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方法文章

在免疫缺陷小鼠中建立人肝细胞癌皮下及肝内异种移植模型

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DOI：

10.3791/50544

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2013年9月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Department of Pathology, University Health Network, 3Division of General Surgery, University Health Network

本文内容

摘要

免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤异种移植模型是研究癌症生物学的有力工具。本文描述了从人肝细胞癌细胞或肿瘤组织片段建立皮下和肝内异种移植模型的具体实验方案。通过部分肝切除术诱导受体小鼠肝脏再生，可作为促进肝内移植瘤定植的有效策略。

摘要

体内肝细胞癌（HCC）实验模型能够模拟人类疾病的病理过程，为疾病发病机制的研究以及新型治疗方法的临床前评估提供了重要平台。本文介绍多种在免疫缺陷小鼠中建立皮下或原位人源HCC异种移植模型的方法，适用于多种研究用途。重点以接受手术切除的患者原发肿瘤组织为起始材料，描述了用于异种移植的单细胞悬液或肿瘤组织碎片的制备过程。我们详细阐述了将这些组织进行异种移植的具体技术：i）皮下移植；或ii）肝内移植，后者可通过将肿瘤细胞或组织碎片直接植入肝脏，或间接通过将细胞注射至小鼠脾脏实现。此外，本文还介绍了在异种移植同时对小鼠自身肝脏进行部分切除，以此诱导受体小鼠肝脏处于活跃再生状态，从而促进原发性人源肿瘤细胞在肝内定植的策略。文中展示了这些技术预期获得的结果。所描述的方案已使用原发性人源HCC样本及其异种移植组织进行了验证；这类原发组织的移植效果通常不如文献中广泛使用且频繁引用的成熟人源HCC细胞系稳定。与细胞系相比，我们讨论了可能导致原发性HCC在异种移植模型中定植率相对较低的多种因素，并评述了可能影响异种移植物生长动力学的技术问题。同时，我们还提出了应采用的方法，以确保所获得的异种移植物能够准确地再现其来源HCC组织的特征。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是北美地区癌症死亡率增长最快的病因。HCC最常见的危险因素是肝硬化，通常由慢性病毒性肝炎、酒精滥用、自身免疫性疾病或遗传性代谢紊乱引起1。

尽管肝细胞癌（HCC）在全球人群中造成了沉重的疾病负担，但与其他常见癌症（如结直肠癌、乳腺癌或前列腺癌）相比，其病理生理学仍相对 poorly 被理解。例如，驱动肿瘤发生的特定分子和细胞事件仍有待明确界定2。与大多数其他实体上皮性癌症类似，基因组学研究已揭示了HCC相关异常的异质性3。多项研究发现，参与细胞增殖、存活、分化和血管生成的多种信号通路活性出现紊乱4。此外，癌症干细胞在HCC病理生物学中的作用仍有待阐明5。

由于对肝细胞癌病理生理学的认识有限，有效的治疗手段也相对有限。对于肿瘤局限于肝脏的早期患者，可采用消融治疗或手术切除进行根治性治疗，但复发较为常见。对于病情较晚期的患者，化疗和放疗的疗效有限，主要用于姑息性治疗以控制疾病进展6。

因此，高质量的in vivo人源肝细胞癌（HCC）实验模型为深入研究人HCC的病理生理机制以及评估新型治疗策略提供了极为宝贵的平台。与使用细胞系或高度定义的小鼠模型相比，在免疫缺陷小鼠中移植原发性人肿瘤的异种移植模型已成为此类研究中的有力工具，因其能够高度忠实地模拟人类疾病，并保留不同患者间及患者体内存在的肿瘤异质性7,8。为此，我们已建立了一系列方法，用于在免疫缺陷小鼠中成功构建人HCC异种移植模型。尽管目前已发表的大多数涉及HCC异种移植的研究主要采用已建立的人HCC细胞系，我们的研究重点则是优化实验体系，以直接利用患者手术切除后立即获取的原发性HCC组织样本建立异种移植模型。

不同的异种移植技术可能适用于不同的研究目的。例如，由肿瘤组织碎片生成的皮下异种移植模型制备快速、易于监测，可能更适用于局部给予新型治疗药物，并便于监测肿瘤的治疗反应。肝内异种移植模型则可能更适用于研究肝脏微环境在肝细胞癌（HCC）生物学中的作用。由肿瘤细胞悬液生成的异种移植模型则对于肿瘤起始细胞亚群的鉴定与表征，或需要通过细胞悬液途径进行的实验是必需的 体外 在异种移植前对肿瘤细胞进行的操作。因此，我们开发并验证了以下方案，用于从原代人肝细胞癌（HCC）标本获得的细胞悬液或肿瘤组织碎片中建立皮下或肝内异种移植模型。

