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活体癌细胞中通过共聚焦成像观察到的异常有丝分裂相关的细胞死亡

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DOI：

10.3791/50568

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2013年8月21日

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1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

本文内容

摘要

通过活细胞共聚焦成像，实时记录了菲啶类化合物PJ-34在有丝分裂过程中对癌细胞的细胞毒性作用。PJ-34可清除含有额外中心体的有丝分裂期人乳腺癌MDA-MB-231细胞。与正常的双极有丝分裂不同，在PJ-34存在下，额外的中心体未能聚集到两个纺锤体极。

摘要

作为强效PARP1抑制剂的菲啶衍生物，可阻止多中心体人类癌细胞在有丝分裂过程中超数中心体的双焦点聚集。其中，菲啶类化合物PJ-34活性最强。额外中心体的解聚会导致多中心体细胞发生有丝分裂失败并最终死亡。大多数人类实体瘤中均频繁出现额外中心体。PJ-34的作用已在活体人乳腺癌MDA-MB-231细胞中通过共聚焦成像实时记录，这些细胞转染了编码荧光标记γ-微管蛋白的载体（γ-微管蛋白在中心体中高度富集）以及编码染色体中荧光组蛋白H2b的载体。经PJ-34处理后，在转染的MDA-MB-231细胞中检测到染色体排列异常及代表解聚中心体的分散γ-微管蛋白焦点。在细胞死亡之前，两个纺锤体极中已出现未聚集的额外中心体。这些结果首次将PJ-34最近发现的对含额外中心体的人类癌细胞特有的细胞毒性作用，与有丝分裂过程中中心体解聚及随后的有丝分裂失败导致的细胞死亡联系起来。根据先前对固定细胞进行共聚焦成像所观察到的结果，PJ-34可特异性清除含多中心体的癌细胞，而不影响仅含两个中心体并形成双焦点纺锤体的正常有丝分裂细胞。其他强效PARP1抑制剂并不具备PJ-34的这种细胞毒性作用，且在缺乏PARP1的携带额外中心体的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中仍可观察到PJ-34的作用，提示其作用机制独立于PARP1抑制。活细胞共聚焦成像为发现可在有丝分裂期间清除细胞的新分子提供了有力工具。

引言

菲啶类PARP1抑制剂（包括PJ-34）的设计初衷是在应激条件（如中风或心肌梗死）下，通过抑制耗能的PARP1介导的DNA修复过程，保护静息细胞免于发生凋亡性细胞死亡1。然而，我们最近发现，PJ-34在浓度达到抑制PARP1所需浓度的两倍时，可特异性地诱导人类癌细胞死亡2,3。细胞增殖越迅速，PJ-34对其清除效率越高。PJ-34的细胞毒性作用归因于有丝分裂过程中额外中心体的去簇集2。许多人源癌细胞含有多个中心体4,5。将携带多余中心体的人类乳腺癌细胞MDA-MB-231与20 μM PJ-34共孵育，可在72–96小时内高效清除这些癌细胞，而对静息细胞或某些在有丝分裂中仅含两个中心体的良性增殖细胞无损伤作用2,3。所涉及的良性细胞包括人乳腺上皮细胞MCF-10、人脐静脉内皮细胞（huvec）以及自人胸腺组织分离获得的原代间充质细胞。这些细胞对PJ-34的细胞毒性具有抗性。在96小时的孵育期间，PJ-34未干扰这些良性细胞的细胞周期进程，也未影响其中心体结构及双极纺锤体的形成2,3。

双极中心体组装对于有丝分裂中双极纺锤体的形成至关重要4,5。因此，具有两个以上中心体的细胞已进化出一种尚不完全清楚的分子机制，即将多余的中心体聚集到两个极点4-9。若中心体无法实现双极组装，则可能导致多极畸形纺锤体的形成以及染色体异常分离，从而引发细胞周期在G2/M期停滞，并导致因有丝分裂失败而引起的细胞死亡4,5。目前正深入研究导致多余中心体去聚集的分子机制10。阐明这一致死机制将有助于特异性地清除癌细胞，同时保护正常组织5,10。

