我们描述了在麻醉后对海洋海兔Aplysia的神经系统进行解剖，分离神经元用于短期组织培养，并通过膜片钳技术记录单细胞离子电流。
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摘要
摘要
海洋腹足类软体动物Aplysia californica作为神经系统功能研究的模式生物，具有悠久的历史，尤其在学习与记忆研究中具有重要意义。此类研究通常采用两种制备方法：一种是在解剖程度最小的动物体内保留感觉神经元和运动神经元完整；另一种是技术上较为复杂的单个感觉神经元与运动神经元共培养体系。较少使用的是分离神经元制备方法，即将在短期内培养的名义上同质的小群神经元解离为单个细胞。这类分离细胞适用于利用膜片钳技术对离子电流进行生物物理表征，以及对这些电导进行靶向调控。本文描述了一种制备此类培养物的实验方案。该方案利用了脑侧神经节和口部神经节中易于识别的谷氨酸能感觉神经元，详细说明了这些神经元的解离过程，并介绍了在无血清条件下短期培养数天的最低限度维持方法。
引言
海洋后鳃类软体动物Aplysia数十年来一直是神经生物学研究中重要的模式生物。它最著名的是作为习惯化和经典条件反射的模型7, 8。2000年，埃里克·R·坎德尔（Eric R. Kandel）因在该模型中开展的学习与记忆研究，与阿尔维德·卡尔松（Arvid Carlsson）和保罗·格林加德（Paul Greengard）共同获得了诺贝尔生理学或医学奖10。利用离体神经标本进行的电生理记录研究，即从动物体内分离出神经系统部分结构，同时保留神经与肌肉的连接，有助于阐明Aplysia中单个神经元的功能。然而，要明确构成Aplysia学习行为的精确分子机制，通常采用另一种技术，即长期共培养单个感觉神经元与运动神经元——这些神经元分别来自不同的供体动物，并在培养皿中形成突触连接21。
我们及其他研究者1, 3, 6, 14, 15, 16已利用该模型中可识别神经元易于靶向以及其在长期实验中具有较强耐受性的特点，制备了分离的短期培养神经元簇，这些神经元在名义上具有同质性，我们采用膜片钳配置下的电压钳技术研究其离子电流。许多Aplysia神经元可耐受多次重复的膜片钳操作，从而允许进行持续时间较长的实验干预。该技术适用于腹神经节中的神经分泌性袋细胞以及本实验所描述的侧神经节和口神经节中的感觉神经元，但不适用于直径>60 μm 的大型神经元，例如腹神经节中的 L7 或 R2 神经元。我们的培养体系中不使用Aplysia血清，这与文献中报道的感觉神经元-运动神经元共培养体系不同。采用本方法获得的大多数神经元在培养最初 48 小时内无突起，有利于全细胞电压记录；随后在约 14 天内长出并延伸轴突及其他突起，最终因缺乏营养物质和/或生长因子而死亡。
该技术可从脑神经节和足神经节中经生理学明确的区域，获得每皿50至100个神经元的原代培养。本方案适用于需要在单只动物中进行大量实验重复的单细胞生理学研究。由于目标细胞在解剖结构上分处左右半神经节，该方法可产生配对的培养样本，从而支持需要配对处理组与对照组培养的研究。
该方案针对腹侧神经节的颊部S簇（BSC）神经元以及脑侧神经节的腹侧尾部（PVC）神经元。这些细胞大小适中，适合进行全细胞电压记录，并表现出显著的谷氨酸能反应。所讨论的方法适用于Aplysia神经系统中的大多数神经节。
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方案
1. 细胞制备
- 第1天，称量动物体重并进行麻醉。
- 称量一只30 g至1 kg的动物。将其麻醉于5-10倍动物体积的1:1海水：等渗MgCl₂·6H₂O溶液中。20，在有氧条件下（例如使用带有气石的电动水族箱气泵）振荡培养1小时。
- 准备解剖器械。
- 组装干净的解剖托盘，并配备不锈钢直针（如布料用针）。准备数个含有人工海水（ASW；参见 表1 和 3）及青霉素/链霉素（P/S）。
- 准备好低倍显微镜。备好清洁的解剖器械，例如齿状镊和精细手术镊，以及精细和大型手术剪。使用前用70%异丙醇喷洒器械，并使其晾干。
- 将动物置于解剖托盘上。
