使用多光谱成像流式细胞术对碳纳米管在细胞中的定位和相对定量

摘要

在这项研究中，主要目的是监测碳纳米管 （CNT） 的细胞摄取和最终胞吐作用。从这个角度来看，我们在这里提出了一种使用多光谱成像流式细胞术的独特方法，允许在统计相关数量的细胞中定量和定位 CNT。

摘要

碳基纳米材料，如碳纳米管 （CNT），属于这种类型的纳米颗粒，很难与富含碳的细胞结构区分开来，事实上，仍然没有定量方法来评估它们在细胞和组织水平上的分布。我们在这里提出的是一种创新方法，允许使用多光谱成像流式细胞仪 （ImageStream， Amnis） 检测和定量细胞中的 CNT。这种新开发的设备集成了高通量细胞和高分辨率成像，从而直接为每个流动中的细胞提供图像，因此具有统计相关性的图像分析。每个细胞图像都是在明场 （BF）、暗场 （DF） 和荧光通道上采集的，可以分别访问每个细胞的光吸收、光散射和荧光的水平和分布。然后，分析包括对每张图像以及为实验的每种条件采集的 7,000-10,000 个细胞进行逐像素比较。由于 CNT 的一些特殊固有特性，CNT 的定位和定量成为可能：强光吸收和散射;事实上，CNT 在 BF 上表现为强烈吸收的黑点，在 DF 上表现为亮点，具有精确的共定位。

这种方法可能会对纳米材料和细胞之间相互作用的研究产生相当大的影响，因为该协议适用于广泛的纳米材料，只要它们能够足够强烈地吸收（和/或散射）光。

引言

在过去的几十年里，纳米颗粒在广泛的应用中的地位越来越重要。特别是，碳纳米管 （CNT） 越来越多地被探索为用于各种诊断和治疗应用的纳米工具;由于其特殊的电、热和光谱特性，CNT 可以用作各种药物或造影剂的递送载体，也可以参与组织工程¹。

然而，对这种纳米材料潜在毒性的担忧仍在争论中，主要是因为 CNT 在生物体中的命运仍然存在很大争议。确实缺乏适当的方法来检测和定量活细胞和组织中的它们：例如，已经提出了拉曼光谱、光声和近红外光致发光成像等技术，但每种方法都显示出局限性，具体取决于纳米管的类型和/或其环境^2-8。

在这里，所提出的方法可能适用于细胞中纳米颗粒的检测和定量。这是通过使用 ImageStream 实现的，ImageStream 是一种结合了流式细胞术和高分辨率成像的设备。它结合了采集大量细胞（高达 5000 个事件/秒）的优势，以及同时获得每个细胞的统计数据和高分辨率图像（0.5 μm 空间分辨率）的优势。通常，图像是使用 CCD 相机收集的，并且是细胞的二维灰度表示。对图像中每个像素的光进行量化，并识别荧光或具有亚细胞大小的成分（例如在 BF 中）的强度和位置，从而具有根据外观区分细胞的强大能力^9,10。

我们的目标是设计一种纳米计量学方法，该方法将能够定量评估 CNT 在细胞中的分布和行为。特别是，该方法被开发用于研究细胞对 CNT 的细胞摄取、加工和胞吐作用。我们首先证明了 CNT 的复杂细胞运输，其次证明了这些纳米材料在细胞之间的转移：细胞内化的 CNT 在受到压力时逃离宿主细胞，在细胞外空间扩散到国外，并被幼稚细胞重新内化，无论它们是同型还是异型¹¹

。

先前的研究表明，根据 CNT 功能化和聚集状态，可能会出现不同的细胞摄取机制，无论是主动的还是被动的¹²。在这里，多壁 CNT 通过 1,3-偶极环加成反应和酰胺化进行功能化，然后用荧光探针衍生化，在异硫氰酸酯 （FITC） 中发出荧光。在透射电子显微镜下，它们似乎被细胞内化，要么单独内化，要么以细胞束的形式内化，主要存在于内体和溶酶体区室中¹¹。在 ImageStream 上，成簇的 CNT 以高度相关性显示为 BF 上的黑点和 DF 上的亮点，从而可以明确区分 CNT 标记的细胞和对照细胞。另一方面，用 CNT 功能化的荧光标记物发出的荧光信号的分布没有很好地共定位：事实上，可能是由于猝灭现象，绿色荧光斑点不一定与 BF 和 DF 上的斑点匹配。这表明，首先，使用 ImageStream 检测 CNT 不是强制性的，其次 - 更强的是 - 它不能完全代表 CNT 的定量和定位。

