评估精子竞争能力差异的方法 果蝇

摘要

通过双交配实验可以确定具有不同基因型的黑腹果蝇（Drosophila）雄性之间精子竞争能力的差异。每项实验均涉及一个待测雄性和一个参照雄性。后代中易于识别的标记可用来推断每个雄性所繁殖后代的比例。

摘要

同种雄性个体之间为获得卵子受精权而进行的竞争是性选择的机制之一， 即 作用于最大化成功交配事件数量而非最大化生存率和存活力的自然选择 ¹精子竞争是指雄性个体与同一雌性交配后，其精子之间为实现受精而产生的竞争 ²，即它们的精子在时间和空间上恰好相遇。这一现象已在多种动植物中被报道 ³例如，野外捕获的 D. melanogaster 雌性通常含有来自2-3只雄性的精子 ⁴精子被储存在储存能力有限的特化器官中，这可能导致来自不同雄性的精子之间发生直接竞争。 ^2,5.

通过实验室中受控的双重交配实验，已对不同目标雄性（实验雄性类型）的精子竞争能力进行了比较^6,7。简而言之，同一只雌性依次与两种不同的雄性交配，其中一只是实验雄性，另一只是用于交叉交配的参照雄性。随后，对其他实验雄性类型也采用相同的交配方案，从而通过一个共同的参照实现对其精子竞争能力的间接比较。利用遗传标记可确定由实验雄性和参照雄性各自父系的子代所占比例，进而通过简单的数学表达式估算精子竞争能力^7,8。此外，可根据实验雄性是先交配还是后交配，分别在两种不同情境下评估其精子竞争能力（分别为防御试验和进攻试验）⁹，这两种情形被认为反映了不同的竞争能力特征。

本文描述了一种用于探究果蝇（D. melanogaster）精子竞争能力现象背后不同遗传因素作用的方法。

引言

自从杰夫·帕克（Geoff Parker）指出昆虫中普遍存在精子竞争现象及其进化意义以来 ²，大量研究在 果蝇 以及其他物种已在多个不同层面尝试揭示这一现象。一些研究兴趣领域包括其在自然种群中的变异调查 ^9,10，其遗传结构及潜在遗传因素的相关性 ^11-14及其在推动两性间共同进化中的作用 ^15,16。在 D. melanogaster 雌性, 受限于特化的精子储存器官容量，即一对受精囊和一个精囊 ^6,17，有助于不同雄性个体精子之间的竞争。交配过程中约有1,500个精子被转移到雌性体内，但上述器官仅能容纳约500个精子 ^18,19在实验室中，通过受控的双重交配实验，将参照雄性与一个或多个待测雄性进行交配，已广泛用于评估精子竞争能力。 ^7,8.

精子竞争能力通过双交配实验中实验雄性个体所生育的后代占总后代的比例来评估， 即 来自实验组雄性和参照组雄性的精子。精子竞争能力包含两个组分，每一组分通过独立的实验进行评估。在进攻性实验中，评估实验组雄性精子取代第一只雄性精子的能力， 即 参考雄性个体的受精能力进行评估。相反，在防御实验中，则评估实验雄性精子抵抗被取代的能力，或降低参考雄性精子受精成功率的能力。根据实验类型（防御或进攻），通过P值评分来估算精子竞争能力₁ 或 P₂，分别。P₁ 和 P₂ 只能取0到1之间的值。中间值通常被解释为精子混合的间接证据，表明存在涉及直接精子竞争的生理情况。依据相同的逻辑，极端值可被解释为存在显著差异的精子竞争能力的证据。早期研究表明，P₂ 在 D. melanogaster 随着两次交配之间时间间隔的延长，该值超过0.8并逐渐增加 ⁷相同的实验设计已用于其他研究 果蝇 物种，P₂ 是评估精子竞争能力研究中常用的统计指标 ²⁰对于大多数物种，P₂ 所测试菌株的值高于0.6 ²¹然而，还有若干其他机制并不涉及不同雄性精子之间的直接竞争，却也能产生相同的结果（见讨论部分）。

通过使用易于识别的遗传标记，可以区分由第一只或第二只雄性果蝇所生育的后代。在早期研究中，其中一只雄性会接受亚致死剂量的辐照（例如X射线），使得几乎所有由经辐照精子受精的卵均无法孵化⁷。随后，影响眼色素或翅形的突变成为最常用的标记。前一类突变的实例包括bw（brown）⁹、cn（cinnabar）²²和w（white）²³，而Cy（Curly）²⁴突变则属于后一类表型；其中一些突变已被组合在同一果蝇个体中，例如cn bw。此外，具有已知遗传模式的同工酶²⁵和微卫星标记^26,27也被较少程度地使用。

