我们描述了在麻醉后对海洋海兔Aplysia的神经系统进行解剖，分离神经元用于短期组织培养，并通过膜片钳技术记录单细胞离子电流。
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本文内容
摘要
摘要
海洋腹足类软体动物Aplysia californica作为神经系统功能研究的模式生物，具有悠久的历史，尤其在学习与记忆研究中具有重要意义。此类研究通常采用两种制备方法：一种是在解剖程度最小的动物体内保留感觉神经元和运动神经元完整；另一种是技术上较为复杂的单个感觉神经元与运动神经元共培养体系。较少使用的是分离神经元制备方法，即将在短期内培养的名义上同质的小群神经元解离为单个细胞。这类分离细胞适用于利用膜片钳技术对离子电流进行生物物理表征，以及对这些电导进行靶向调控。本文描述了一种制备此类培养物的实验方案。该方案利用了脑侧神经节和口部神经节中易于识别的谷氨酸能感觉神经元，详细说明了这些神经元的解离过程，并介绍了在无血清条件下短期培养数天的最低限度维持方法。
引言
海洋后鳃类软体动物Aplysia数十年来一直是神经生物学研究中重要的模式生物。它最著名的是作为习惯化和经典条件反射的模型7, 8。2000年，埃里克·R·坎德尔（Eric R. Kandel）因在该模型中开展的学习与记忆研究，与阿尔维德·卡尔松（Arvid Carlsson）和保罗·格林加德（Paul Greengard）共同获得了诺贝尔生理学或医学奖10。利用离体神经标本进行的电生理记录研究，即从动物体内分离出神经系统部分结构，同时保留神经与肌肉的连接，有助于阐明Aplysia中单个神经元的功能。然而，要明确构成Aplysia学习行为的精确分子机制，通常采用另一种技术，即长期共培养单个感觉神经元与运动神经元——这些神经元分别来自不同的供体动物，并在培养皿中形成突触连接21。
我们及其他研究者1, 3, 6, 14, 15, 16已利用该模型中可识别神经元易于靶向以及其在长期实验中具有较强耐受性的特点，制备了分离的短期培养神经元簇，这些神经元在名义上具有同质性，我们采用膜片钳配置下的电压钳技术研究其离子电流。许多Aplysia神经元可耐受多次重复的膜片钳操作，从而允许进行持续时间较长的实验干预。该技术适用于腹神经节中的神经分泌性袋细胞以及本实验所描述的侧神经节和口神经节中的感觉神经元，但不适用于直径>60 μm 的大型....
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方案
1. 细胞制备
- 第1天，称量动物体重并进行麻醉。
- 称量一只30 g至1 kg的动物。将其麻醉于5-10倍动物体积的1:1海水：等渗MgCl₂·6H₂O溶液中。20，在有氧条件下（例如使用带有气石的电动水族箱气泵）振荡培养1小时。
- 准备解剖器械。
- 组装干净的解剖托盘，并配备不锈钢直针（如布料用针）。准备数个含有人工海水（ASW；参见 表1 和 3）及青霉素/链霉素（P/S）。
- 准备好低倍显微镜。备好清洁的解剖器械，例如齿状镊和精细手术镊，以及精细和大型手术剪。使用前用70%异丙醇喷洒器械，并使其晾干。
- 将动物置于解剖托盘上。
- 将动物腹面朝下置于解剖托盘中，用大头针固定体壁边缘和疣足边缘，避免固定尾部和头部，以暴露背侧表面及生殖沟
- 用缓慢流动的冷水冲洗背部表面。从挤压瓶中挤出少量70%异丙醇，沿生殖沟及头部上方轻轻冲洗。
- 进行初始切口。
- 使用低倍显微镜（参见 表2）并利用反射光观察生殖沟自前部壳缘起始的位置，用齿状镊子紧紧夹住该起始点左侧的一褶组织，同时用精细弯头剪刀在生殖沟右侧平坦光滑的体壁区域剪出一个浅孔，....
