评估精子竞争能力差异的方法 果蝇

摘要

通过双交配实验可以确定具有不同基因型的黑腹果蝇（Drosophila）雄性之间精子竞争能力的差异。每项实验均涉及一个待测雄性和一个参照雄性。后代中易于识别的标记可用来推断每个雄性所繁殖后代的比例。

摘要

同种雄性个体之间为获得卵子受精权而进行的竞争是性选择的机制之一， 即 作用于最大化成功交配事件数量而非最大化生存率和存活力的自然选择 ¹精子竞争是指雄性个体与同一雌性交配后，其精子之间为实现受精而产生的竞争 ²，即它们的精子在时间和空间上恰好相遇。这一现象已在多种动植物中被报道 ³例如，野外捕获的 D. melanogaster 雌性通常含有来自2-3只雄性的精子 ⁴精子被储存在储存能力有限的特化器官中，这可能导致来自不同雄性的精子之间发生直接竞争。 ^2,5.

通过实验室中受控的双重交配实验，已对不同目标雄性（实验雄性类型）的精子竞争能力进行了比较^6,7。简而言之，同一只雌性依次与两种不同的雄性交配，其中一只是实验雄性，另一只是用于交叉交配的参照雄性。随后，对其他实验雄性类型也采用相同的交配方案，从而通过一个共同的参照实现对其精子竞争能力的间接比较。利用遗传标记可确定由实验雄性和参照雄性各自父系的子代所占比例，进而通过简单的数学表达式估算精子竞争能力^7,8。此外，可根据实验雄性是先交配还是后交配，分别在两种不同情境下评估其精子竞争能力（分别为防御试验和进攻试验）⁹，这两种情形被认为反映了不同的竞争能力特征。

本文描述了一种用于探究果蝇（D. melanogaster）精子竞争能力现象背后不同遗传因素作用的方法。

引言

自从杰夫·帕克（Geoff Parker）指出昆虫中普遍存在精子竞争现象及其进化意义以来 ²，大量研究在 果蝇 以及其他物种已在多个不同层面尝试揭示这一现象。一些研究兴趣领域包括其在自然种群中的变异调查 ^9,10，其遗传结构及潜在遗传因素的相关性 ^11-14及其在推动两性间共同进化中的作用 ^15,16。在 D. melanogaster 雌性, 受限于特化的精子储存器官容量，即一对受精囊和一个精囊 ^6,17，有助于不同雄性个体精子之间的竞争。交配过程中约有1,500个精子被转移到雌性体内，但上述器官仅能容纳约500个精子 ^18,19在实验室中，通过受控的双重交配实验，将参照雄性与一个或多个待测雄性进行交配，已广泛用于评估精子竞争能力。 ^7,8.

精子竞争能力通过双交配实验中实验雄性个体所生育的后代占总后代的比例来评估， 即 来自实验组雄性和参照组雄性的精子。精子竞争能力包含两个组分，每一组分通过独立的实验进行评估。在进攻性实验中，评估实验组雄性精子取代第一只雄性精子的能力， 即 参考雄性个体的受精能力进行评估。相反，在防御实验中，则评估实验雄性精子抵抗被取代的能力，或降低参考雄性精子受精成功率的能力。根据实验类型（防御或进攻），通过....

方案

应先进行小规模实验，以熟悉整个实验流程。

1. 收集处女雌蝇和未经交配的雄蝇

所述实验的最简版本包括四种初始杂交类型，涉及以下成虫组合：a) w¹¹¹⁸ 个体，用于收集处女雌蝇；b) Oregon-R 个体，用于收集未经交配的参照雄蝇；c) P{sw} 纯合雄蝇与携带 Sdic 基因野生型结构的对照品系处女雌蝇杂交，以获得未经交配的实验组雄蝇（I型）；以及 d) P{sw} 纯合雄蝇与携带 Sdic-sw 缺失突变的处女雌蝇杂交，以获得携带 Sdic-sw 缺陷的未经交配实验组雄蝇（II型）。

