利用多光谱成像流式细胞术对细胞内碳纳米管的定位与相对定量分析

摘要

本研究的主要目的是监测碳纳米管（CNTs）的细胞摄取及其最终的胞吐过程。基于这一视角，我们提出了一种独特的方法，利用多光谱成像流式细胞术，能够在数量具有统计学意义的细胞中对碳纳米管进行定量和定位分析。

摘要

基于碳的纳米材料，如碳纳米管（CNTs），属于这类难以与富含碳的细胞结构区分开来的纳米颗粒 事实上的 目前仍缺乏在细胞和组织水平上定量评估其分布的方法。本文提出一种创新性方法，利用多光谱成像流式细胞仪（ImageStream，Amnis）实现细胞内碳纳米管（CNTs）的检测与定量。该新型设备兼具高通量细胞分析与高分辨率成像能力，可在细胞流动状态下直接获取每个细胞的图像，从而实现具有统计学意义的图像分析。每个细胞的图像均在明场（BF）、暗场（DF）及荧光通道中采集，分别反映每个细胞的光吸收强度与分布、光散射情况以及荧光信号。分析过程包括对实验每种条件下获取的7,000至10,000个细胞的图像进行逐像素比对。碳纳米管特有的内在光学特性——强烈的光吸收和散射能力——使得其定位与定量成为可能：在明场图像中，碳纳米管表现为强吸收的暗斑，而在暗场图像中则呈现为明亮的亮点，二者具有精确的共定位特征。

鉴于该方案适用于多种纳米材料，只要这些纳米材料能够足够强地吸收（和/或散射）光，该方法可能对纳米材料与细胞相互作用的研究产生重要影响。

引言

近几十年来，纳米颗粒在广泛应用中占据了越来越重要的地位。特别是碳纳米管（CNTs）正被越来越多地研究作为多种诊断和治疗应用的纳米工具；得益于其独特的电学、热学和光谱特性，碳纳米管可用作多种药物或对比剂的递送载体，也可参与组织工程¹。

然而，关于此类纳米材料潜在毒性的担忧仍在讨论之中，主要原因是碳纳米管在生物体内的归宿仍存在很大争议。目前确实缺乏在活细胞和组织中检测和定量碳纳米管的适当方法：例如，已有研究建议采用拉曼光谱、光声成像和近红外光致发光成像等技术，但每种方法均存在局限性，具体取决于纳米管的类型和/或其所在环境^2-8。

此处提出的方法可用于细胞内纳米颗粒的检测与定量。这得益于ImageStream技术的应用，该设备结合了流式细胞术与高分辨率成像功能，能够同时获取大量细胞（最高达5000个事件/秒），并获得具有统计学意义的数据以及每个细胞的高分辨率图像（空间分辨率为0.5 µm）。通常，图像通过CCD相机采集，以二维灰度形式呈现细胞形态。图像中每个像素的光信号被量化，可识别荧光信号或亚细胞结构组分（例如明场图像中的信号）的强度及其位置，从而基于细胞形态特征实现对细胞的高效区分^9,10。 

本研究旨在设计一种纳米测量方法，以实现对碳纳米管（CNTs）在细胞内分布与行为的定量评估。该方法特别适用于研究细胞对碳纳米管的摄取、加工及外排过程。我们首先证实了碳纳米管复杂的细胞内转运过程，其次揭示了这些纳米材料在细胞间的转移：当宿主细胞受到应激时，其内部摄取的碳纳米管会逃逸至细胞外空间，广泛扩散并被未受刺激的细胞重新摄取，无论这些细胞是同型还是异型细胞¹¹

。

先前的研究表明，细胞摄取机制（无论是主动还是被动）可能因碳纳米管（CNT）的功能化方式及其聚集状态而有所不同¹²此处的多壁碳纳米管通过1,3-偶极环加成和酰胺化反应进行功能化，随后与荧光探针异硫氰酸荧光素（FITC）衍生化。透射电子显微镜观察显示，这些碳纳米管可被细胞摄取，单独分布于细胞质中，或成束存在于内体和溶酶体区室中。¹¹在ImageStream上，聚集的CNTs在明场（BF）中呈现为暗斑，在暗场（DF）中呈现为亮斑，具有高相关性，从而能够清晰区分CNT标记的细胞与对照细胞。另一方面，经CNTs功能化的荧光标记物所发射的荧光信号分布则未表现出良好的共定位：事实上，可能由于淬灭现象，绿色荧光斑点并不一定与BF和DF图像中的斑点对应。这表明，第一，使用ImageStream检测CNTs时并非必须依赖荧光探针；第二—— 更不用说 - 该方法对于碳纳米管的定量与定位均不具有充分的代表性。