本文所述用于检测精子竞争能力差异的实验设计，基本遵循 Clark et al. ⁹ 的方法。这些实验所得结果仅提供关于受检雄性类型在亲权分配上差异的信息。若结合考虑受精后适合度差异的检测方法^14,28以及精子可视化技术²⁴，则可将P₁ （或 P₂）得分的差异解释为精子能力的差异。

图1概述了进攻性实验和防御性实验的设计原理。为了说明实验流程的具体操作，以下将详细解释在D. melanogaster¹⁴中进行的一项进攻性实验。该进攻性实验用于检测多基因家族精子特异性动力蛋白中间链（Sdic）对精子竞争能力是否具有可测量的影响。该多基因家族的所有成员均串联排列在X染色体上。通过删除Sdic基因簇获得敲除雄性。由于被删除的片段还包括必需基因短翅（sw），而本研究的目的是评估Sdic的功能，因此通过位于第2号染色体上的sw转基因拷贝（记作P{sw}，其同时携带mini-white报告基因）对携带Sdic-sw缺失的雄性进行功能挽救。眼色被用作可观察的标记以进行父系鉴定。除用作参照雄性的Oregon-R品系外，所有果蝇均处于white突变背景中。

方案

应先进行小规模实验，以熟悉整个实验流程。

1. 收集处女雌蝇和未经交配的雄蝇

所述实验的最简版本包括四种初始杂交类型，涉及以下成虫组合：a) w¹¹¹⁸ 个体，用于收集处女雌蝇；b) Oregon-R 个体，用于收集未经交配的参照雄蝇；c) P{sw} 纯合雄蝇与携带 Sdic 基因野生型结构的对照品系处女雌蝇杂交，以获得未经交配的实验组雄蝇（I型）；以及 d) P{sw} 纯合雄蝇与携带 Sdic-sw 缺失突变的处女雌蝇杂交，以获得携带 Sdic-sw 缺陷的未经交配实验组雄蝇（II型）。

1. 设置多个小瓶，每瓶放入8-10只雌蝇和5只雄蝇。让雌蝇产卵，并每隔3-5天将成虫转移至新的小瓶中。必要时可使用培养瓶代替小瓶，且始终使用新鲜培养基。所需小瓶的数量取决于实验中所涉及的雄蝇类型数量以及为检测差异而预估所需的个体数量。表1每瓶超过10只雌蝇可能导致幼虫生长期间过于拥挤，进而引起子代繁殖力的变异。将培养瓶置于温度控制的培养箱中，25 °C保存。
2. 从第11天开始收集处女雌蝇和未经交配的雄蝇^th 和 12^th 在完成初始杂交后，需要一定的等待时间。该等待时间因温度而异；较低的温度会导致发育时间延长，从而推迟个体的羽化收集。影响羽化时间的另一个因素是培养基的类型。营养丰富的食物，例如玉米粉-酵母培养基 ²⁹，确保成体生殖系统的正常发育，从而促进交配。每4-6小时收集一次未交配的果蝇。收集时，通过引入CO₂麻醉果蝇₂ 将果蝇轻轻敲入小瓶中，在体视显微镜下进行性别鉴定（图2将所需果蝇按性别和表型分别放入不同的培养瓶中，并正确标记培养瓶。

注意1. 收集流程于早晨开始，首先弃除前一晚已羽化的成虫。在白天期间收集一次或两次处女雌蝇和未经交配的雄蝇。通常情况下，D. melanogaster 雄蝇在25 °C条件下羽化后8小时达到性成熟³⁰。若果蝇维持在12小时光照/12小时黑暗的循环条件下，预期会出现两个羽化高峰：分别在光照开启后的最初1-2小时内，以及光照关闭前的2小时内。羽化发生在蛹体变暗后的24小时内。