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结果
本方案中所靶向的神经节内感觉神经元的位置，即BSC和PVC神经元，如图1所示。BSC神经元位于口神经节腹侧的两个对称的椭圆形簇中，该表面在完整神经节中背离口团块（图1A）。PVC神经元形成双侧V形簇，围绕脑神经节背侧并向中轴方向延伸（图1B）。这些感觉神经元的优势在于其在神经节内的位置具有高度保守性，尽管在约1%的个体动物中可能出现左侧或右侧簇缺失的情况。BSC和PVC神经元簇可通过细胞膜呈深橙色以及与邻近细胞相比相对较小的尺寸进行识别，如图1A中大圆轮廓所示。
在培养过程中，这些神经元在接种后的第一天通常没有突起（图2A），因此非常适合在接种当天以及第二天进行膜片钳记录。即使细胞看起来已有突起生长（图2F），有时仍可实现足够的空间钳制，这表明并非所有从胞体延伸出的芽状结构都属于该细胞。如果在酶消化后的操作较为轻柔，细胞在接种时可能仍保留部分突起，且这些突起会随着时间逐渐生长（
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讨论
此处描述的离解技术可获得包含50-100个分离神经元的感觉神经元培养物，其间散布有少量胶质细胞及其他未鉴定的细胞。该实验方案中最关键的步骤是神经节在酶溶液中孵育的时间，以及“弹拨”操作——即将消化后的细胞团通过弹拨分散为单个细胞。酶消化步骤（1.8）需根据实际可用温度进行优化。在23 °C并缓慢震荡条件下，BSC细胞团消化13小时已足够，而PVC细胞团则以15小时为最佳。培养皿中细胞产量低，通常归因于酶消化时间不足，或在细胞转移步骤（1.11和1.12）或弹拨步骤（1.13）中机械性破坏过度。细胞无法贴附于培养基质，以及在培养中存活时间短暂，通常也是由于机械性破坏过度所致。培养物还可能发生污染，应通过以下措施尽量避免：确保麻醉后的动物充分冲洗，解剖器械保持洁净，并将目标神经节在含青霉素-链霉素的人工海水（ASW + P/S）中多次漂洗。在解剖操作的不同阶段之间，可能需要对器械进行清洗和酒精消毒，或准备足够数量的器械，以便每个步骤均使用洁净的器械。
Aplysia 的神经生物学研究通常在保留神经元之间或神经元与肌肉之间神经连接的简化制备样本上进行2, 1.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
由NIH P40 OD010952、Korein基金会、迈阿密大学授予SLC的奖学金以及Maytag授予ATK的奖学金资助。作者衷心感谢国家无脊椎动物资源中心 Aplysia 的工作人员，以及Lauren Simonitis和Hannah Peck，她们为一幅图提供了显微图像。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人工海水 ASW | Sigma-Aldrich | 各种 | （毫摩尔）：417 毫摩尔氯化钠，10 毫摩尔氯化钾，10 毫摩尔氯化钙2 (2 H2O), 5 mM MgCl₂2 (6H2O)，15 HEPES-NaOH，pH 7.6 |
| 细胞内液 | Sigma | 各种 | （毫摩尔）：450 毫摩尔氯化钾，2.9 毫摩尔氯化钙2 (2 H2O)，2.5 MgCl₂2 （6 小时2O), 5 Na2ATP、10 EGTA 和 40 HEPES-KOH，pH 7.4 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 | |
| 青霉素/链霉素以1:100比例加入人工海水（ASW）中 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5,000 单位/毫升青霉素加 5,000 毫克/毫升链霉素 |
| 中性蛋白酶II | 罗氏诊断 | 10165859001 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| XI型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-谷氨酸（L-Glu） | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-天冬氨酸（D-Asp） | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA） | 生物分子 | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA） | Sigma | A6816-5MG | |
| L-谷氨酸受体拮抗剂 | 各种 | 各种 | |
| 琼脂 | |||
| 犬尿酸 | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-氨基-5-磷酰戊酸（NMDAR拮抗剂） | |||
| 2-丙醇 | VWRSP | BDH1133 | |
| 氯化溶液 | Sigma | 各种 | 25 g FeCl3 + 25 ml 浓盐酸 + 50 ml H2O |
| Sylgard 硅胶 2 组分聚合物 | 世界精密仪器公司（WPI） | SYL184 | 为小型解剖皿提供引脚接口表面 |
| 用于解剖的 0-40x 变倍显微镜 | 野生型 | ||