除了提供纳米颗粒的统计学相对定量信息外，该方法还可提供关于碳纳米管（CNTs）在细胞内定位的信息，例如能够区分位于细胞内部的碳纳米管与结合在质膜上的碳纳米管。在细胞图像上实现碳纳米管定位的能力，明显克服了传统流式细胞术分析的局限性¹³。本研究通过构建与细胞特定区域相匹配的掩模，并选取对应于负载碳纳米管的暗斑区域，建立了该分析流程。

一般来说，只要所使用的纳米颗粒能够强烈吸收（和/或散射）光，该方法便可广泛应用于需要对细胞进行可视化或定量分析的多种实验。

方案

1. 水分散性碳纳米管（CNTs）的制备

1. 先将碳纳米管（CNTs）分散于细胞培养用水中，然后在20 °C下使用水浴超声仪超声处理20分钟。如果碳纳米管经荧光探针功能化，实验过程中应尽可能避免光照。

2. 使用碳纳米管标记细胞

1. 在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于25 cm²培养皿上培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（例如）。
2. 用完全培养基配制浓度为0、10、20和50 µg/ml 的碳纳米管（CNTs）溶液，并将细胞在37 °C孵育20小时，或在4 °C孵育20小时（每25 cm²培养皿加入2 ml  CNT悬液）。

3. 细胞固定

1. 随后去除培养液；用 PBS 清洗细胞，胰蛋白酶消化， 用完全DMEM培养基重悬细胞，在1,200 rpm转速下离心5分钟。
2. 先用4%多聚甲醛在4 °C下孵育1小时，然后更换为PBS以保存样本。如有需要，细胞可在该步骤于4 °C保存数天，直至进行流式细胞术分析。
3. 每个样本必须包含约10⁶ 50 µl 浓缩细胞 加入 PBS，正确重悬以避免分析过程中形成聚集体，并通过 50 μm 滤网过滤。
   注意每一步操作都必须非常轻柔，以保护细胞。

4. ImageStream 数据采集

使用多光谱成像流式细胞仪 ImageStream 获取细胞图像。
需遵守以下几点：

1. 选择合适的放大倍数（此处使用 40X 物镜）。
2. 如果使用荧光染料：
   - 准备不含荧光染料的对照样本。
   - 为实验中使用的每种荧光染料分别准备单色阳性对照细胞
   添加到您的样品中。
3. 使用488 nm激光激发FITC，并使用通道02收集荧光发射信号（带通480-560 nm）。此外，分别使用通道01和通道06采集明场（BF）和暗场（DF）图像。

