在免疫缺陷小鼠中建立人肝细胞癌皮下及肝内异种移植模型

摘要

免疫缺陷小鼠中的人类肿瘤异种移植模型是研究癌症生物学的有力工具。本文描述了从人肝细胞癌细胞或肿瘤组织片段建立皮下和肝内异种移植模型的具体实验方案。通过部分肝切除术诱导受体小鼠肝脏再生，可作为促进肝内移植瘤定植的有效策略。

摘要

体内肝细胞癌（HCC）实验模型能够模拟人类疾病的病理过程，为疾病发病机制的研究以及新型治疗方法的临床前评估提供了重要平台。本文介绍多种在免疫缺陷小鼠中建立皮下或原位人源HCC异种移植模型的方法，适用于多种研究用途。重点以接受手术切除的患者原发肿瘤组织为起始材料，描述了用于异种移植的单细胞悬液或肿瘤组织碎片的制备过程。我们详细阐述了将这些组织进行异种移植的具体技术：i）皮下移植；或ii）肝内移植，后者可通过将肿瘤细胞或组织碎片直接植入肝脏，或间接通过将细胞注射至小鼠脾脏实现。此外，本文还介绍了在异种移植同时对小鼠自身肝脏进行部分切除，以此诱导受体小鼠肝脏处于活跃再生状态，从而促进原发性人源肿瘤细胞在肝内定植的策略。文中展示了这些技术预期获得的结果。所描述的方案已使用原发性人源HCC样本及其异种移植组织进行了验证；这类原发组织的移植效果通常不如文献中广泛使用且频繁引用的成熟人源HCC细胞系稳定。与细胞系相比，我们讨论了可能导致原发性HCC在异种移植模型中定植率相对较低的多种因素，并评述了可能影响异种移植物生长动力学的技术问题。同时，我们还提出了应采用的方法，以确保所获得的异种移植物能够准确地再现其来源HCC组织的特征。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是北美地区癌症死亡率增长最快的病因。HCC最常见的危险因素是肝硬化，通常由慢性病毒性肝炎、酒精滥用、自身免疫性疾病或遗传性代谢紊乱引起¹。

尽管肝细胞癌（HCC）在全球人群中造成了沉重的疾病负担，但与其他常见癌症（如结直肠癌、乳腺癌或前列腺癌）相比，其病理生理学仍相对 poorly 被理解。例如，驱动肿瘤发生的特定分子和细胞事件仍有待明确界定²。与大多数其他实体上皮性癌症类似，基因组学研究已揭示了HCC相关异常的异质性³。多项研究发现，参与细胞增殖、存活、分化和血管生成的多种信号通路活性出现紊乱⁴。此外，癌症干细胞在HCC病理生物学中的作用仍有待阐明⁵。

由于对肝细胞癌病理生理学的认识有限，有效的治疗手段也相对有限。对于肿瘤局限于肝脏的早期患者，可采用消融治疗或手术切除进行根治性治疗，但复发较为常见。对于病情较晚期的患者，化疗和放疗的疗效有限，主要用于姑息性治疗以控制疾病进展⁶。

因此，高质量的in vivo人源肝细胞癌（HCC）实验模型为深入研究人HCC的病理生理机制以及评估新型治疗策略提供了极为宝贵的平台。与使用细胞系或高度定义的小鼠模型相比，在免疫缺陷小鼠中移植原发性人肿....

方案

该实验方案的示意图见图1。

1. 人肝细胞癌样本的处理

在获得患者书面同意及机构研究伦理委员会批准的情况下获取原发性人肝细胞癌（HCC）标本。本机构已根据大学健康网络研究伦理委员会的批准开展这些方案，符合所有机构、国家和国际关于人类福利的指导原则。

在手术后，一旦为临床目的采集了适当的样本，应尽快收集新鲜的肝细胞癌（HCC）标本。理想情况下，应在组织从患者体内切除后的30分钟内完成。如图2所示，从肿瘤边缘区域获取至少1 cm³的样本最为合适，因为肿瘤中心区域可能已发生坏死。为最大限度地保证肿瘤细胞具有活性，应优先选择在切除前未经任何治疗（如放疗、化疗或消融）的肿瘤。处理原代人组织时，须遵循针对生物危害材料的标准个人防护规程。所有肿瘤组织和细胞制备的实验操作均应在II级生物安全柜中进行，并采用无菌技术。

1. 将新鲜的肝细胞癌（HCC）样本置于 10–25 ml 无血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基/Ham's F12 中，4 °C 条件下冰上运送至实验室，立即进行组织碎片和/或细胞的制备，用于移植至小鼠体内。
2. 使用无菌镊子将肿瘤样本置于 100 mm × 20 mm 的培养皿或其他合适的无菌操作面上，用 10 号外科手术刀片....

