在蜜蜂模型中获取衰老减缓、加速和逆转的样本

摘要

在蜜蜂工蜂中，衰老取决于社会行为而非实际年龄。本文展示了如何获得具有显著不同衰老模式的工蜂类型，并对其细胞衰老进行分析。

摘要

高度社会性动物的群体中，亲缘关系密切的个体之间存在显著的寿命差异。在社会性昆虫中，蜜蜂是研究社会因素如何解释寿命和衰老可塑性的最佳模型。

蜜蜂的工蜂等级包括哺育蜂和采集蜂，前者负责照料幼虫，后者负责采集花蜜和花粉。先前的研究表明，与哺育蜂相比，采集蜂的大脑功能和飞行表现衰老得更快。然而，当采集蜂重新转为执行哺育任务时，其大脑功能可以恢复。这种加速衰老与逆转衰老的功能模式与代谢资源水平的变化、蛋白质丰度的改变以及免疫功能相关。卵黄原蛋白是一种在激素调控和细胞防御中具有适应性功能的卵黄蛋白，可能作为调控工蜂不同衰老动态网络中的一个主要调节因子。

本文介绍了如何监测和操控护士蜂与采集蜂的出现过程，包括将通常寿命较短的采集蜂逆转为寿命较长的护士蜂。我们展示的代表性结果说明了在实验条件下，相同日龄的个体如何分化为采集蜂和护士蜂。我们以实例说明了如何验证采集蜂行为逆转回护士蜂的过程。最后，我们展示了如何通过检测脂褐素（一种普遍的衰老生物标志物）的累积情况来评估不同的细胞衰老程度。

为了研究可能连接社会影响与衰老可塑性的机制，本方案提供了一套标准化的工具，用于获取相关样本材料，并提高未来研究之间的数据可比性。

引言

高度社会性动物复杂的群体结构依赖于繁殖型个体与非繁殖型辅助个体之间的相互作用，其中辅助个体通常为具有不同社会任务行为的工蜂或工鼠。在不同类型的工蜂或工鼠中，特定的生理适应性使其表现出不同的同胞照料行为，同时也与极端的寿命差异密切相关。蜜蜂和鼹形鼠是研究社会性如何与加速、可忽略或逆转衰老模式相关联的最佳动物模型^1-3。

在蜜蜂群体中，一只产卵蜂王由成千上万的工蜂协助，这些工蜂负责照料幼虫、采集食物，并参与守卫、温度调节或卫生行为⁴。这些工蜂包括寿命极短的采集蜂、寿命中等的哺育蜂以及寿命最长的越冬蜂（diutinus）。然而，个体并不永久固定于某一类工蜂类型，而是表现出灵活的行为发育过程：它们会从一种社会任务转变为另一种（“时间型级”）。初羽化蜜蜂可转变为照料幼虫的哺育蜂，最终可能再转变为外出采集的工蜂。但初羽化的巢内蜂也可转化为寿命最长的越冬蜂，而短命的采集蜂甚至能逆转为通常寿命较长的哺育蜂。具有极端寿命（越冬蜂）和中等寿命（哺育蜂）的工蜂拥有发育良好的食物合成与储存器官，并储备丰富的资源，而短命的采集蜂则不具备这些特征（综述见^1,5）。然而，有关卵黄蛋白的研究表明，个体寿命的调控机制超出了个体资源平衡的简单变化。这种卵黄蛋白在不育的工蜂级型中具有多种适应性功能，例如蜂王浆的合成⁶、激素调控⁷、免疫功能⁸以及抗氧化防御^9....