因此，能够激活有丝分裂灾难性细胞死亡的化合物为选择性癌症治疗提供了一种新策略，可能在多种人类实体瘤中具有治疗效果。我们的结果表明，共聚焦成像可用于鉴定影响有丝分裂过程中额外中心体聚集的分子2,3，从而将这些化合物确定为靶向癌症的候选药物。

我们通过扫描固定和活体人类癌细胞（有丝分裂过程中中心体外出现的频率较高）与正常细胞，记录了菲蒽啶类化合物PJ-34的细胞毒性活性。以下列出了用于鉴定PJ-34在人类癌细胞中细胞毒性活性的成像操作步骤的逐步说明。

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方案

1. 细胞培养准备

MDA-MB-231 细胞购自 ATCC（American Type Culture Collection），并保存于液氮中。

  1. 在直径92 mm的培养皿中加入10 ml完全培养基，接种106个MDA-MB-231细胞，完全培养基包含Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、10%马血清、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素-两性霉素B。将细胞置于培养箱中培养，使其增殖至约80–100%融合度。
  2. 从培养皿中移除培养基并弃去。
  3. 用0.25%（w/v）胰蛋白酶-EDTA溶液短暂清洗细胞层，以去除残留的血清。
  4. 向培养皿中加入2.0 ml胰蛋白酶-EDTA溶液，在倒置显微镜下观察细胞，直至细胞层完全分散（通常在5至15分钟内）。
  5. 加入18 ml完全生长培养基，用移液器轻柔吹打收集细胞，转移至离心管中。
  6. 将细胞悬液以1,200 rpm离心。
  7. 将细胞沉淀重悬于24 ml培养基中。
  8. 取2 ml细胞悬液加入35 mm玻璃底培养皿中（约25%融合度），放入培养箱（5% CO2，37 °C）中培养。
  9. 溶液：
    1. 细胞增殖用完全培养基：含10%胎牛血清（FBS）、1%抗生素（100单位/ml青霉素G，100 μg/ml链霉素，青霉素-链霉素-两性霉素B溶液）和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基。
    2. 胰蛋白酶-EDTA溶液，含0.25%胰蛋白酶-EDTA。
  10. 培养皿：
    直径92 mm的培养皿。
    直径35 mm的多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿。

2. 活细胞共聚焦成像的细胞准备

  1. 在2 ml完全培养基中，于玻璃底培养皿中接种2 × 105 MDA-MB-231细胞，具体如第1节所述。当细胞培养至融合度为60–70%（约每皿3–4 × 105个细胞）时，进行转染。
  2. 使用脂质体转染试剂Jet-PI，按照制造商说明书，将编码融合蛋白γ-Tubulin-GFP（用于中心体的荧光检测）和Histone-RED（H2b-RED，用于染色体的荧光检测）的两种质粒共转染至细胞中。简要步骤如下：取每种质粒各2 μg，加入100 μl NaCl（150 mM）中混匀于一管；另取转染试剂100 μl与100 μl NaCl（150 mM）于第二管中混合，室温（RT）孵育5分钟。随后将两溶液合并，轻轻涡旋混匀后离心。室温孵育30分钟。
  3. 在转染混合物孵育期间，用PBS洗涤细胞一次，并将培养基更换为2 ml不含添加剂的预温DMEM（37 °C）。
  4. 将转染混合物轻柔加入含DMEM的细胞中，然后将细胞放回培养箱（37 °C，5% CO2）孵育8小时。
  5. 孵育8小时后，将DMEM更换为2 ml完全培养基，并在培养箱中继续孵育24小时。
  6. 转染后24小时，将细胞培养基更换为含20 μM PJ-34的2 ml完全培养基。
  7. 继续孵育18小时（37 °C，5% CO2）。
  8. 将细胞置于成像室中进行至少16小时的活细胞共聚焦成像，保持细胞环境为5% CO2和37 °C。
  9. 同时，在转染后36小时，通过荧光显微镜检测转染效率，步骤如下：
    1. 在6孔板中每孔放置一片盖玻片，加入2 ml完全培养基，接种2 × 105 MDA-MB-231细胞。
    2. 按照2.2–2.5节所述方法进行细胞转染。
    3. 转染后36小时，将贴附有细胞的盖玻片浸入冷甲醇:丙酮（1:1）溶液中，在-20 °C固定7分钟。
    4. 吸除固定液，将带有细胞的盖玻片置于通风橱中自然干燥。
    5. 滴加含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂，避光干燥6小时。
    6. 在荧光显微镜下观察载玻片，计算转染细胞（呈现红色和绿色信号）占总细胞群体（DAPI染色DNA）的百分比。当计数100–200个细胞时，理想的转染效率约为20–40%。

