结合亲和力，并已应用于研究配体与荧光标记蛋白的结合，或荧光配体与靶蛋白的结合^{8, 9}。MST能够在溶液中直接测量相互作用，无需将分子固定于表面（即无固定化技术）。实际上，任何结合事件通常都会伴随MST信号的变化，尽管不同系统间信号变化幅度差异显著。为了通过MST检测分子运动，分子必须具有荧光性。这是该方法的....

方案

1. 细胞裂解液的制备

本实验方案适用于表达任何GFP融合蛋白的贴壁细胞。所需细胞数量根据蛋白表达水平的不同，可从低至10⁶到高达20 × 10⁶个细胞不等。例如，通过使用1 ml裂解缓冲液处理在10个T75培养瓶中生长至约70%汇合度的HEK细胞，制备了过表达GFP-STAT3的细胞裂解液。然而，该裂解液需稀释150倍，才能为MST实验提供最佳的荧光强度。细胞裂解方案在很大程度上取决于目标蛋白的性质及其在细胞内的定位。如果由于蛋白不稳定而不宜使用去垢剂，则下文所述的超声处理可能是最佳选择。可在裂解缓冲液中添加不同的添加剂以防止蛋白发生修饰反应：EDTA可防止磷酸化，钒酸钠可抑制酪氨酸蛋白磷酸酶，氟化钠是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的抑制剂。

1. 配制裂解缓冲液。对于易于提取的胞质蛋白，以下组分效果良好：25 mM Tris HCl，pH 8.0，以及100倍稀释的蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich P2714，包含2 mM AEBSF、0.3 μM 抑肽酶、130 μM 亮抑蛋白酶肽、1 mM EDTA、14 μM E-64、1 μM 亮抑酶肽）。对于溶解度较低的蛋白，可选用含有蛋白酶抑制剂混合物和非变性去垢剂的商用RIPA缓冲液。将缓冲液置于冰上保存。
2. 用预冷的PBS短暂洗涤细胞，每T75培养瓶使用10 ml缓冲液。将细胞置于冰上5分钟，或直至细胞开始从瓶壁脱落。必要时使用细胞刮刀刮下....

结果

测定非磷酸化STAT3蛋白与寡核苷酸结合的亲和力。

使用表达 STAT3-GFP 的 HEK293 细胞作为荧光标记 STAT3 的来源，用于 DNA 结合实验。细胞裂解液使用 RIPA 缓冲液制备（20×10⁶ 个细胞/ml）。在结合研究中，将裂解液用 MST DNA 结合缓冲液稀释 150 倍，以在结合反应中提供最佳浓度的荧光蛋白（约 20 nM）。未转染的 HEK293 细胞用于评估背景荧光，结果表明即使在未稀释的裂解液中背景荧光也检测不到。然而，在其他表达系统中背景荧光可能更显著，因此必须进行监测。制备了包含 11 个结合混合物以及不含配体的裂解液样本的滴定系列。每个样本包含 15 μl 稀释后的细胞裂解液和 15 μl 不同浓度的寡核苷酸溶液。最终缓冲液组成为：25 mM HEPES，pH 7.2；50 mM NaCl；2.5 mM MgCl₂；以及 0.025% NP-40。在 Monolith NT.115 仪器上使用标准处理毛细管进行测量，采用 50% 红外激光功率和波长 λ = 470 nm .......

讨论

蛋白质表达与纯化是一个耗时且昂贵的步骤，然而目前大多数常用方法在测定相互作用的K_D值时仍需依赖此步骤。微量热泳动技术（MST）的应用可避免蛋白质纯化，从而显著简化并加速对相互作用的定量表征。对于难以表达和纯化的蛋白质（如膜蛋白和转录因子），该技术尤其具有重要意义。

MST 的主要局限性和要求是能够表达与绿色荧光蛋白融合的蛋白质。然而，大多数与 GFP 融合的人源和鼠源蛋白质的表达载体均可商业获得。GFP 融合蛋白也广泛用于运输和降解研究，因此可与 MST 研究结合，实现“双重用途”。

除了无需蛋白质纯化、所有试剂使用极为经济以及对缓冲液成分的微小变化不敏感外，与传统的K_D测定方法相比，微量热泳动（MST）还具有其他优势。与表面等离子共振（SPR）不同，基于MST的实验耗时不到2小时，可在更宽的范围内测定K_D值，且不受表面固定化带来的假象影响。例如，尽管我们投入了大量资金购买纯化的STAT3蛋白，但仍无法通过SPR测定STAT3与寡核苷酸结合的K_D

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RIPA 裂解缓冲液	Millipore	20-188	其他厂商的缓冲液同样适用
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 毛细管托盘	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 标准处理毛细管	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control 软件	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis 软件	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
台式制冷离心机	Eppendorf	5417R	其他可提供
Protein LoBind 0.5 ml 离心管	Eppendorf	22431064