结果

图3展示了皮下人源肝细胞癌（HCC）异种移植瘤的典型外观及其相应的组织病理学表现。通过每日观察受体小鼠，可方便地监测皮下异种移植瘤的形成与生长情况。异种移植后肿瘤形成的时间间隔可能因组织类型（肿瘤组织碎片 vs. 细胞悬液）、组织来源（原代患者样本、传代异种移植瘤或细胞系）以及植入组织的数量（细胞数目或肿瘤碎片大小）而存在显著差异。例如，注射5 × 10⁶个已建立的HCC细胞系细胞后，通常在1至2周内即可形成可触及的异种移植瘤；而使用来自原代患者HCC样本的1 × 10⁵个细胞，则可能需要长达6个月才能形成相似的移植瘤。我们未观察到肿瘤样本移植6个月后仍出现皮下异种移植瘤的形成，因此若在此时间点仍未见移植瘤生长，即对受体小鼠实施安乐死。

图4展示了通过将肿瘤组织直接植入肝脏或通过将肿瘤细胞注射至脾脏所建立的肝内人源HCC异种移植瘤的典型表现。除非肿瘤体积极大或已导致腹水或腹部膨胀，否则通常无法通过受体小鼠的一般体格检查轻易发现肝内异种移植瘤。尽管一些研究机构可提供小动物成.......

讨论

我们已描述了多种在免疫缺陷小鼠中建立皮下和肝内人源肝细胞癌（HCC）异种移植模型的技术，这些技术可应用于多种实验问题和检测方法。尽管皮下异种移植已被广泛用于研究HCC生物学的多个方面，但文献中极少描述肝内异种移植模型。此外，大多数关于异种移植应用的研究均使用已建立的细胞系作为来源。鉴于癌细胞系在模拟人类肿瘤生物学方面存在局限性¹²，我们致力于利用原代人源HCC组织验证上述技术。尽管由于实验组样本量较小而未进行统计学分析，但我们的观察结果主观上显示出一个显著趋势：在将肿瘤细胞或组织片段植入肝内的同时联合部分肝切除术，可提高移植成功率。

少数严格尝试使用原代组织的研究仅在获得的患者样本中极小比例实现了成功的皮下移植^13-15。我们还观察到，采用上述技术将原代人肝细胞癌（HCC）样本移植至免疫缺陷小鼠皮下时，成功移植的比例仅限于约15%。在人体肝脏中，HCC病灶为高血管性，其血液供应主要来自肝动脉^16,17。我们推测，我们及其他研究者所观察到的原代HCC组织移植率较低，可能是由于新鲜HCC组织在异种移植后所处的微环境相对缺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’s Mod. Eagle 培养基/Ham’DMEM-F12 1×混合液（F12 50/50）	WISENT 生物产品	319-075-CL
IV型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138
Dispase II	Stemcell Technologies	7923
基质胶矩阵	Becton-Dickinson 生物科学	354234
10 % 缓冲福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT501128
0.9% 氯化钠溶液（NaCl），无菌	自有品牌	1011-L8001
聚维酮碘外科洗手液	普渡制药	NPN 00158313
布托啡诺（Temegesic）NR 0.3 mg/ml	Reckitt Benckiser
异氟烷 USP，99.9%，吸入用麻醉剂	加拿大制药合作伙伴公司	M60302
Tear-Gel	诺华制药
冷冻切片包埋剂	VWR	95057-838
Cryomold，Tissue-Tek	Sakura Finetek	4566
Precision Glide 针头 18G 1 ½	Becton-Dickinson 生物科学	305196
Precision Glide Needle 27G ½	Becton-Dickinson 生物科学	305109
胰岛素注射器，3/10毫升U-100，29G½	Becton-Dickinson 生物科学	309301
10号手术刀片	Feather Safety Razor Co.	08-916-5A
#5-0 柔软蚕丝外科缝合线，3/8 弧度针" 锥形针头	Syneture	VS-880
透气手术胶带	3M 医疗保健	1577-1
棉签	Medpro	018-425
Surgicel，氧化再生纤维素	Ethicon	1951
细胞滤网 100 μm 尼龙	Becton-Dickinson 生物科学	352360
带移动底座的放大照明装置	Benson Medical Industries Inc.	型号：RLM-CLT-120V
无菌培养皿 100×20 mm	Sarstedt	821474
组织镊，1×2 齿，4-1/2 英寸"	Almedic	A10-302
Adson 纱布钳 4-3/4"	Almedic	A10-220
带齿眼用镊，直型，4"	Almedic	A19-560
哈特曼止血钳，弯型，3-1/2"	Almedic	A12-142
虹膜剪，弯型，4-1/4"	阿尔梅迪克	A8-690
虹膜剪，直型，4-1/2"	Almedic	A8-684
Olsen-Hegan持针器，5-1/2"	Almedic	A17-228