5. 后处理 - IDEAS 分析软件（版本 4.0）

1. 在所有获取的事件中，分析首先需限定于单细胞群体：使用一个双参数点图，显示“长径比”（aspect ratio）即 宽度/高度）与“细胞面积”（应用于明场下细胞的参数）（图1）。然后，通过标准面积和接近1的长宽比，将感兴趣区域内的单细胞与多细胞事件（面积大且长宽比小）以及碎片（面积极小）区分开来。
2. 为了选择处于聚焦平面的细胞，使用适用于高对比度碳纳米管标记细胞的双参数点图：在明场图像上绘制“对比度”与“均方根梯度”（用于衡量图像的清晰度质量）的关系图——该方法可排除那些在明场图像中同时表现出低均方根梯度和低对比度的失焦细胞图1).
3. 1. 通过使用该参数来确定标记细胞与未标记细胞之间最佳的统计学分离效果 "找到最佳特征"在我们的研究中，平均像素对象特征是最合适的参数图2).
   2. 使用该参数对归一化频率作直方图，以比较不同测试浓度下摄取的碳纳米管数量（图3).
   3. 追踪双参数图“明场中的平均像素目标”（记号：Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01）与“强度 在 DF' 上强度_MC_Ch06），以研究这两个参数之间的相关性（图4).
4. 定量分析还通过使用掩模进行评估：
   1. 由于碳纳米管（CNTs）在明场（BF）下呈现为强吸收的暗点，首先通过选择本研究中强度介于0-533之间的有限像素范围，创建一个精确匹配这些暗点的阈值掩膜 （掩膜1，标注：Intensity(M01, BF, 0-533)） (图5通过与对照细胞相比较，在已标记的细胞中确定阈值强度的选择。
   2. 相反，还需创建一个与暗场图像中高亮度像素（本例中为150-4095）相匹配的掩膜 （掩膜 2，标注：强度（M06，DF，150-4095）） (图6).
   3. 使用掩膜面积（1 或 2；(notation: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)用于掩模1）：可提供不同浓度下碳纳米管内化作用的相对定量结果图7).
   4. 通过双参数图“Mask 1 面积”与“Mask 2 面积”之间的关系，检查这两个掩膜之间的相关程度（图7).
5. 创建其他掩膜以定位细胞中的碳纳米管：
   1. 贴合细胞内部结构的掩模： Erode(M01, 7) - 对应于整个细胞的掩膜（M01）（图8），再进一步腐蚀 7 个像素（图9).
   2. 仅使用布尔方程对膜进行掩模拟合： M01 且非 Erode(M01,7) - 整个细胞的掩膜（M01）减去内部区域（Erode(M01,7)）图10).
   3. 为考虑膜上对应于碳纳米管（CNTs）的暗像素，请创建如下掩膜： 强度(M01 且非 Erode(M01, 7)，明场，0-533) (图11).
   4. 可视化应用于一组细胞的不同掩膜，以检验其相关性（图12用于标记和未标记细胞的检测。
   5. 应用掩膜上的特征区域，选择膜上黑色像素的“Area_”强度(M01 且非 Erode(M01, 7), BF, 0-533) 所谓的黑区. 可实现对膜上碳纳米管（CNTs）的定量分析。
      
      为了最终区分被细胞内化的碳纳米管与仅吸附在膜上的碳纳米管，绘制膜上黑色区域面积与整个细胞上黑色区域面积的比值即 区域_ 强度（M01 且非 Erode(M01, 7)，明场，0-533） 与 面积_强度(M01, BF, 0-533)
      
      注意： 采用相同类型的程序处理FITC荧光信号：比较FITC荧光强度的增加情况 与 明场图像中平均像素信号的降低，或明场暗斑与FITC荧光强度之间的共定位。在本研究中，此类分析并不适用，因为一方面荧光信号与明场中的暗斑不完全对应，另一方面也与暗场中的亮信号不一致，表明碳纳米管（CNTs）的固有特性（光吸收和散射）相较于荧光探针相关信号更为合适。
6. 在完成一种实验条件下的所有图谱绘制后，创建一个 "统计报告模板"，将模板另存为 .ast 文件，并批量处理所有数据文件。

结果

ImageStream 设备原理的概述见图1。该设备可在细胞流动过程中对每个细胞生成多幅高分辨率图像，包括明场（BF）、暗场（DF 或侧向散射光）以及荧光通道，如图2中用碳纳米管（CNTs）标记的三种不同细胞所示。这些通道的叠加图像也已展示，初步直观地呈现了它们之间的相关性。

鉴于所有后期处理分析均基于细胞成像，聚焦细胞的选择对本研究至关重要（图3）。实际上，与未标记细胞相比，碳纳米管（CNTs）的存在会同时改变细胞的对比度和梯度：已摄取大量碳纳米管的聚焦细胞，其均方根梯度（rms gradient）往往较低（该参数通常是用于区分聚焦细胞的唯一指标） 与 未聚焦的细胞）但也存在一个重要对比，这解释了为何双参数图至关重要。在 图3 显示未聚焦区域（黄色区域）的区分 与 聚焦的细胞（蓝色区域）。

细胞内化的碳纳米管清晰可辨——尤其在明场（BF）下呈现为强吸收的暗斑（参见不同标记浓度的影响，图4）。此外，对明场（BF）下的平均像素信号进行了分析，以实现对摄取量的相对定量：图5 中的图表显示，随着碳纳米管标记浓度的增加，信号显著上升（每种实验条件下约分析了7,000个细胞）。

其次，通过使用掩膜也可实现对碳纳米管（CNTs）的定量分析，掩膜可应用于明场（BF）中特定范围的暗像素，或暗场（DF）中高亮度像素（见图6示例），这些像素对应由碳纳米管存在所形成的斑点。因此，通过绘制这些掩膜的面积，可以清晰地展示并反映摄取量的增加（如图7所示，采用明场图像上的掩膜面积，选取像素值范围为0–533的区域进行分析）。