除了给出纳米颗粒的统计相对量化外，该方法还提供了有关 CNT 在细胞中定位的信息，这意味着它可以区分细胞内部的 CNT 与与质膜结合的 CNT。在细胞图像上定位 CNT 的能力显然克服了传统流式细胞术分析的局限性¹³。该程序是通过创建与细胞的特定区域拟合的掩模并选择与负载的 CNT 相对应的黑点来开发的。

一般来说，这种方法可以应用于涉及细胞中可视化或定量需求的大范围实验，前提是所使用的纳米颗粒能够强烈吸收（和/或散射）光。

方案

1. 水分散性碳纳米管 （CNT） 的制备

1. 将第一个 CNT 分散在细胞培养水中，然后在 20 °C 的浴水超声仪中超声处理 20 分钟。如果 CNT 用荧光探针功能化，请在整个实验过程中尽可能避免光线照射。

2. 用 CNT 标记细胞

在
1. 含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素链霉素的 DMEM 培养基中，在 25 cm² 平板上培养人脐静脉内皮细胞 （HUVEC）（例如）。
2. 在完全培养基中制备浓度为 0、10、20 和 50 μg/ml 的 CNT 溶液，并在 37 °C 下孵育细胞 20 小时或在 4 °C 下孵育 20 小时（25 cm² 板中为 2ml CNT 悬浮液）。

3. 细胞固定

1. 然后去除孵育培养基;用 PBS 冲洗细胞，胰蛋白酶消化，并将细胞重悬于完整的 DMEM 培养基中。以 1,200 rpm 离心 5 分钟。
2. 先用 4% 多聚甲醛在 4 °C 下更换 1 小时，然后用 PBS 替换介质以保存它们。如果需要，可以在该过程的此阶段将细胞在 4°C 下储存数天，直到进行细胞分析。
3. 每个样品必须包含约 10^{个 6} 细胞，浓度在 50 μl PBS 中。正确悬浮它们以避免分析过程中聚集，并通过 50 μm 网状染色机过滤它们。
   注意：每个步骤都必须非常轻柔地进行以保存细胞。

4. ImageStream 采集

使用多光谱成像流式细胞仪 ImageStream 获取细胞图像><。 必须尊重以下几点：

1. 选择合适的放大倍率（此处使用 40 倍物镜）。
2. 如果使用荧光染料：
   - 制备不含荧光染料的对照样品。
   - 用单色阳性对照制备细胞，用于
   添加到您的样品中。
3. 使用激光 488 nm 激发 FITC，使用通道 02 收集荧光发射（带通 480-560 nm）。此外，还可以将通道 01 和 06 分别用于明场 （BF） 和暗场 （DF）。