注意2：每个小瓶中放入的雌性果蝇不应超过10只，以避免过于拥挤。此外，若其中至少有一只雌蝇不是处女蝇而需丢弃时，此数量限制也可减少雌蝇的损失。

注3. 为了在短时间内收集到足够数量的处女雌蝇和未经交配的雄蝇，可采取以下措施：设置15-20个试管 w¹¹¹⁸ 涉及两种实验雄性个体的实验表1）。轻轻撒布培养基表面，并加入几粒干燥的活性酵母颗粒以促进产卵。连续数日至少转移亲本4次。为增加每支试管内可供化蛹的表面积，可在第4天插入一张多折的滤纸（7 × 5 cm）。^th 或 5^th 亲本转移至另一小瓶后的第一天（图3）。如果初始杂交获得的成虫数量不足，可再等待数天，收集不同日期设置的试管中羽化的个体。建议将实验安排在数个连续的日期内进行，以均衡工作量。

2. 双重交配实验

图4展示了在¹⁴中进行的双重交配实验所涉及的主要步骤。

1. 在第1天早晨，设置第一次交配。在进攻性实验中，Oregon-R雄蝇为首次交配的雄性。
   1. 使用吸虫器，为每个小瓶配置10只4-5日龄的白眼w¹¹¹⁸处女雌蝇和10只红眼Oregon-R naïve雄蝇。连续5天，每天设置2至3个小瓶。所需小瓶数量可根据可用个体数进行调整。让果蝇交配2小时。
   2. 丢弃Oregon-R雄蝇，使用吸虫器将每只雌蝇转移至新的小瓶中（图5）。可通过观察若干形态学差异进行性别鉴定（图2）。为每个小瓶正确贴上标签，并让雌蝇在瓶中停留2天（此后称为“v1”）。
2. 在第3天，设置第二次交配。雄蝇的选择及杂交组合的建立应随机进行，以尽量减少对任一实验型雄蝇的潜在偏倚。
   1. 在关灯前2小时，再次使用吸虫器将雌蝇转移至一个新的小瓶中。为新小瓶正确贴上标签（此后称为“v2”）。
   2. 向v2中引入三只5-6日龄、基因型相同的实验型雄蝇。
   3. 对每只雌蝇重复步骤2.2.1和2.2.2。
   4. 在第4天，于开灯前2小时（即不超过2.2.1操作后12小时），使用吸虫器丢弃雄蝇。
3. 在第6天，再次将每只雌蝇转移至另一个新小瓶中。为新小瓶正确贴上标签（此后称为“v3”）。
4. 在第10天，丢弃w¹¹¹⁸雌蝇。
5. 检查v2和v3中的子代。首次检查在雌蝇被引入v2（或v3）后13-15天进行，例如，在雌蝇首次开始于v2产卵后的第17天进行。第二次检查在首次检查后第17天准确进行。该时间范围设定了一个安全的时间上限，以确保同一小瓶中不会出现第二代果蝇。两次检查可防止过度拥挤，同时便于子代计数。
   1. 在第17天，检查v1，确认是否存在红眼子代；若无，则相应标记小瓶。若出现白眼子代，表明该雌蝇在初次交配时并非处女；若无子代，则表明其与参照雄蝇或实验雄蝇均未发生交配。
   2. 在第17天，对v2进行首次检查。使用CO₂麻醉v2中已羽化的子代，按眼色和性别进行分类。记录由第一只和第二只雄蝇所繁殖的子代数量。图6展示了每种交配方案子代中预期的表型。在本实验¹⁴中，仅雌性子代可明确归因于参照雄蝇或实验雄蝇的父系，因此仅能利用雌性子代的数据计算P₂。若使用其他遗传标记可明确判定雄性子代的父系，则可将两性子代的计数均用于后续计算。检查后丢弃子代，但保留v2小瓶以备第二次检查。
   3. 在第20天，对v2中新羽化的子代按步骤2.5.2操作，随后丢弃该小瓶。
   4. 在第20天，首次检查v3中羽化的子代，并遵循步骤2.5.2进行操作。
   5. 在第23天，对v3中新羽化的子代按步骤2.5.3操作。

注意 1：由于多次交配可能对 P 值产生膨胀效应（2.2.2 和 2.2.3），可将交配限制在特定时间段内。该时间段取决于所用雌性和雄性基因型相关的再次交配频率。夜间发生多次交配的概率尤其降低¹¹。