此外，可通过绘制 DF 荧光强度与 BF 平均像素信号（如图8所示）的关系图（不依赖掩膜的分析），或绘制 BF 上掩膜区域（掩膜1）与 DF 上区域（掩膜2）的关系图，来评估 BF 与 DF 图像上斑点之间的相关性。

关于用于定位细胞内碳纳米管（CNTs）的实验步骤，图9A展示了所生成的不同掩膜。请注意，必须通过目视检查标记与未标记细胞样本集，以验证定位掩膜（基于默认细胞掩膜的腐蚀处理）的稳健性。所有样品均使用相同的掩膜。

绘制细胞膜上黑色斑点的总面积 与 与在4°C孵育2小时相比，在37°C孵育20小时的细胞其整个细胞的内化评分 图 9B）；这表明在4 °C时，碳纳米管主要位于细胞膜上，而在37 °C时，超过90%的细胞将碳纳米管内化。

最后关于荧光信号，由于荧光斑点与明场（BF）和暗场（DF）图像上的斑点之间相关性过低，该参数未被用作碳纳米管（CNTs）定量的指标。事实上，FITC荧光强度与明场平均像素值之间的皮尔逊相关系数仅为-0.2。在图10中展示了两种情况，分别显示荧光信号与明场黑色斑点匹配良好或不匹配的情形。

图 1. ImageStream 系统总体工作原理示意图。 多光谱成像系统可在三种不同模式下对每个细胞最多采集 12 幅图像：明场、暗场和荧光。系统配置包含 5 个激发激光器，分别为 405、488、560 和 658 nm。通过不同物镜（本研究中使用 40X 物镜）收集流经比色皿的细胞所发出的光，并将其传递至光谱分解元件，该元件由一组呈角度排列的长通滤光片组成。用于采集细胞图像的 CCD 相机采用一种称为时间延迟积分（time-delay-integration）的技术进行操作，以避免图像拖尾。扩展焦深（EDF）为可选功能。

图2. 通过ImageStream在不同通道（明场（BF）、暗场（DF）、荧光（FITC）及其叠加图像）下捕获的用碳纳米管（50 μg/mL）标记的细胞图像图集。 被限制在细胞内溶酶体中的碳纳米管在明场图像中呈现为较大的黑色斑点。相反，在暗场和荧光图像中则表现为明亮的斑点。

图3. 处于焦点的细胞筛选。 双变量点图展示了明场图像上均方根（rms）梯度与对比度之间的关系，可用于排除失焦细胞。图中黄色区域代表失焦细胞，而蓝色区域代表处于焦点的细胞。失焦细胞在明场图像上表现为对比度和梯度均方根值均较低。除均方根梯度外，还需利用对比度特征来区分经碳纳米管（CNTs）标记后的聚焦细胞。

图 4. 通过ImageStream观察到的碳纳米管（CNTs）剂量依赖性摄取。 明场图像中黑色斑点的数量和面积随着与细胞共孵育时碳纳米管剂量的增加而增加（0–50 µg/mL范围）。请注意，对照组细胞中无黑色斑点。

图5. 基于明场图像对碳纳米管摄取量的相对定量分析。 对覆盖整个细胞的掩膜“object”应用平均像素特征所生成的直方图，清晰显示出剂量依赖性行为，可用于定量分析。R9范围包含摄取碳纳米管的阳性细胞。

图6. 在明场图像上选择黑点、在暗场图像上选择亮点的掩膜创建方法。 由于碳纳米管（CNTs）在明场图像中表现为强吸收性的暗点，本研究中创建了一个阈值掩膜，用于选择强度较低、范围在0–533之间的特定像素区域 (掩膜1，记号：Intensity(M01, BF, 0–533))。相反地，使用一个匹配暗场图像中高强度像素（本例中为150–4095）的掩膜 (掩膜2，记号：Intensity(M06, DF, 150–4095)) 来选择暗场图像中的亮点，这些亮点对应于强散射区域。

图 7. 通过明场图像中黑斑面积的定量分析，展示碳纳米管（CNTs）摄取的剂量依赖性。在明场图像上应用阈值掩膜（掩膜 1），可对每个细胞的黑斑面积进行定量，结果显示其呈剂量依赖性分布。