1. 设置多个小瓶，每瓶放入8-10只雌蝇和5只雄蝇。让雌蝇产卵，并每隔3-5天将成虫转移至新的小瓶中。必要时可使用培养瓶代替小瓶，且始终使用新鲜培养基。所需小瓶的数量取决于实验中所涉及的雄蝇类型数量以及为检测差异而预估所需的个体数量。表1每瓶超过10只雌蝇可能导致幼虫生长期间过于拥挤，进而引起子代繁殖力的变异。将培养瓶置于温度控制的培养箱中，25 °C保存。
2. 从第11天开始收集处女雌蝇和未经交配的雄蝇^th 和 12^th 在完成初始杂交后，需要一定的等待时间。该等待时间因温度而异；较低的温....

结果

表2总结了两项进攻性实验（实验1和实验2）中的部分显著特征，其中比较了具有和不具有功能性Sdic基因簇的D. melanogaster实验雄蝇（分别为I型和II型）¹⁴。在考虑了部分重复实验中遇到的不同发生率后，发现58–83%的雌蝇具有信息价值，因此可利用其后代的父系计数来计算P₂。非参数检验的结果一致表明，与具有完整Sdic基因簇的雄蝇（I型）相比，缺乏该基因簇的雄蝇（II型）精子竞争能力较低¹⁴。该模式在多次重复的进攻性实验中均可重现。在平行进行的防御性实验中也观察到类似趋势，但差异无统计学意义（未显示）。重要的是，交配率无差异（步骤3.4）排除了雄性基因型影响雌性再次交配行为的可能性¹⁴。

进攻行为检测

讨论

我们已经描述了实验设计，用于在受控的双重交配实验中评估遗传上不同的黑腹果蝇（D. melanogaster）雄性对后代相对贡献的差异^7,8。该设计是在一个假定影响精子竞争能力的遗传因子背景下进行的，并已在进攻性检测中进行了说明，尽管类似的程序也适用于防御性检测（图1）。该实验设计可进行修改，以检验亲权成功率的其他方面，例如雌性基因型的影响³²。可纳入的一种修改示例是对雌性与第二只雄性交配过程的直接监测。此外，还需注意的是，实验雄性类型的相对表现依赖于所使用的测试雄性和雌性的基因型，因此不能将其外推至涉及不同测试雄性和雌性的其他情境^10,32,33。

由于所需个体（处女雌性和未经交配的雄性）的收集以及子代表型的统计工作较为耗时，应根据受过良好训练的人员数量调整需评估的不同实验雄性类型的数量。此处所述的实验可由一人在六周内轻松完成。事实上，最多可同时评估五种不同的实验雄性类型。唯一需要采取的额外措施是延长初始大规模交配的设置时间，以及延长收集所需个体的时间。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琥珀色乳胶管	VWR	62996-473	内径 1/4 英寸，壁厚 1/6 英寸
1 ml 带刻度 XL 滤芯吸头	USA Scientific	1126-7810	可使用任意 1 ml 移液器吸头，但半透明且较长的吸头更适合作为果蝇接收器。若使用带滤芯吸头，需在剪除吸头末端后，用针头戳出并丢弃滤芯
封口膜	Sigma	P-7793
网状织物			薄而光滑
体视显微镜	Leica	S6D
CO2 储气罐	Airgas	CD-50	若无 CO2，可使用 FlyNap（Carolina Biological Supply Company）作为替代
FlyStuff 脚踏阀完整系统	Genesee Scientific	59-121C	若使用 FlyNap 则无需此设备
塑料培养瓶	Genesee Scientific	32-109	配有可重复使用的纸板托盘，用于盛放培养瓶
棉球	Fisher Scientific	AS-212
活性干酵母	Red Star		普通杂货店有售
Sharpie 记号笔			可用不同颜色标记不同基因型