5. 后处理 - IDEAS 分析软件（版本 4.0）

1. 在获得的所有事件中，分析必须首先仅限于单个细胞群：使用表示 "纵横比"（即宽度/高度）与 "细胞面积"（应用于 BF 细胞的参数）的双参数点图（图 1）。然后将包含在感兴趣区域中且标准面积和纵横比接近 1 的单细胞与多细胞事件（大面积和小纵横比）和碎片（极小面积）区分开来。
2. 要在聚焦平面中选择细胞，请使用适用于高度对比的 CNT 标记细胞的双参数点图：在 BF 图像上绘制"对比度"与"RMS 梯度"（测量图像的清晰度质量）的对比 - 它允许排除未聚焦的细胞，在其 BF 图像中同时显示低 rms 梯度和低对比度（图 1）。
3. 1. 通过使用 "find the best feature" 确定在标记和未标记的单元格之间提供最佳统计分离的参数。在我们的研究中，平均像素对象特征是最合适的参数（图 2）。
   2. 使用此参数与归一化频率追踪直方图，以比较测试浓度的摄取 CNT 的数量（图 3）。
   3. 跟踪双参数图"BF 上的平均像素对象"（表示法：平均Pixel_Object （M01，Ch01，Tight）_Ch01）与"DF 上的强度"（Intensity_MC_Ch06），以研究这两个参数之间的相关性（图 4）。
4. 定量也通过掩模进行评估：
   1. 由于 CNT 在 BF 上表现为强吸收黑点，因此首先通过选择在本研究中由 0-533 组成的低强度的有限像素范围来创建一个精确适合它们的阈值掩码（掩码 1，表示法：强度（M01，BF，0-533））（图 5）。与对照细胞相比，在标记的细胞上选择阈值强度。
   2. 相反，也创建一个具有 DF 的高强度像素（在本例中为 150-4095）的蒙版（蒙版 2，表示法：强度（M06，DF，150-4095））（图 6）。
   3. 使用掩码的面积（1 或 2;（符号：Area_Intensity（M01， BF， 0-533）对于掩码 1）：它将提供不同浓度下 CNT 内化的相对量化（图 7）。
   4. 检查这两个掩码之间的相关程度（感谢双参数图 '掩码 1 的面积' 与 '掩码 2 的面积'） （图 7）。
5. 创建其他掩码以定位细胞中的 CNT：
   1. 适合细胞内部的掩码：Erode（M01， 7） - 对应于整个细胞的掩码 （M01）（图 8），它进一步侵蚀了 7 个像素（图 9）。
   2. 仅使用布尔方程拟合膜的掩模：M01 而不是 Erode（M01,7） - 从内部减去整个细胞 （M01） 的掩模 （Erode（M01,7））（图 10）。
   3. 要考虑膜上的暗像素（对应于 CNT），请创建掩码：Intensity（M01 而不是 Erode（M01， 7）， BF， 0-533）（图 11）。
   4. 可视化应用于细胞集合的不同掩码，以检查它们与标记和未标记细胞的相关性（图 12）。
   5. 在蒙版上应用特征区域，选择膜上黑色像素"Area_Intensity（M01 and not Erode（M01， 7）， BF， 0-533）"，即所谓的黑色区域。 它允许定量膜上的 CNT。
      
      为了最终区分已内化的 CNT 与仅吸附在膜上的 CNT，将膜上的黑色区域与整个细胞上的黑色区域（即"Area_强度（M01 而不是 Erode（M01， 7）， BF， 0-533' 与 'Area_ Intensity（M01， BF， 0-533）'）。
      
      注意：对 FITC 荧光信号应用相同类型的程序：比较 FITC 荧光强度的增加与 BF 上平均像素信号的减少，或 BF 上的黑点与 FITC 荧光强度之间的共定位。在我们的例子中，这种类型的分析是无关紧要的，因为荧光信号一方面与 BF 上的黑点不匹配，另一方面与 DF 上的明场不匹配，这表明 CNT 的内在特性（光吸收率和散射率）比与荧光探针相关的信号更合适。
6. 在一个实验条件下创建所有图后，创建一个 "统计报告模板"，将模板另存为 .ast 文件并批量所有数据文件。

结果

图 1 给出了 ImageStream 设备原理的概述。它可以生成流动中每个细胞的多个高分辨率图像，包括明场 （BF）、暗场（DF 或侧向散射光）和荧光通道，如图 2 所示，其中三个不同的细胞用 CNT 标记。还显示了这些通道的叠加层，乍一看说明了相关性。

鉴于所有后处理分析都基于细胞成像，因此聚焦细胞的选择对于研究至关重要（图 3）。实际上，与未标记的细胞相比，CNT 的存在会引起对比度和梯度的变化：聚焦细胞已经内化了大量的 CNT，往往具有低 rms 梯度（这通常是用于区分聚焦细胞和未聚焦细胞的唯一参数）但也是一个重要的对比，解释了为什么双参数图是必不可少的。图 3 显示了未聚焦（黄色区域）与聚焦细胞（蓝色区域）之间的区别。

细胞内化的 CNT 是清晰可区分的 - 特别是在 BF 上表现为强烈吸收的黑斑（参见不同标记浓度的影响，图 4）。此外，分析了 BF 上的平均像素信号，给出了摄取的相对量化：图 5 上的图表显示其随着 CNT 标记浓度的增加而显着增加（每个实验条件约 7,000 个细胞的结果）。