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方案

该实验方案的示意图见图1。

1. 人肝细胞癌样本的处理

在获得患者书面同意及机构研究伦理委员会批准的情况下获取原发性人肝细胞癌（HCC）标本。本机构已根据大学健康网络研究伦理委员会的批准开展这些方案，符合所有机构、国家和国际关于人类福利的指导原则。

在手术后，一旦为临床目的采集了适当的样本，应尽快收集新鲜的肝细胞癌（HCC）标本。理想情况下，应在组织从患者体内切除后的30分钟内完成。如图2所示，从肿瘤边缘区域获取至少1 cm3的样本最为合适，因为肿瘤中心区域可能已发生坏死。为最大限度地保证肿瘤细胞具有活性，应优先选择在切除前未经任何治疗（如放疗、化疗或消融）的肿瘤。处理原代人组织时，须遵循针对生物危害材料的标准个人防护规程。所有肿瘤组织和细胞制备的实验操作均应在II级生物安全柜中进行，并采用无菌技术。

  1. 将新鲜的肝细胞癌（HCC）样本置于 10–25 ml 无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 中，4 °C 条件下冰上运送至实验室，立即进行组织碎片和/或细胞的制备，用于移植至小鼠体内。
  2. 使用无菌镊子将肿瘤样本置于 100 mm × 20 mm 的培养皿或其他合适的无菌操作面上，用 10 号外科手术刀片将肿瘤组织切成约 2–3 mm3 的小块。此时可根据需要考虑将部分肿瘤组织迅速冷冻或用福尔马林固定，以备后续其他实验或分析使用。
  3. 对于肿瘤组织块的异种移植，将部分 HCC 组织块放入一个或多个含有足量 Matrigel 的微量离心管中，确保组织块完全浸没在 Matrigel 中。将这些离心管置于冰上保存。
  4. 为制备肿瘤细胞悬液，使用手术刀片尽可能将剩余的 HCC 组织切碎，并根据切碎组织的体积，加入 5–10 ml DMEM-F12 培养基至 50 ml 锥形管中混匀。
  5. 加入 IV 型胶原酶和 dispase II，使其终浓度分别为 200 单位/ml 和 0.8 单位/ml。使用 25 ml 移液管反复吹打混合液，充分混匀。
  6. 密封管口，将步骤 1.6 中的混合物在 37 °C、5% 二氧化碳培养箱中孵育 30–60 分钟，具体时间根据肿瘤组织的软硬度而定。每 10 分钟用移液管吹打数次，以评估酶消化的进展。
  7. 消化完成后，将肿瘤悬液通过 100 μm 细胞筛过滤。使用 25 ml 移液管枪头轻轻按压细胞筛上的残留组织，使尽可能多的肿瘤细胞通过筛网。将滤过的细胞悬液收集至 15 ml 锥形管中。
  8. 在 4 °C 条件下，以 1,200 rpm 离心 5 分钟，收集肿瘤细胞悬液。
  9. 小心弃去上清液。根据细胞沉淀的大小，加入 2–5 ml 冰冷的 1× 红细胞（RBC）裂解缓冲液，轻轻吹打重悬沉淀，冰上孵育 5 分钟。
  10. 加入 DMEM-F12 培养基至总体积为 15 ml，然后在 4 °C 条件下以 1,000 rpm 离心 5 分钟，以洗去红细胞裂解缓冲液。
  11. 小心弃去上清液，将去除了红细胞的肿瘤细胞沉淀重悬于 DMEM-F12 培养基中。
  12. 使用台盼蓝排斥法手动或通过自动细胞计数仪计数活细胞数量。
  13. 将含有预定注射细胞数的肿瘤细胞分装液离心，将所得细胞沉淀重悬于 30 μl 冰冷的 Matrigel 中，并置于冰上保存。

可选步骤：在完成步骤 1.11 后，我们通常使用流式细胞术或免疫磁珠法，从原代肿瘤细胞悬液中耗尽人 CD45+ 细胞（白细胞）和/或纯化特定的肿瘤细胞亚群。相关抗体、磁珠及流式细胞仪的制造商已对这些技术提供了详细的实验方案。