3. 活细胞共聚焦成像扫描仪设置的技术参数

  1. 扫描模式 XYZT；针孔 [airy] 1.00；缩放倍数 3.5；分辨率 8 位；激光器 DPSS 561 nm；氩离子可见激光 488 nm；He/Ne 可见激光 633 nm；物镜 HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV；数值孔径 1.4；扫描速度 700 Hz；折射率 1.52。
  2. 三维图像呈现由 IMARIS 成像软件 7.0 制备。

4. 固定细胞中分裂期的共聚焦成像

  1. 在6孔板中，将2 × 105个MDA-MB-231乳腺癌细胞（ATCC）、正常小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）或PARP1缺陷型MEF（PARP-/-，由Francoise Dantzer博士制备）接种于经96%乙醇清洗、无菌去离子水冲洗、干燥2小时后的玻璃盖玻片上，每孔加入2 ml完全培养基。
  2. 向培养基中加入PJ-34（10–30 μM），根据需要孵育一定时间（通常最长至96小时）。
  3. 用PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤盖玻片一次，随后在–20 °C条件下，用预冷的甲醇:丙酮（1:1）溶液固定细胞，孵育7分钟。
  4. 吸除固定液，将盖玻片置于通风橱中干燥（此阶段盖玻片可在–20 °C保存数周）。
  5. 用PBST（含0.1% Tween-20的PBS）洗涤盖玻片一次，以通透细胞膜，随后在PBST中加入10% NDS（正常驴血清）作为“封闭液”，于室温封闭细胞1小时。
  6. 将固定并通透的细胞与一抗在室温下孵育2小时（用于纺锤体和中心体染色）。一抗用封闭液稀释，稀释比例为：抗α-微管蛋白抗体（1:250）和抗γ-微管蛋白抗体（1:200）。一抗孵育操作如下：在6孔板盖子（倒置）上每张盖玻片对应位置滴加100 μl含抗体混合物的封闭液，轻柔地将细胞面朝下的盖玻片覆盖在液滴上，使细胞与抗体液滴接触，室温孵育2小时。
  7. 将盖玻片放回6孔板对应孔中，用PBST洗涤细胞3次。随后按照步骤4.6所述相同方法，使用荧光二抗对盖玻片上的细胞进行标记。在避光条件下，将细胞与二抗在室温孵育1小时。二抗用封闭液稀释，稀释比例为：Alexa Fluor 488（1:1,000稀释；绿色）和Alexa Fluor 568（1:1,000稀释；红色）。
  8. 使用含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂封片，并在避光条件下室温过夜干燥。
  9. 通过共聚焦显微镜观察盖玻片上的样品。

5. 通过ATP生成量测定细胞活力

ATP 的生成量通过化学发光 ATP 检测试剂盒进行测定。

  1. 将细胞接种于96孔板中，每孔加入约20,000个细胞和800 μl培养基。需设置三个空白孔，用于测定培养基的背景发光值。
  2. 配制ATP标准品稀释梯度，浓度范围约为10 μM至100 μM，并置于冰上保存。
  3. 每孔加入50 μl裂解液，在振荡培养箱中以700 rpm速度振荡5分钟。
  4. 用试剂盒中的“底物缓冲液”5 ml溶解每瓶“冻干底物”。
  5. 向各孔中加入50 μl重悬后的底物溶液，在振荡培养箱中以700 rpm速度振荡5分钟。
  6. 将96孔板避光放置10分钟。
  7. 使用酶标仪测定各孔的发光值。