注意2：不要添加活酵母颗粒，因为当果蝇成虫数量较少时，这可能导致酵母过度生长而引发问题。

3. 数据分析

1. 记录的子代数量应进行适当整理，以便于直观检查，并利于使用合适的统计软件包进行高效分析（例如 JMP（来自SAS Institute）或免费的基于网页的工具（例如 http://vassarstats.net/).
2. 精子竞争能力。将 v2 和 v3 的计数相加。产生后代极少或无后代的雌蝇（例如 <10），在操作过程中死亡，或仅被两只雄性中的一只成功授精的个体被视为无信息量，将排除在后续所有统计分析之外（2.5.1 和 表2）。计算 P₂ 每位有信息量的雌性个体的评分。
3. 检验P是否存在统计学上的显著差异₂ 实验组雄性个体间的数值比较。可采用参数检验方法（例如 Tukey HSD 或非参数例如 Steel-Dwass 检验，具体选择取决于多种因素，包括 P 值分布的偏度₂ 值以及方差与均值之间的依赖关系。角度转换通常应用于比例数据，例如 P₂ 在使用参数检验之前 ³¹.
4. 交配率差异（可选）。针对每种实验型雄性，分别计算与两只雄性均交配过的雌性数量，以及仅与第一只雄性交配的雌性数量（在进攻实验中为参照雄性，在防御实验中为实验雄性）。采用双尾 Fisher 精确检验（可从 http://www.langsrud.com/fisher.htm），确定两种实验型雄性个体之间是否存在统计学上的显著差异。
5. 性别比例（可选）。针对每只实验雄性个体，使用卡方检验确定每只雌性后代的性别比例是否偏离预期的1:1比例。

结果

表2总结了两项进攻性实验（实验1和实验2）中的一些显著特征，其中比较了具有和不具有功能性Sdic基因簇的D. melanogaster实验雄蝇（分别为I型和II型）¹⁴。在考虑了部分重复实验中遇到的不同发生率后，发现58–83%的雌蝇具有信息价值，因此可利用其后代的父权计数来计算P₂。非参数检验的结果一致表明，与具有完整Sdic基因簇的雄蝇（I型）相比，缺乏该基因簇的雄蝇（II型）精子竞争能力较低¹⁴。该模式在多次重复的进攻性实验中均可重现。在并行进行的防御性实验中也观察到类似趋势，但未达到统计学显著性（未显示）。重要的是，交配率无差异（步骤3.4）排除了雄性基因型影响雌性再交配行为的可能性¹⁴。

进攻行为检测

讨论

我们已经描述了实验设计，用于在受控的双重交配实验中评估遗传上不同的黑腹果蝇（D. melanogaster）雄性对后代相对贡献的差异^7,8。该设计是在一个假定影响精子竞争能力的遗传因子背景下进行的，并已在进攻性检测中进行了说明，尽管类似的程序也适用于防御性检测（图1）。该实验设计可进行修改，以检验亲权成功率的其他方面，例如雌性基因型的影响³²。可纳入的一种修改示例是对雌性与第二只雄性交配过程的直接监测。此外，还需注意的是，实验雄性类型的相对表现依赖于所使用的测试雄性和雌性的基因型，因此不能将其外推至涉及不同测试雄性和雌性的其他情境^10,32,33。

由于所需个体（处女雌性和未经交配的雄性）的收集以及子代表型的统计工作较为耗时，应根据受过良好训练的人员数量调整需评估的不同实验雄性类型的数量。此处所述的实验可由一人在六周内轻松完成。事实上，最多可同时评估五种不同的实验雄性类型。唯一需要采取的额外措施是延长初始大规模交配的设置时间，以及延长收集所需个体的时间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琥珀色乳胶管	VWR	62996-473	内径 1/4 英寸，壁厚 1/6 英寸
1 ml 带刻度 XL 滤芯吸头	USA Scientific	1126-7810	可使用任意 1 ml 移液器吸头，但半透明且较长的吸头更适合作为果蝇接收器。若使用带滤芯吸头，需在剪除吸头末端后，用针头戳出并丢弃滤芯
封口膜	Sigma	P-7793
网状织物			薄而光滑
体视显微镜	Leica	S6D
CO2 储气罐	Airgas	CD-50	若无 CO2，可使用 FlyNap（Carolina Biological Supply Company）作为替代
FlyStuff 脚踏阀完整系统	Genesee Scientific	59-121C	若使用 FlyNap 则无需此设备
塑料培养瓶	Genesee Scientific	32-109	配有可重复使用的纸板托盘，用于盛放培养瓶
棉球	Fisher Scientific	AS-212
活性干酵母	Red Star		普通杂货店有售
Sharpie 记号笔			可用不同颜色标记不同基因型