- 将动物腹面朝下置于解剖托盘中，用大头针固定体壁边缘和疣足边缘，避免固定尾部和头部，以暴露背侧表面及生殖沟
- 用缓慢流动的冷水冲洗背部表面。从挤压瓶中挤出少量70%异丙醇，沿生殖沟及头部上方轻轻冲洗。
- 进行初始切口。
- 使用低倍显微镜（参见 表2）并利用反射光观察生殖沟自前部壳缘起始的位置，用齿状镊子紧紧夹住该起始点左侧的一褶组织，同时用精细弯头剪刀在生殖沟右侧平坦光滑的体壁区域剪出一个浅孔，穿透整个体壁。
- 应观察到血淋巴从孔中流出，有时会带出腹神经节和胃。
- 扩大切口。
- 使用大剪刀将切口向前延伸至两触角之间，同时用下部刀片向上牵拉以避免划伤肠道。可观察到内脏器官从切口处溢出。
- 去除神经节。
- 重新放置载物台，并将显微镜重新对焦于头部区域。
- 使用洁净的镊子和精细剪刀，将环绕食道形成环状的头部神经节在一处切断，以整体移除侧足神经节和脑神经节。
- 去除附着在食管腹侧的颊神经节。
- 通过切断从该神经节发出的4条大神经连索，移除腹神经节。
- 分离目标神经节。
- 将头部神经节分离，每个目标神经节保留至少等于其直径长度的神经连索；这一步骤可延缓后续酶消化过程中目标细胞的过度消化。
- 将每个目标神经节用含青霉素/链霉素的人工海水（ASW + P/S）清洗两遍，每次换液时使用洁净的镊子转移。
- 若以PVC细胞为靶点，应将右侧脏神经节半节保留与右侧足神经节半节相连，同样将左侧脏神经节半节保留与左侧足神经节半节相连。
- 根据公认的研究规范，丢弃不需要的神经节及动物的其余部分。
- 酶消化神经节。
- 为每个神经节准备1 ml酶溶液，其中包含3.75 mg dispase、1 mg hyaluronidase和0.3 g collagenase type XI，溶于1 ml ASW + P/S中，置于15 ml聚丙烯圆锥管中。
- 将清洗后的神经节放入酶溶液中，并拧紧管盖。将试管平放在旋转摇床中（参见 表2以低速离心约13-5小时，过夜，温度约为23 °C（室温）。
- 准备培养皿。
- 在显微解剖前（第2天），于组织培养超净台中准备多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养皿。将约0.5 ml PDL溶液（0.2 mg/ml无菌水）加入35 mm培养皿中央，孵育约25分钟。
- 用无菌水将PDL冲洗3次，静置晾干，然后用紫外光对培养板进行灭菌。
- 第2天 分离神经元。
- 在聚-D-赖氨酸（PDL）包被并经紫外线灭菌的35 mm培养皿中央加入约0.5 ml ASW + P/S，使培养皿内形成一个被干燥表面包围的培养基小岛。此操作可在超净台外的实验台面上进行。每个源自半侧神经节的细胞簇应准备一个独立的培养皿。
- 准备好一个直径为100 mm的解剖皿，该解剖皿通过在5 mm深的解剖表面涂覆并固化Sylgard制成，并配备多种规格的精细解剖针，用于固定和探查（参见 表3用70%异丙醇冲洗此培养皿，然后用含青霉素/链霉素的人工海水（ASW + P/S）冲洗，最后用ASW + P/S充满。
- 准备消化后神经节的显微解剖。
- 将含有已消化的足-脑神经节和口神经节的酶溶液倒入解剖皿中。
- 将培养皿置于显微镜载物台上，在反射光下以黑色背景为衬底。
- 利用附着的结缔组织，将每侧胸足半侧神经节背侧朝上固定。组织质地较软，不能耐受牵拉。
- 显微解剖PVC神经元。
- 使用两对洁净的精细镊子，其中一对镊子夹住一根精细解剖针作为探针，从胸膜半侧神经节中分离PVC细胞。酶消化已去除或破坏了覆盖PVC细胞簇的结缔组织被膜，但细胞之间仍相互黏附。
- 使用探针将这些细胞从足-脑侧连索上分离18然后让细胞团沉降至解剖皿底部。
- 将神经元转移至培养皿中。
- 将细胞簇转移到已准备好的35 mm培养皿中：用经轻微火焰抛光的一次性玻璃巴斯德吸管轻轻吸取细胞簇，然后缓慢将其释放到培养皿中的培养基小岛内，注意避免将气泡引入吸管。重复上述操作，分离另一侧半侧神经节的PVC细胞簇，并将其放入另一个独立的培养皿中。
- 显微解剖并转移BSC神经元。
- 将口侧神经节腹面朝上固定，注意保护感兴趣的细胞。对口侧神经节中的2个BSC细胞簇重复步骤1.1210.