注意： 上述方案也可用于处理从小鼠体内收获的人源肿瘤异种移植组织，以进行连续传代移植实验，此时在步骤 1.1 中用异种移植组织替代原代人肝细胞癌（HCC）组织。在此情况下，在完成步骤 1.11 后，我们通常使用针对小鼠组织相容性抗原 H2k 的抗体，从细胞悬液中去除浸润的小鼠来源细胞。

2. 异种移植

所有动物实验操作均须遵守机构动物护理委员会批准的方案。本文所述操作已在大学健康网络动物护理委员会批准的特定动物使用方案下完成，并符合所有相关监管机构、机构、法规及指南的要求。

应根据动物设施和研究机构的标准操作程序使用向小型动物输送吸入性挥发性麻醉剂的设备。所有外科手术均须在II级生物安全柜内采用无菌技术并使用无菌器械进行。使用6至8周龄的非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）或NOD/SCID/白细胞介素2受体γ链缺失（NSG）品系小鼠，性别不限（The Jackson Laboratory，缅因州巴港）9,10。这些小鼠必须饲养和维持在能够为免疫缺陷动物提供无病原体环境的设施中。

将小鼠置于麻醉诱导舱中，以1 L/min的氧气流速供给5%（v/v）吸入式异氟烷进行术前准备。持续维持麻醉状态，直至小鼠角膜反射和足趾反射消失。对于皮下移植，剃除小鼠背部一处或多处小范围毛发，并用70%乙醇清洁皮肤。对于肝内移植，剃除小鼠从腋窝至腹股沟区域的腹侧胸部和腹部毛发，并用70%乙醇清洁皮肤。

2.1 肿瘤组织片段的皮下植入

  1. 将麻醉后的小鼠置于俯卧位，持续吸入异氟烷麻醉（2% (v/v)，氧气流速1 L/min）2）并连接咬口。使用 Tear-Gel 保护动物眼睛，防止受到创伤性损伤。
  2. 用聚维酮碘手术擦洗剂对背部剃毛区域进行消毒，随后使用70%乙醇，最后再用聚维酮碘溶液处理。
  3. 使用无菌剪刀做一道5 mm的皮肤切口。
  4. 将一把闭合的钝头剪刀轻柔地插入皮下间隙，轻轻撑开，以形成一个足以容纳肿瘤组织块的囊腔。
  5. 使用无菌精细镊子将步骤1.3中制备的肿瘤组织碎片植入皮下袋中。
  6. 使用缝线或缝合钉关闭皮肤切口。
  7. 按照以下说明对小鼠进行术后护理。

2.2 肿瘤细胞的皮下注射

  1. 按照步骤 2.1.1 和 2.1.2 所述方法准备动物。
  2. 将步骤 1.13 中制备的 Matrigel 肿瘤细胞悬液吸入带有 29 G 1/2 英寸针头的胰岛素注射器中。
  3. 将针头插入皮下间隙，并推出注射器内的内容物。在皮下平面内将针头从皮肤穿刺点向前推进数毫米，可在拔出针头时防止肿瘤细胞悬液从穿刺点泄漏。
  4. 按照下文所述对小鼠进行术后护理。

2.3 肝内植入肿瘤组织碎片

  1. 使用1 ml注射器连接27 G 1/2 in针头，于麻醉动物颈部背侧皮下注射350 μl无菌生理盐水，以补偿术中液体丢失。为镇痛，使用1 ml注射器连接27 G 1/2 in针头，于动物侧腹部皮下注射含布托啡诺（0.1 mg/kg）的无菌生理盐水350 μl。
  2. 将小鼠仰卧置于预热的垫子上，使其口鼻置于面罩内，以吸入维持剂量的异氟烷麻醉剂（2% (v/v)，氧气流速1 L/min）2).
  3. 伸展四肢，并用胶带将其固定在操作台表面，以充分暴露腹侧腹部和胸部。
  4. 在放大灯下进行操作，以优化视野。
  5. 用聚维酮碘外科洗手液对腹部腹侧和胸部剃毛区域的皮肤进行消毒，随后使用70%乙醇，最后使用聚维酮碘溶液。
  6. 使用无菌的锋利剪刀，在肋缘下做横向双侧皮肤切口，切开肌层以进入腹腔，充分暴露整个肝脏。
  7. 在剑突上方的皮肤处缝合一针，并用胶带将其固定于口撑上，以更好地暴露肝脏及周围结构。
  8. 使用两根棉签分别置于肝脏的相邻位置和后方以固定肝脏。
  9. 使用无菌的10号手术刀片在肝脏表面做一个长3 mm、深3 mm的切口。
  10. 立即在切口处应用Surgicel并施加轻柔压力以止血；60-90秒后移除，仅在达到完全止血后继续操作。
  11. 使用无菌精细镊子或18 G针头将1.3步骤中的肿瘤组织碎片放入肝脏切口内。
  12. 在肝切口处覆盖一小块Surgicel，以防止肿瘤碎片移位并确保持续止血。
  13. 用缝线或缝合钉关闭切口。
  14. 按照以下描述提供术后护理

