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方法文章

在蜜蜂模型中获取衰老减缓、加速和逆转的样本

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DOI：

10.3791/50550

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2013年8月29日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Biotechnology and Food Science, Norwegian University of Life Sciences, 2School of Life Sciences, Arizona State University

本文内容

摘要

在蜜蜂工蜂中，衰老取决于社会行为而非实际年龄。本文展示了如何获得具有显著不同衰老模式的工蜂类型，并对其细胞衰老进行分析。

摘要

高度社会性动物的群体中，亲缘关系密切的个体之间存在显著的寿命差异。在社会性昆虫中，蜜蜂是研究社会因素如何解释寿命和衰老可塑性的最佳模型。

蜜蜂的工蜂等级包括哺育蜂和采集蜂，前者负责照料幼虫，后者负责采集花蜜和花粉。先前的研究表明，与哺育蜂相比，采集蜂的大脑功能和飞行表现衰老得更快。然而，当采集蜂重新转为执行哺育任务时，其大脑功能可以恢复。这种加速衰老与逆转衰老的功能模式与代谢资源水平的变化、蛋白质丰度的改变以及免疫功能相关。卵黄原蛋白是一种在激素调控和细胞防御中具有适应性功能的卵黄蛋白，可能作为调控工蜂不同衰老动态网络中的一个主要调节因子。

本文介绍了如何监测和操控护士蜂与采集蜂的出现过程，包括将通常寿命较短的采集蜂逆转为寿命较长的护士蜂。我们展示的代表性结果说明了在实验条件下，相同日龄的个体如何分化为采集蜂和护士蜂。我们以实例说明了如何验证采集蜂行为逆转回护士蜂的过程。最后，我们展示了如何通过检测脂褐素（一种普遍的衰老生物标志物）的累积情况来评估不同的细胞衰老程度。

为了研究可能连接社会影响与衰老可塑性的机制，本方案提供了一套标准化的工具，用于获取相关样本材料，并提高未来研究之间的数据可比性。

引言

高度社会性动物复杂的群体结构依赖于繁殖型个体与非繁殖型辅助个体之间的相互作用，其中辅助个体通常为具有不同社会任务行为的工蜂或工鼠。在不同类型的工蜂或工鼠中，特定的生理适应性使其表现出不同的同胞照料行为，同时也与极端的寿命差异密切相关。蜜蜂和鼹形鼠是研究社会性如何与加速、可忽略或逆转衰老模式相关联的最佳动物模型1-3。

在蜜蜂群体中，一只产卵蜂王由成千上万的工蜂协助，这些工蜂负责照料幼虫、采集食物，并参与守卫、温度调节或卫生行为4。这些工蜂包括寿命极短的采集蜂、寿命中等的哺育蜂以及寿命最长的越冬蜂（diutinus）。然而，个体并不永久固定于某一类工蜂类型，而是表现出灵活的行为发育过程：它们会从一种社会任务转变为另一种（“时间型级”）。初羽化蜜蜂可转变为照料幼虫的哺育蜂，最终可能再转变为外出采集的工蜂。但初羽化的巢内蜂也可转化为寿命最长的越冬蜂，而短命的采集蜂甚至能逆转为通常寿命较长的哺育蜂。具有极端寿命（越冬蜂）和中等寿命（哺育蜂）的工蜂拥有发育良好的食物合成与储存器官，并储备丰富的资源，而短命的采集蜂则不具备这些特征（综述见1,5）。然而，有关卵黄蛋白的研究表明，个体寿命的调控机制超出了个体资源平衡的简单变化。这种卵黄蛋白在不育的工蜂级型中具有多种适应性功能，例如蜂王浆的合成6、激素调控7、免疫功能8以及抗氧化防御9。