- 分离PVC和BSC神经元将获得4个培养皿，每个培养皿含有神经元簇：其中2个培养皿含有BSC神经元簇，另外2个含有PVC神经元簇。弃去剩余的神经节，并将100 mm解剖皿放置一旁。
- 解离细胞簇。
- 将含有细胞的培养皿置于低倍显微镜载物台上，并移去盖子。
- 用镊子夹住精细解剖针，轻轻弹击培养皿底部靠近细胞团簇的区域，以分散PVC细胞团。弹击动作是指将针尖插入培养皿底部塑料表面，仿佛试图挑出一小块塑料屑；当针尖与塑料之间的摩擦力突然释放时，会在培养基中产生震动波，从而使邻近的细胞团块解离。
- 可能需要 flick 5-10 次才能使细胞几乎完全解离，但最好保留少量细小的细胞团，避免过度 flick 导致细胞因机械剪切力而受损。
- 更换盖子后，对其他培养皿重复上述操作。
- 储存细胞培养物。
- 将含有培养基小岛且中央接种了离散细胞的培养皿放入允许空气流通的大容器中，例如150 x 25 mm圆形塑料培养皿，并将该培养皿置于设定为17 °C的培养箱中。
- 在培养 chamber 中放置一个盛有水的敞口培养皿，以提供湿度。静置过夜，不要扰动。细胞将附着于培养皿中央的多聚-D-赖氨酸包被区域。
- 淹没培养皿。
- 第3天，轻轻加入2.5 ml ASW + P/S浸没培养皿。使用倒置细胞培养显微镜观察并计数细胞。置于17 °C培养箱中保存。
2. 电生理学
该方法为标准的膜片钳技术，已在多种文献中有所描述（例如 Sakmann 和 Neher，1995）16。本方案适用于电容 ≤100 pF 或在实验第3天和第4天直径 <60 μm 的细胞。无突起的细胞最适合用于记录。需注意以下特殊事项：
- 较大的细胞可通过将Axopatch 200B放大器的配置设置为β=0.1来适配。激活过大的电流可能导致细胞脱离电压钳制。ASW溶液中盐含量被替换（例如 可使用部分 NaCl 被不可通透的 N-甲基-D-葡萄糖胺氯化物替代的溶液以降低全细胞电流幅度。
- 填充纤维的硼硅酸盐膜片电极在电极拉制仪上拉制而成，并用细胞内液（ICS）从后端填充至一半，细胞内液成分为 450 mM KCl 及其他盐类（参见 表1）是合适的，其电阻应约为 0.5–1 MΩ。如果需要分离特定的离子电流，例如 Na+ 无K电流条件下的电流，K+ 该溶液中的离子可被其他离子（如Cs）取代+. Cl- 若希望使用更接近生理状态的细胞内液，则有必要以一种不可通透的阴离子替代ICS中的原有阴离子9.
- 细胞健壮，具有 >可在室温下进行长达1小时的记录。记录的最佳时间为方案的第3天和第4天，即培养后的24至48小时。48小时后，形成吉欧姆密封的难度增加，可能是因为细胞表面糖萼的形成，以及因突起生长导致的空间钳制问题。然而，这些细胞仍可用于非膜片钳研究，例如可在短时间内完成的毒理学研究。 <14 d
- ASW 及其他需通过重力供给溶液装置分配的溶液，以及细胞内溶液，均应通过连接在注射器上的 0.2 μm Acrodisk 滤器过滤（表3以去除干扰吉欧姆封接形成的微小颗粒。
- 使用激动剂（如D-天冬氨酸，D-Asp）时会发生脱敏现象，因此建议每次应用激动剂之间间隔约1-2分钟。相反，快速重复应用某些激动剂（如L-谷氨酸，L-Glu）则常观察到增强效应。
- 激动剂激活的电流（如L-Glu）可通过使用皮升喷射移液管施加激动剂进行研究。该移液管的拉制方式与膜片钳移液管相同，内含激动剂的ASW溶液。当此移液管尖端置于重力灌流装置流出管下方，并与流出管呈45°角放置时（图 2F），激动剂会迅速从细胞上被洗脱，从而最小化脱敏作用。激动剂给药电极应与膜片钳电极形成90°或更大的夹角。
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结果
本方案中所靶向的神经节内感觉神经元的位置，即BSC和PVC神经元，如图1所示。BSC神经元位于口神经节腹侧的两个对称的椭圆形簇中，该表面在完整神经节中背离口团块（图1A）。PVC神经元形成双侧V形簇，围绕脑神经节背侧并向中轴方向延伸（图1B）。这些感觉神经元的优势在于其在神经节内的位置具有高度保守性，尽管在约1%的个体动物中可能出现左侧或右侧簇缺失的情况。BSC和PVC神经元簇可通过细胞膜呈深橙色以及与邻近细胞相比相对较小的尺寸进行识别，如图1A中大圆轮廓所示。
在培养过程中，这些神经元在接种后的第一天通常没有突起（图2A），因此非常适合在接种当天以及第二天进行膜片钳记录。即使细胞看起来已有突起生长（图2F），有时仍可实现足够的空间钳制，这表明并非所有从胞体延伸出的芽状结构都属于该细胞。如果在酶消化后的操作较为轻柔，细胞在接种时可能仍保留部分突起，且这些突起会随着时间逐渐生长（
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讨论
此处描述的离解技术可获得包含50-100个分离神经元的感觉神经元培养物，其间散布有少量胶质细胞及其他未鉴定的细胞。该实验方案中最关键的步骤是神经节在酶溶液中孵育的时间，以及“弹拨”操作——即将消化后的细胞团通过弹拨分散为单个细胞。酶消化步骤（1.8）需根据实际可用温度进行优化。在23 °C并缓慢震荡条件下，BSC细胞团消化13小时已足够，而PVC细胞团则以15小时为最佳。培养皿中细胞产量低，通常归因于酶消化时间不足，或在细胞转移步骤（1.11和1.12）或弹拨步骤（1.13）中机械性破坏过度。细胞无法贴附于培养基质，以及在培养中存活时间短暂，通常也是由于机械性破坏过度所致。培养物还可能发生污染，应通过以下措施尽量避免：确保麻醉后的动物充分冲洗，解剖器械保持洁净，并将目标神经节在含青霉素-链霉素的人工海水（ASW + P/S）中多次漂洗。在解剖操作的不同阶段之间，可能需要对器械进行清洗和酒精消毒，或准备足够数量的器械，以便每个步骤均使用洁净的器械。