方案

1. 将衰老与时间年龄分离

本部分描述双队列蜂群的建立方法，该蜂群由一个具有相同日历年龄的已标记个体队列（“单一年龄队列”）和一个巢内工蜂队列组成。单一年龄队列中同龄的个体最终会分化为不同类型的工蜂，并表现出不同的衰老动态——其中包括功能衰退较慢的哺育蜂和功能衰退加速的采集蜂。所有操作步骤均以一个实验蜂群为例进行说明。然而，我们建议至少设置两个蜂群作为重复实验，以便控制蜂群间差异带来的影响（双重复设计）。

1. 准备双龄蜂群的蜂箱：准备一个普通蜂箱，其中放入两个带有蜂蜜的食物巢脾、另一个带有花粉的食物巢脾以及两个空巢脾。确保找到一只已交配的蜂王以及一个拥有超过 3,000 只巢内工蜂的供体蜂群。这两者将在后续步骤中引入（1.3）。
2. 获取并标记具有相似日龄的个体：收集即将羽化的封盖蛹脾。每组重复实验需收集总计约 3,000–5,000 个封盖蛹室的巢脾。每组重复实验应从至少三个不同的蜂群来源中均衡取样，以避免母本基因型（蜂群来源）分布偏差。
   1. 将蛹脾置于设定为 34 °C、相对湿度为 60–70% 的孵化箱中。确保以适当方式存放蛹脾，防止羽化的蜜蜂逃逸。
   2. 让蜜蜂羽化两天，并在胸部用小点颜料标记（例如 Uni POSCA，Mitsubishi Pencil Co. Ltd.）。该标记可识别单一日龄蜂群（羽化日）的个体，并将其与其他重复蜂群区分开。....

结果

第1和第2部分详细说明了如何获得实验组，以研究单一年龄队列群体中加速、减缓和逆转衰老的特征。为了监测伴随正常个体发育过程的工蜂类型分化，我们对6个蜂群进行了采集蜂数量（“入口计数”）评估（图1，参见第1部分）。图中显示，个体通常在超过10日龄之前，不会出现从哺育蜂向采集蜂状态的显著转变。不同蜂群间的采集蜂数量在采集行为起始时间上表现出明显差异，且每个蜂群内部也存在显著的逐日波动。除各蜂群特有的人口统计学因素（如不同的幼虫负荷）外，大量变异可归因于天气条件的变化（图1中以红色标记的时间点）。因此，建议密切监测采集活动动态，以在实验过程中优化标记和样本采集工作。

通过检查引入采集蜂来源蜂群的育雏巢脾（见步骤 2.2 和 2.3），可验证从觅食任务逆转回哺育任务的逆向个体发育过程（第 2 节）。三个重复实验中，图 2A、C 和 E 显示了巢脾在引入采集蜂来源蜂群之前的状况，图 2B、D 和 F 显示了相应巢脾移出后的状况。新封盖的子脾区域、健康的幼虫以及.......

讨论

我们在此采用先前已描述的方法^{8,16,17,19,20}，并将这些方法整合为一个统一的工作流程，以促进对蜜蜂可塑性衰老的研究。我们的目标是为该领域的新手科学家提供一套标准化的工具，用于获取相关样本材料，并提高不同研究团队之间实验的可重复性。尽管我们的操作流程已简化，且无需如早期描述中所需的特殊设备（例如与⁸相比），但仍建议采取若干预防措施，这些措施汇总如下。

解偶联衰老与时间年龄 最关键的方面是在初步确认采集行为时避免误认采集蜂（2^nd 标记）。因此，在需要监测采集蜂（“入口计数”）或对其进行标记时，应严格避开每日发生定向飞行的时段。在这些时段内，大量处于前采集阶段的蜜蜂会离开或返回蜂巢。这些蜜蜂并不具备成熟采集蜂典型的生理特征，而是通过明显可识别的环形飞行模式，构建蜂巢周围环境的空间地图。²¹.

尽管大多数蜜蜂在2周龄及以上时才会转变为觅食行为，但在非常年轻的日龄（图1）已可观察到零星的觅.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿皮丰达	Südzucker AG，德国曼海姆/奥克斯富特
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	158127
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417
甘油	Merck	1.04094.1000