功能衰退（衰老）的模式反映了工蜂寿命的差异，这一点在嗅觉以及其他脑功能或运动功能中已有明确证据10-13。具体而言，仅在外勤采食两周后，学习功能即出现显著下降，这与外勤蜂的死亡率进展相似14；相比之下，长寿的越冬蜂则未检测到明显的功能衰退（衰老可忽略）15。

为了识别灵活衰老的分子特征，我们改进了已建立的实验范式，以实现对衰老类型转变的监测和操控8,16,17。实验1详细说明了如何获取样本，以便将日历年龄和工蜂类型特异性社会行为对衰老的影响区分开来。实验2描述了将衰老进程加快的采集蜂逆转为衰老进程减缓的哺育蜂的过程。实验3提供了一种通过解剖学定量分析细胞衰老的既定生物标志物（脂褐素）来探究细胞衰老效应的方法18。

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方案

1. 将衰老与时间年龄分离

本部分描述双队列蜂群的建立方法，该蜂群由一个具有相同日历年龄的已标记个体队列（“单一年龄队列”）和一个巢内工蜂队列组成。单一年龄队列中同龄的个体最终会分化为不同类型的工蜂，并表现出不同的衰老动态——其中包括功能衰退较慢的哺育蜂和功能衰退加速的采集蜂。所有操作步骤均以一个实验蜂群为例进行说明。然而，我们建议至少设置两个蜂群作为重复实验，以便控制蜂群间差异带来的影响（双重复设计）。

  1. 准备双龄蜂群的蜂箱：准备一个普通蜂箱，其中放入两个带有蜂蜜的食物巢脾、另一个带有花粉的食物巢脾以及两个空巢脾。确保找到一只已交配的蜂王以及一个拥有超过 3,000 只巢内工蜂的供体蜂群。这两者将在后续步骤中引入（1.3）。
  2. 获取并标记具有相似日龄的个体：收集即将羽化的封盖蛹脾。每组重复实验需收集总计约 3,000–5,000 个封盖蛹室的巢脾。每组重复实验应从至少三个不同的蜂群来源中均衡取样，以避免母本基因型（蜂群来源）分布偏差。
    1. 将蛹脾置于设定为 34 °C、相对湿度为 60–70% 的孵化箱中。确保以适当方式存放蛹脾，防止羽化的蜜蜂逃逸。
    2. 让蜜蜂羽化两天，并在胸部用小点颜料标记（例如 Uni POSCA，Mitsubishi Pencil Co. Ltd.）。该标记可识别单一日龄蜂群（羽化日）的个体，并将其与其他重复蜂群区分开。
  3. 建立包含已识别单一日龄蜂群的双龄蜂群：在年轻蜜蜂标记完成当天，从供体蜂群中采集约 2,500–3,000 只未标记的巢内工蜂（参见讨论部分第 1 节），并将这些未标记蜜蜂加入此前准备好的蜂箱中（见步骤 1.1）。这些个体将构成未识别的巢内工蜂群体。
    1. 引入蜂王，并先将其关入市售蜂王笼中。用可食用糖条（例如 Apifonda，Südzucker AG，Mannheim/Ochsenfurt，德国）封住蜂王笼，使工蜂缓慢释放蜂王。
    2. 加入新羽化并已标记的蜜蜂，这些蜜蜂将构成单一日龄蜂群。这些是实验中唯一被标记的个体，也是后续所有步骤的关注群体。
  4. 监测采集行为的起始并标记采集蜂：为评估单一日龄蜂群中哺育蜂向采集蜂转变的起始时间与动态，每隔一天对每个蜂群的采集活动进行一次种群动态监测。从蜂群建立后第五天开始计数（图 1）。
    1. 在固定时间段内，对归巢的采集蜂总数（入口计数）进行 3 次、每次 20 分钟的观察计数。注意避免在蜜蜂定向飞行期间进行计数（参见讨论）。
    2. 当入口计数显示采集活动显著开始（>100 次/天）时，开始标记采集蜂。具体做法是：对单一标记的采集蜂（即单一标记个体）在完成首次采集飞行归巢后，追加第二个颜料标记。该标记将标明采集行为的起始日，以便后续确定每只采集蜂的采集起始日龄。
    3. 每日持续标记，直至获得足够数量的标记个体。为估算所需标记数量，通常在采集活动持续约 14 天后，预计回收率不超过 5–10%。
  5. 取样：由于所有初始标记的蜜蜂具有相似的日龄，因此可在采集蜂完成 ≥14 天采集任务时，同步采集年龄匹配的哺育蜂与老年采集蜂。
    1. 在蜂箱内采集单一标记的哺育蜂，并通过哺育行为识别（将头部伸入开放的幼虫巢房中进行喂食和清洁）。
    2. 在每日采集活动开始前，于蜂箱内采集双重标记的采集蜂。
    3. 将蜜蜂放入提供充足通风的笼子（管、盒）中，保持黑暗状态直至进一步处理。或者，为进行转录组、表观遗传或蛋白质组研究，可直接将蜜蜂在液氮中速冻。从所有测试组及重复蜂群中采集数量均衡的个体。