其次，也可以通过使用掩模来量化 CNT，掩模应用于 BF 的有限暗像素范围或 DF 的高强度像素（参见图 6 中的示例），对应于 CNT 存在产生的斑点。因此，绘制这些掩码的区域可以突出显示以及摄取的增加（例如，如图 7 所示，掩码区域在 BF 上，选择范围为 0-533 的像素）。

此外，可以通过绘制 DF 强度与 BF 平均像素信号（如图 8 所示）（与掩模无关的分析）或 BF 上的掩模面积（掩模 1）与 DF 上的面积（掩模 2）来评估 BF 和 DF 上斑点之间的相关性。

关于为细胞内定位 CNT 创建的程序，图 9A 显示了创建的不同掩码。请注意，必须在已标记和未标记的单元格集合上目视检查本地化掩码的稳健性（基于默认单元格掩码的侵蚀）。所有样本都使用相同的蒙版。

绘制细胞膜上黑点的总面积与整个细胞上的黑点总面积，可以为在 37 °C 下孵育 20 小时的细胞提供内化评分，而在 4 °C 下孵育 2 小时（见图 9B）;它表明 CNT 主要位于 4 °C 的膜上， 而在 37 °C 时，CNT 在超过 90% 的细胞中内化。

最后关于荧光，由于荧光点与 BF（和 DF）上的点之间的相关性太低，该参数未用作 CNT 定量的指标。事实上，FITC 强度和明场平均像素之间的相关性表明 Pearson 相关系数为 -0.2。在图 10 中，说明了两种情况，其中荧光信号与明场黑点正确匹配或不匹配。

图 1.ImageStream 概述 - 一般作。多光谱成像系统以三种不同的模式采集多达 12 张图像/单元：明场、暗场和荧光。该装置包括 5 个激发激光器，包括 405、488、560 和 658 nm。使用不同的物镜（在本研究中，使用 40X 物镜）从流经比色皿的细胞中收集光，并传递到光谱分解元件，该元件由一组角度阵列中的长波通滤光片组成。收集单元图像的 CCD 相机使用一种称为时延积分的技术进行作，以避免图像条纹。扩展景深 （EDF） 是一种选择。

图 2.ImageStream 通过不同通道（明场 （BF）、暗场 （DF）、荧光 （FITC） 及其叠加层）捕获的碳纳米管 （50 μg/mL） 标记的细胞图像库。局限在细胞内溶酶体内的 CNT 在明场图像上显示为大黑点。相反，它们在暗场和荧光图像上产生亮点。

图 3.选择聚焦的单元格。表示 BF 图像上均方根 （rms） 梯度与对比度的双变量点图允许排除未聚焦的单元格。此处的黄色区域表示未聚焦的单元格，而聚焦的单元格以蓝色表示。未聚焦的细胞的特点是明场图像上的低对比度和低梯度 rms。除了 rms 梯度外，还需要对比功能来区分用 CNT 标记后的聚焦细胞。

图 4.ImageStream 可视化的 CNT 的剂量依赖性摄取。 在与细胞孵育期间，明场图像上黑点的数量和面积随着 CNT 剂量的增加而增加（范围为 0-50 μg/ml）。请注意，对照单元格没有黑点。

图 5.基于明场图像的 CNT 摄取的相对量化。 应用于具有整个细胞的掩模"对象"的平均像素特征的直方图清楚地显示了剂量依赖性行为，可用于量化。R9 范围包围了 CNT 阳性细胞。

图 6.创建蒙版，选择 BF 上的黑点和 DF 图像上的亮点。 由于 CNT 在 BF 图像上表现为强吸收暗点，因此创建了阈值掩码以选择在本研究中由 0-533 组成的低强度的有限像素范围（掩码 1，符号：强度（M01，BF，0-533））。相反，在 DF 图像（蒙版 2，表示法：强度 （M06，DF，150-4095））上具有高强度像素（在本例中为 150-4095）的蒙版用于选择 DF 上的亮点，对应于高散射区域。

图 7. 通过量化 BF 图像上的黑点区域来证明 CNT 的剂量依赖性摄取。 使用应用于 BF 的阈值掩码（掩码 1），可以量化每个细胞的黑点面积，显示剂量依赖性分布。