2.4 通过直接注射至肝脏进行肝内肿瘤细胞移植

  1. 按照上述步骤 2.3.1 至 2.3.7 所述方法准备小鼠。
  2. 使用 29 G 1/2 英寸针头将肿瘤细胞悬液（在步骤 1.13 中制备）装入胰岛素注射器中。
  3. 用棉签轻轻固定肝脏，将胰岛素注射器针头插入肝脏，并沿肝包膜下平面将针尖推进至穿刺点以下数毫米处。
  4. 缓慢排出注射器内的内容物，然后将针头从肝脏中取出。
  5. 在穿刺部位覆盖止血纱布（Surgicel），并用棉签轻轻按压，以防止肿瘤细胞悬液泄漏并实现完全止血。
  6. 使用缝线或伤口夹关闭切口，并按照下文所述进行术后护理。

2.5 通过脾脏注射进行肿瘤细胞的肝内异种移植

  1. 按照上述步骤 2.3.1 至 2.3.5 所述准备小鼠。
  2. 使用无菌的锐利剪刀，在左侧肋缘下做一条 1 cm 的切口，进入腹腔。
  3. 用棉签轻轻将胃部向头侧及动物右侧推开，以暴露脾脏。
  4. 用无菌精细无创镊子夹持脾脏周围脂肪组织，将脾脏移至切口处，并在脾脏后方放置棉签以固定脾脏。
  5. 使用 5-0 丝线，在脾脏下极上方打一个松散的预结扎结。
  6. 将步骤 1.13 中制备的肿瘤细胞悬液用 29 G 1/2 英寸针头吸入胰岛素注射器中。
  7. 将胰岛素注射器针头插入脾脏下极，并推进至预结扎结的上方水平。
  8. 缓慢注射注射器内全部内容物，拔出针头后收紧结扎线，防止注射的肿瘤细胞悬液外漏。
  9. 将脾脏复位至腹腔内。
  10. 用缝线或缝合钉关闭切口，并按照下文所述提供术后护理。

2.6 部分肝切除以促进人源肿瘤组织的肝内植入

  1. 按照步骤 2.3.1 至 2.3.7 所述准备小鼠。
  2. 使用无菌的锋利剪刀，剪断连接肝脏中叶的镰状韧带。
  3. 使用棉签轻轻游离肝脏左叶，并在左叶周围放置一个预先打好的松结（5-0 丝线缝线）。将松结尽可能向左叶的胆血管蒂方向推进，并扎紧结。
  4. 使用无菌剪刀在结扎线远端切除左叶，保留一小段残端，以防止结滑脱及继发出血。
  5. 采用类似技术结扎并切除肝脏中叶的大部分组织，注意避开胆囊。
  6. 在肝实质切面处使用止血纱布（Surgicel）并以棉签轻压，以实现完全止血。
  7. 如需通过肝内移植接种肿瘤组织块或肿瘤细胞，请按上文所述继续进行步骤 2.3.8 至 2.3.11 或 2.4.2 至 2.4.5。
  8. 如需通过脾脏注射进行肝内异种移植肿瘤细胞，请使用棉签轻轻将胃部向头侧及动物右侧推移，暴露脾脏，并按上文所述进行步骤 2.5.4 至 2.5.9。
  9. 使用缝线或夹子关闭切口，并按下方所述提供术后护理。

2.7 术后护理

  1. 将小鼠从吸入麻醉器中取出。
  2. 将小鼠放入笼中，并置于加热灯下约 20 分钟，直至从麻醉中恢复并能完全自主活动。
  3. 在术后前 2–3 天内，每 8–12 小时重复给予一次布托啡诺剂量。

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结果

图3展示了皮下人源肝细胞癌（HCC）异种移植瘤的典型外观及其相应的组织病理学表现。通过每日观察受体小鼠，可方便地监测皮下异种移植瘤的形成与生长情况。异种移植后肿瘤形成的时间间隔可能因组织类型（肿瘤组织碎片 vs. 细胞悬液）、组织来源（原代患者样本、传代异种移植瘤或细胞系）以及植入组织的数量（细胞数目或肿瘤碎片大小）而存在显著差异。例如，注射5 × 106个已建立的HCC细胞系细胞后，通常在1至2周内即可形成可触及的异种移植瘤；而使用来自原代患者HCC样本的1 × 105个细胞，则可能需要长达6个月才能形成相似的移植瘤。我们未观察到肿瘤样本移植6个月后仍出现皮下异种移植瘤的形成，因此若在此时间点仍未见移植瘤生长，即对受体小鼠实施安乐死。