2. 通过改变蜂群的人口结构使快速衰老的工蜂逆转为缓慢衰老的工蜂

本部分详细说明如何将具有加速衰老特征的工蜂（采集蜂）逆转为具有延缓衰老特征的工蜂（哺育蜂）。当采集蜂发现蜂群中缺乏通常负责照料幼虫的哺育蜂时，便会诱导发生此类行为逆转。逆转实验操作将一个蜂群重复样本分为两个蜂箱：一个蜂箱包含哺育蜂组分（“哺育蜂来源”），另一个蜂箱包含采集蜂组分（“采集蜂来源”）。在成功实现逆转后，可在同一龄期蜂群中研究衰老可塑性及逆转衰老的可能表现，研究对象包括发生逆转的工蜂、持续作为采集蜂的工蜂、持续作为哺育蜂的工蜂以及新招募的采集蜂。与之前相同，实验关注的重点群体为已标记的同龄蜂群个体，而非未标记的巢内蜂群体。

  1. 准备： 按照前文所述方法准备包含保育蜂（单标记）和采集蜂（双标记）的重复蜂群。每个重复蜂群中用于返幼实验的标记采集蜂数量不得少于500只，以确保返幼过程结束后有足够数量的个体可供回收分析。
    1. 在逆转后为安全识别测试组，必须在逆转前将原始蜂群中的全部采集蜂标记完毕。以下程序以一个重复组为例进行描述。
    2. 在恢复前一日，为采集蜂来源的蜂群额外准备一个蜂箱（见步骤1.1）。从供体蜂群中选取两只蜂王和两张子脾。在转移至实验蜂群前，将这些子脾上的所有成年工蜂刷除。其中一只笼养蜂王（见步骤1.3）和一张子脾将用于替换原始蜂箱中的蜂王和子脾；另一组蜂王与子脾将于次日用于新蜂箱。建议对原始蜂箱和新蜂箱均采用相似的新子脾和异源蜂王分配方式，以确保分离的采集蜂与哺育蜂均同等经历蜂箱信号（“蜂箱气味”）的变化。
  2. 逆转 清晨，在重组前立即向将要接收采集蜂组分的新蜂箱中加入围禁蜂王和带幼虫的巢脾。等待至采集活动高峰期开始时，将带有标记采集蜂和哺育蜂的原始蜂群移至距离原位置至少100米以外处。
    1. 在原位置为仅含幼虫和蜂王的采集蜂源蜂箱设置新蜂箱。
    2. 采集蜂将离开移走的原始蜂巢箱，返回原始位置。让采集蜂返回原始位置持续2小时，以实现采集蜂群与巢内蜂群近乎完全的分离。
    3. 然后，为终止分离，封闭原有的、现为“护理蜂来源”的蜂巢，并将其转移至至少3公里以外的养蜂场。
  3. 蜂群维护与监测以实现成功的社会任务逆转： 定期检查实验蜂箱，观察幼虫是否健康且巢房处于开放状态。
    1. 在菌落操作后的最初几天内，更换无人照料和已死亡的幼虫，以降低潜在的病原体负荷。
    2. 为了验证采集蜂来源蜂群中的成功逆分化，在引入这些蜂脾之前拍摄子脾照片，之后在蜂脾被替换时或逆分化实验结束时再次拍照图2）。先前无封盖幼虫且存在开放的活体幼虫的区域，是采集蜂衍生蜂群中哺育活动的可靠标志。
  4. 采样： 社会地位逆转所伴随的生理效应可在采集蜂与哺育蜂分离后3-8天内被检测到。
    1. 我们建议对所有测试组进行取样， 即 返巢的工蜂和持续外出采集的采集蜂（采集蜂来源蜂群），以及持续哺育幼虫的哺育蜂和新招募的采集蜂（哺育蜂来源蜂群），在逆转处理开始后第8天。
    2. 按照步骤1.5所述采集样品。