| Techniquip 150 瓦光纤照明器 | 佛罗里达微光子公司 | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 轨道式混匀仪 | |||
| 尼康Diaphot倒置相差显微镜，配备4x、20x（可选）物镜 &和 40x 物镜 | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| 泰克数字示波器 | SR Research Ltd. | ||
| pClamp 10 数据采集与分析软件 | Molecular Devices | ||
| 配备 Windows XP 或更高版本操作系统的个人电脑 | PC Solutions | 配备固态硬盘（80 GB）和低噪声显示器的Thinkserver服务器 | |
| Flaming/Brown P87 微量移液器拉制仪 | Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州 | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B 膜片钳放大器，电容补偿范围为 1–1000 pF；前置放大器 | Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔 | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B 放大器用微电极夹持器组件 | Molecular Devices，加利福尼亚州森尼韦尔 | CV203BU | |
| Digidata 1200 A/D 转换器 | Molecular Devices，美国加利福尼亚州森尼韦尔 | ||
| Picospritzer，由N2供能，可调节压力和持续时间 | Parker Hannifin，克利夫兰，俄亥俄州 | ||
| TMC Micro-G 振动隔离台 | Ametek | ||
| 法拉第笼 | 定制生产 | ||
| Burleigh 压电夹钳式显微操作器 | Burleigh Instruments；Thorlabs | 目前为 PCS-5000、-6000 系列及安装支架 | |
| Narishige M-152 手动操作器（用于灌注系统和压电喷雾仪） | Narishige USA | ||
| 细丝移液管玻璃，外径1.5 mm，内径0.84 mm - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 英寸长度 | |||
| Ag/AgCl 半电池 | WPI | EP4 | |
| 15 ml 离心管，35-2097 BD Falcon* 离心管 | VWRSP | 21008-918 | |
| 斜角剪刀 | 精细科学工具 | 15006-09 | |
| 杜莫斯塔精细镊子 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| 35 mm Falcon 细胞培养皿 | VWRSP | 25382-064 | |
| falcon 150 x 25 mm 组织培养皿；1013 | VWRSP | 1013 | 也可使用硅胶（Sylgard）制成小型解剖皿 |
| Sylgard | WPI | SYL184 | |
| 动物解剖托盘 | 各种 | ||
| 15 ml 离心管，35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | 用于六通道重力灌注系统 |
| 带螺孔端的铝夹 | 五金店 | 用于灌注系统 | |
| 23 号针头（手动磨平针尖） | VWRSP | 用于灌注系统 | |
| 聚乙烯管 0.022"ID × 0.042"OD；427411 | Becton-Dickinson | 用于灌注系统 | |
| H-7 微量灌注阵列移液管架/支架 | Narishige USA | 用于灌注系统 | |
| 单向阀 | 用于灌注系统 | ||
| Drummond Microcaps 1 μl | VWRSP | 用于灌注系统 | |
| 用于吸液的18号针头（磨平针尖） | |||
| 聚乙烯管 | Cole Parmer | 4.27436×10¹¹ | |
| 精细解剖针 | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| 毛细管 | Kimble 71900-100 | 在本生灯火焰中烧制圆滑并弯成U形，内含3%琼脂的ECS溶液 | |
| 油泥 | 工艺品商店 | ||
| 显微镜载物台用培养皿支架，带隔离接地浴槽 | 定制生产 | ||
| 巴斯德吸管 | VWRSP | 14672-412 | |
| 移液球 | VWRSP | 53283-911 | |
| 针头式滤器 | VWRSP | 28144-040 | |
| 厚壁1.5 mm直径硼硅酸盐玻璃毛细管 | WPI | 1B150F-3 | |
| 高纯氮气瓶及分流调节器 | |||
<强>表1-3. 试剂、材料和设备清单 |
参考文献
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R.
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