图8. 基于明场（吸收）和暗场（散射）图像的碳纳米管定量方法具有相关性。 左侧为明场图像的平均像素值 与 CNTs（50 µg/ml）标记的细胞在DF图像上的强度与BF图像上暗斑区域的掩模拟合显示出良好相关性（Pearson相关系数r = -0.68）。右侧为BF图像上暗斑区域的掩模拟合范围 与 CNTs标记的细胞（50 µg/ml）在暗场中掩模拟合亮斑区域的皮尔逊相关系数为r = -0.83。数据来自7,000个细胞的统计结果。

图 9. 使用特定掩模分析碳纳米管（CNT）在细胞内的定位。（A）创建掩模以匹配细胞特定区域，从左至右分别为：整个细胞、仅细胞膜、以及细胞内部。另一掩模通过设定强度阈值来匹配黑色斑点（掩模 1，标注：Intensity(M01, BF, 0-533)）。（B）通过使用 A 部分所述的定位掩模，测量细胞不同区域上黑色斑点的面积，可评估 CNT 的定位情况。在 37 °C 和 4 °C 条件下分别进行 CNT（50 µg/mL）孵育，以抑制内吞途径。图中显示膜上黑色面积与整个细胞上黑色面积的关系，表明在 4 °C 时 CNT 在膜上的吸附呈剂量依赖性，而在 37 °C 时 CNT 可完全内化。

图10. CNT诱导的明场黑斑与FITC荧光图像中亮斑的共定位分析。 荧光亮斑并不总是与明场中的黑斑共定位。在所示的前两个细胞中两者匹配良好，但在后两个细胞中则不一致。

讨论

1. 修饰与故障排除

在本研究中，首要目标是评估细胞内碳纳米管（CNTs）的数量及其定位。共聚焦显微镜本可以 先验 利用金标法评估经荧光标记物FITC功能化的碳纳米管在细胞内的分布^8,14然而，主要缺点是局限于单细胞成像，因此无法获得具有统计学意义的数据。ImageStream 能够突破这些限制：事实上，它可在短时间内（筛选大量细胞（5,000–10,000）<min），同时高分辨率成像可提供单个细胞亚细胞水平（0.5 µm）的图像，进一步增强了结果的统计稳健性。因此，能够基于单幅图像分析对大量数据进行分析。

与传统的流式细胞术相比，ImageStream 的独特优势在于能够提供每个细胞的多光谱图像，并实现信号强度的逐像素比较。因此，ImageStream 将高通量流式细胞术的统计能力与共聚焦成像的分析优势相结合，适用于每一个被分析的细胞。这对于细胞内碳纳米管（CNTs）的无标记相对定量与定位至关重要。

2. 方案中的关键步骤

关键步骤在于为每项研究选择最合适的参数。在本研究中，最佳方法是基于纳米管的吸收和散射特性进行分析：明场图像中暗斑位置与暗场图像中亮斑位置之间的良好相关性表明，所建立的方法具有相关性和可靠性——而这一结论若无细胞成像则可能无法实现。

3. 技术的局限性

必须强调的是，只有当碳纳米管（CNTs）倾向于在内体性细胞内囊泡中聚集时，才可能实现其在细胞内的可视化，此时它们表现为强吸收和散射斑点。单根纳米管无法通过该方法检测，而可能需依赖荧光信号进行最终检测，这构成了明显的技术局限性。其次，定量结果并非“绝对”定量，而是相对于不同标记浓度以及未标记对照细胞的相对定量。某些定量特征（如平均像素强度、强度） 等等）是绝对参数，而其他参数则取决于掩膜的选择（阈值掩膜、定位掩膜）。

4. 相对于现有方法的意义

关于荧光，ImageStream 分析突显了 CNT 聚集体在 FITC 明亮信号与其他通道斑点之间的共定位效果较差。因此，荧光似乎并非用于 CNT 定量与定位的可靠指标。然而，ImageStream 具备多光谱高通量特性，克服了传统流式细胞术主要依赖荧光定量的局限性，为统计分析开辟了新途径 无标记 定量分析，同时提供碳纳米管在细胞内的定位信息。

5. 未来应用

这种高通量统计纳米计量学方法可推广至任何在与细胞相互作用时表现出强光吸收和散射特性的纳米材料。因此，该方法在纳米-生物界面、纳米毒理学和纳米医学的研究中可能具有重要应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ImageStream	Amnis