图4展示了通过将肿瘤组织直接植入肝脏或通过将肿瘤细胞注射至脾脏所建立的肝内人源HCC异种移植瘤的典型表现。除非肿瘤体积极大或已导致腹水或腹部膨胀，否则通常无法通过受体小鼠的一般体格检查轻易发现肝内异种移植瘤。尽管一些研究机构可提供小动物成...

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讨论

我们已描述了多种在免疫缺陷小鼠中建立皮下和肝内人源肝细胞癌（HCC）异种移植模型的技术，这些技术可应用于多种实验问题和检测方法。尽管皮下异种移植已被广泛用于研究HCC生物学的多个方面，但文献中极少描述肝内异种移植模型。此外，大多数关于异种移植应用的研究均使用已建立的细胞系作为来源。鉴于癌细胞系在模拟人类肿瘤生物学方面存在局限性12，我们致力于利用原代人源HCC组织验证上述技术。尽管由于实验组样本量较小而未进行统计学分析，但我们的观察结果主观上显示出一个显著趋势：在将肿瘤细胞或组织片段植入肝内的同时联合部分肝切除术，可提高移植成功率。

少数严格尝试使用原代组织的研究仅在获得的患者样本中极小比例实现了成功的皮下移植13-15。我们还观察到，采用上述技术将原代人肝细胞癌（HCC）样本移植至免疫缺陷小鼠皮下时，成功移植的比例仅限于约15%。在人体肝脏中，HCC病灶为高血管性，其血液供应主要来自肝动脉16,17。我们推测，我们及其他研究者所观察到的原代HCC组织移植率较低，可能是由于新鲜HCC组织在异种移植后所处的微环境相对缺...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由加拿大卫生研究院临床科学家奖第一阶段（A.G.）以及癌症研究学会的运营资助（A.G.）支持。作者衷心感谢John Dick博士对本项目的大力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科’s Mod. Eagle 培养基/Ham’DMEM-F12 1×混合液（F12 50/50） WISENT 生物产品319-075-CL
IV型胶原酶Sigma-AldrichC5138
Dispase II Stemcell Technologies7923
基质胶矩阵Becton-Dickinson 生物科学354234
10 % 缓冲福尔马林溶液Sigma-AldrichHT501128
0.9% 氯化钠溶液（NaCl），无菌自有品牌1011-L8001
聚维酮碘外科洗手液普渡制药NPN 00158313
布托啡诺（Temegesic）NR 0.3 mg/mlReckitt Benckiser
异氟烷 USP，99.9%，吸入用麻醉剂加拿大制药合作伙伴公司M60302
Tear-Gel 诺华制药
冷冻切片包埋剂 VWR95057-838
Cryomold，Tissue-Tek Sakura Finetek4566
Precision Glide 针头 18G 1 ½ Becton-Dickinson 生物科学305196
Precision Glide Needle 27G ½ Becton-Dickinson 生物科学305109
胰岛素注射器，3/10毫升U-100，29G½ Becton-Dickinson 生物科学309301
10号手术刀片Feather Safety Razor Co.08-916-5A
#5-0 柔软蚕丝外科缝合线，3/8 弧度针" 锥形针头 SynetureVS-880
透气手术胶带3M 医疗保健1577-1
棉签 Medpro018-425
Surgicel，氧化再生纤维素Ethicon1951
细胞滤网 100 μm 尼龙Becton-Dickinson 生物科学352360
带移动底座的放大照明装置Benson Medical Industries Inc.型号：RLM-CLT-120V
无菌培养皿 100×20 mm Sarstedt821474
组织镊，1×2 齿，4-1/2 英寸"AlmedicA10-302
Adson 纱布钳 4-3/4"AlmedicA10-220
带齿眼用镊，直型，4" AlmedicA19-560
哈特曼止血钳，弯型，3-1/2" AlmedicA12-142
虹膜剪，弯型，4-1/4"阿尔梅迪克A8-690
虹膜剪，直型，4-1/2" AlmedicA8-684
Olsen-Hegan持针器，5-1/2" AlmedicA17-228

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