3. 通过脂褐素定量分析工蚁类型特异性的细胞衰老模式

脂褐素是细胞衰老的普遍生物标志物。作为一种内在积聚产物，脂褐素具有特异性的自发荧光（最大发射波长max = 530–650 nm），可用于检测18。

  1. 解剖与固定：将蜜蜂置于冰上冷却至不动，取出并解剖获取所需组织样本。
    1. 将样本转移至固定液（4%多聚甲醛溶于磷酸盐缓冲液，PBS；pH 7.2）中，于4 °C下孵育过夜。
    2. 用PBS洗涤样本3次。
  2. 组织处理与封片：将组织样本切成厚度不超过40 μm的切片，例如使用振动切片机，e.g. Leica VT 1000S（Leica Biosystems, Nussloch, Germany）。
    1. 为进行透明处理，将组织切片在30%甘油（PBS）中孵育过夜，再在50%甘油（PBS）中孵育2小时。
    2. 将切片置于载玻片上，用50%甘油（PBS）封片。如需长期保存，应用指甲油密封盖玻片。
  3. 图像采集：为检测脂褐素，建议使用激光扫描共聚焦显微镜，配备波长λ = 514、561 nm或相近的激发激光，并将检测器带宽设置为570–650 nm。
    1. 为更准确识别脂褐素，可增加第二个通道，同时在较短波长光谱下进行扫描（激发波长 = 405 nm；发射波长 = 410–450 nm）。较长波长通道将显示颗粒状脂褐素，同时也显示由于气管及其他非颗粒结构自发荧光引起的非特异性“背景”信号。而第二个较短波长通道仅显示非特异性自发荧光，不显示脂褐素。因此，通过比较两个通道的信号，仅在其中一个通道中显示具有脂褐素特异性荧光的颗粒，有助于脂褐素的识别。
    2. 为获取高分辨率图像，应使用放大倍数为40X或更高的物镜，优选数值孔径（NA）为1.25或更高。扫描图像堆栈的尺寸约为100 × 100 × 10 μm3。每个个体和组织样本均需由多个图像堆栈代表。
    3. 为减少由技术差异引起的个体内和个体间变异，应始终保持激光功率和检测器灵敏度恒定。
    4. 为减少每日技术差异带来的偏差，在每次扫描会话中应对所有实验组均扫描相同数量的样本。
  4. 图像处理：使用具备高级显微图像堆栈处理模块的软件包，例如ImageJ（美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州，美国，http://imagej.nih.gov/ij/）。
    1. 对每个三维图像堆栈生成二维最大投影图像。
    2. 应用适度核大小的高斯滤波器，以减弱高频噪声，同时保留脂褐素颗粒尺度的结构。
    3. 合并两个颜色通道，以方便脂褐素的识别（参见步骤3.2）。
  5. 图像分析：确保执行定量分析的操作者对样本所属实验组身份保持盲态。
    1. 对所有图像，首先选择一个覆盖相关结构且与其他图像中ROI尺寸相似的兴趣区域（ROI）。
    2. 然后在每个ROI中选择预定数量的脂褐素颗粒。在ROI内选择脂褐素颗粒时，应用以下规则可减少主观偏差。
      1. 选择一个一致的位置作为第一个颗粒的起始点。例如，可选择ROI的最左侧边缘，距离该边缘最近的颗粒始终作为第一个选择。
      2. 依次选择距离上一个已选颗粒最近的下一个邻近颗粒（最近邻法）。
      3. 在选择下一个邻近颗粒时，仅朝一个方向移动，例如始终在上一个选择的右侧搜索。此规则可防止选择过程被密集颗粒簇所主导。
      4. 完成选择后，通过勾勒并测量每个脂褐素颗粒的面积来评估其大小。使用适当的统计检验方法比较不同实验组个体之间的差异。