Aplysia 的神经生物学研究通常在保留神经元之间或神经元与肌肉之间神经连接的简化制备样本上进行2, 1...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
由NIH P40 OD010952、Korein基金会、迈阿密大学授予SLC的奖学金以及Maytag授予ATK的奖学金资助。作者衷心感谢国家无脊椎动物资源中心 Aplysia 的工作人员，以及Lauren Simonitis和Hannah Peck，她们为一幅图提供了显微图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人工海水 ASW | Sigma-Aldrich | 各种 | （毫摩尔）：417 毫摩尔氯化钠，10 毫摩尔氯化钾，10 毫摩尔氯化钙2 (2 H2O), 5 mM MgCl₂2 (6H2O)，15 HEPES-NaOH，pH 7.6 |
| 细胞内液 | Sigma | 各种 | （毫摩尔）：450 毫摩尔氯化钾，2.9 毫摩尔氯化钙2 (2 H2O)，2.5 MgCl₂2 （6 小时2O), 5 Na2ATP、10 EGTA 和 40 HEPES-KOH，pH 7.4 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 | |
| 青霉素/链霉素以1:100比例加入人工海水（ASW）中 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 单位/毫升青霉素加 5,000 毫克/毫升链霉素 |
| 中性蛋白酶II | 罗氏诊断 | 10165859001 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| XI型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-谷氨酸（L-Glu） | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-天冬氨酸（D-Asp） | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA） | 生物分子 | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA） | Sigma | A6816-5MG | |
| L-谷氨酸受体拮抗剂 | 各种 | 各种 | |
| 琼脂 | |||
| 犬尿酸 | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-氨基-5-磷酰戊酸（NMDAR拮抗剂） | |||
| 2-丙醇 | VWRSP | BDH1133 | |
| 氯化溶液 | Sigma | 各种 | 25 g FeCl3 + 25 ml 浓盐酸 + 50 ml H2O |
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| falcon 150 x 25 mm 组织培养皿；1013 | VWRSP | 1013 | 也可使用硅胶（Sylgard）制成小型解剖皿 |
| Sylgard | WPI | SYL184 | |
| 动物解剖托盘 | 各种 | ||
| 15 ml 离心管，35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | 用于六通道重力灌注系统 |
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| 聚乙烯管 0.022"ID × 0.042"OD；427411 | Becton-Dickinson | 用于灌注系统 | |
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| 单向阀 | 用于灌注系统 | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | 用于灌注系统 | |
| 用于吸液的18号针头（磨平针尖） | |||
| 聚乙烯管 | Cole Parmer | 4.27436×10¹¹ | |
| 精细解剖针 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 毛细管 | Kimble 71900-100 | 在本生灯火焰中烧制圆滑并弯成U形，内含3%琼脂的ECS溶液 | |
| 油泥 | 工艺品商店 | ||
| 显微镜载物台用培养皿支架，带隔离接地浴槽 | 定制生产 | ||
| 巴斯德吸管 | VWRSP | 14672-412 | |
| 移液球 | VWRSP | 53283-911 | |
| 针头式滤器 | VWRSP | 28144-040 | |
| 厚壁1.5 mm直径硼硅酸盐玻璃毛细管 | WPI | 1B150F-3 | |
| 高纯氮气瓶及分流调节器 | |||
<强>表1-3. 试剂、材料和设备清单 |
参考文献
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