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结果

PJ-34 是一种稳定的水溶性菲啶类化合物1（图1）。我们先前的研究结果表明，在多种经 PJ-34 处理的固定多中心体癌细胞中，观察到细胞死亡及额外中心体的解聚现象。相比之下，正常增殖细胞未受到损伤2,3。在固定后的额外中心体细胞中，通过针对 centrine1 和 γ-微管蛋白的双标抗体染色来鉴定中心体2。

在此，通过活细胞共聚焦显微镜实时记录了PJ-34在这些活的细胞外中心体细胞中的细胞毒性活性。具有高发生率的人类乳腺癌MDA-MB-231活细胞>50% 的额外中心体4,5，通过共聚焦成像对转染了γ-tubulin-GFP（γ-微管蛋白焦点的荧光标记）的细胞进行扫描，持续时间至少为16小时2）以及组蛋白H2b-RED（染色体的荧光标记）。每次实验中平行扫描6至10个活的转染细胞。由于技术限制，无法对转染细胞中的γ-微管蛋白焦点与centrin1进行双重免疫标记。

在随机选择的...

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讨论

活细胞共聚焦成像实时记录了PJ-34在有丝分裂期间对具有多个中心体的活细胞的细胞毒性作用（图3 和补充信息）。这是首次通过活细胞成像证实PJ-34在人类癌细胞中的细胞毒性作用与多余中心体的去簇集及细胞死亡相关，提示PJ-34可诱导有丝分裂灾难性细胞死亡5-9。相比之下，在正常进行有丝分裂的未经处理的MDA-MB-231活细胞中，观察到超数中心体呈双极簇集状态（图2，补充信息）。

根据这些结果，对转染细胞进行活细胞共聚焦成像可能有助于检测转染细胞有丝分裂过程中参与多余中心体聚集的蛋白质的转位情况5,9,15,16。鉴定在多中心体细胞中受PJ-34影响的蛋白质，可能为理解由多余中心体解聚所激活的细胞死亡机制提供一些线索。

活细胞共聚焦成像在有丝分裂过程中提供实时信息方面具有优势，但也存在若干局限性。每次实验扫描的细胞数量有限，因此检测到处于有丝分裂期细胞的概率较低，需要进行多次重复实验才能实现对扫描细胞中有丝分裂的实时记...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究的资助来源：特拉维夫大学技术转移公司RAMOT与舍巴医疗中心（M. C-A. 和 S.I.）的联合基金、以色列癌症研究基金会（ICRF）（M. C-A.）以及以色列科学基金会（S.I.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS（胎牛血清）Invitrogen (GIBCO)12657 
青霉素-链霉素-两性霉素溶液（Pen-Strep-Ampho solution）Biological Industries, Israel03-033-1B 
L-谷氨酰胺Invitrogen (GIBCO)25030-024 
0.25% 胰蛋白酶-EDTAInvitrogen (GIBCO)25200 
92 mm 培养皿Nunc, Thermo Scientific150350 
35 mm 多聚-D-赖氨酸包被的玻璃底培养皿MatTek Corporation, USAP35GC-0-14-C 
发光型ATP检测试剂盒Abcamab113849 
NDS（正常驴血清）Jackson ImmunoResearch017-000-121 
抗α-微管蛋白抗体SigmaT90261:250 稀释（IF）
抗γ-微管蛋白抗体SigmaT51921:200 稀释（IF）
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgGInvitrogenA-110171:1,000 稀释（IF）
Alexa Fluor 568 驴抗兔IgGInvitrogenA-100421:1,000 稀释（IF）
含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36935 
JetPEI（脂质体转染试剂）Polyplus101-10 
仪器
共聚焦显微镜Leica (Mannheim, Germany)TCS SP5II 

参考文献

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标签

PJ 34 H2B PARP1 MDA MB 231

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