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结果

第1和第2部分详细说明了如何获得实验组，以研究单一年龄队列群体中加速、减缓和逆转衰老的特征。为了监测伴随正常个体发育过程的工蜂类型分化，我们对6个蜂群进行了采集蜂数量（“入口计数”）评估（图1，参见第1部分）。图中显示，个体通常在超过10日龄之前，不会出现从哺育蜂向采集蜂状态的显著转变。不同蜂群间的采集蜂数量在采集行为起始时间上表现出明显差异，且每个蜂群内部也存在显著的逐日波动。除各蜂群特有的人口统计学因素（如不同的幼虫负荷）外，大量变异可归因于天气条件的变化（图1中以红色标记的时间点）。因此，建议密切监测采集活动动态，以在实验过程中优化标记和样本采集工作。

通过检查引入采集蜂来源蜂群的育雏巢脾（见步骤 2.2 和 2.3），可验证从觅食任务逆转回哺育任务的逆向个体发育过程（第 2 节）。三个重复实验中，图 2A、C 和 E 显示了巢脾在引入采集蜂来源蜂群之前的状况，图 2B、D 和 F 显示了相应巢脾移出后的状况。新封盖的子脾区域、健康的幼虫以及...

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讨论

我们在此采用先前已描述的方法8,16,17,19,20，并将这些方法整合为一个统一的工作流程，以促进对蜜蜂可塑性衰老的研究。我们的目标是为该领域的新手科学家提供一套标准化的工具，用于获取相关样本材料，并提高不同研究团队之间实验的可重复性。尽管我们的操作流程已简化，且无需如早期描述中所需的特殊设备（例如与8相比），但仍建议采取若干预防措施，这些措施汇总如下。

解偶联衰老与时间年龄 最关键的方面是在初步确认采集行为时避免误认采集蜂（2nd 标记）。因此，在需要监测采集蜂（“入口计数”）或对其进行标记时，应严格避开每日发生定向飞行的时段。在这些时段内，大量处于前采集阶段的蜜蜂会离开或返回蜂巢。这些蜜蜂并不具备成熟采集蜂典型的生理特征，而是通过明显可识别的环形飞行模式，构建蜂巢周围环境的空间地图。21.

尽管大多数蜜蜂在2周龄及以上时才会转变为觅食行为，但在非常年轻的日龄（图1）已可观察到零星的觅...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

我们感谢奥斯曼·卡夫塔诺格鲁（Osman Kaftanoglu）在拍摄过程中提供的有益建议和帮助。我们感谢匿名审稿人提出的深刻意见。本研究得到了挪威研究理事会（资助号 180504、191699 和 213976）、玛丽·居里/第七框架计划（项目编号 238665）、美国国家衰老研究所（资助号 NIA P01 AG22500）以及佩韦慈善信托基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿皮丰达Südzucker AG，德国曼海姆/奥克斯富特
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP4417
甘油Merck1.04094.1000

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