图 8.基于 BF（吸收）和 DF（散射）图像的 CNT 定量方法是相关的。 在左侧，BF 图像上的平均像素与 DF 图像上的强度相比，显示出用 CNT （50 μg/ml） 标记的细胞具有良好的相关性（Pearson 相关系数 r = -0.68）。右图为用 CNT （50 μg/ml） 标记的细胞，BF 上的掩模拟合黑点面积与 DF 上的掩模拟合亮点面积。Pearson 相关系数为 r = -0.83.绘制了 7,000 个单元格的值。

图 9.使用特定掩模在细胞中定位 CNT。 （A） 创建掩模以适应细胞的特定位置，即从左到右 - 整个细胞、仅膜和细胞内部。另一个蒙版由于阈值强度（蒙版 1，表示法：Intensity（M01， BF， 0-533））而适合黑点。（B） 通过使用 A. 中描述的定位掩码测量细胞不同定位上的黑点面积，可以获得 CNT 定位的评估。在 37 °C 和 4 °C 下与 CNT （50 μg/ml） 孵育以抑制内化途径。表示膜上的黑色区域与整个细胞上的黑色区域的图表显示了 4 °C 时 CNT 在膜上的剂量依赖性吸收，而 CNT 的完全内化在 37 °C 时有效。

图 10.CNT 诱导的 BF 黑点与 FITC 图像上的荧光亮点共定位。 荧光亮点并不总是与 BF 上的黑点共定位。它们与显示的前两个单元格正确匹配，但与最后两个单元格不匹配。

讨论

1. 修改和故障排除

在这项研究中，第一个目标是评估细胞中碳纳米管的数量和定位。共聚焦显微镜可以先 验地 评估用荧光标记物FITC^8,14功能化的碳纳米管的细胞内分布。然而，主要缺点是单细胞成像的局限性，因此缺乏统计相关数据。ImageStream允许超越这些障碍的工作：事实上，通过在短时间（<分钟）内筛选大量细胞（5,000-10,000个），它产生了统计上稳健的结果，并通过高分辨率成像增强了结果，该成像为每个细胞提供亚细胞分辨率（0.5μm）的图像。然后，它可以基于单个图像分析分析大量数据。

与传统的流式细胞术相比，ImageStream 的独特优势是可以提供每个细胞的多光谱 图像 和信号强度的逐像素比较。因此，ImageStream将高通量流式细胞术的统计能力与共聚焦成像对每个分析细胞的分析优势相结合。它对于细胞中碳纳米管的无标记相对定量和定位至关重要。

2. 协议内的关键步骤

关键步骤包括选择最适合每项研究的参数。在我们的例子中，最好的方法是根据纳米管的吸收和散射特性进行分析：BF上黑点的定位和DF上的亮点定位之间的良好相关性支持所开发的方法是相关和可靠的——如果没有细胞成像，可能不可能。

3. 技术的局限性

必须强调的是，细胞中碳纳米管的可视化之所以成为可能，是因为它们倾向于在内体细胞内囊泡中积累，然后表现为强吸收和散射点。不应基于这种方法检测单个纳米管，而最终可以通过荧光检测到，这构成了明显的局限性。其次，定量不是“绝对的”，而是针对不同标记浓度以及与对照未标记细胞相比的相对的。一些定量特征（平均像素、强度 等）是绝对参数，而其他特征则取决于掩模的选择（阈值掩模、定位掩模）。

4. 相对于现有方法的意义

在荧光方面，ImageStream分析突出了FITC明亮信号与其他通道上的斑点之间CNT簇的共定位性差。因此，荧光似乎不是碳纳米管定量和定位的可靠指标。然而，克服了主要基于荧光定量的传统流式细胞术的局限性，多光谱高通量 ImageStream 为统计无 标记 定量铺平了道路，同时提供了细胞内碳纳米管的定位。

5. 未来的应用

这种高通量统计纳米计量方法可以推广到任何纳米材料，这些纳米材料在与细胞相互作用时表现出高光吸收和散射。因此，它在纳米生物界面、纳米毒理学和纳米医学的研究中可能具有重要的应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ImageStream	阿姆尼斯