共聚焦成像在肝癌细胞中观察到的异常有丝分裂细胞死亡相关

Summary

菲PJ-34在肿瘤细胞进行有丝分裂的细胞毒活性，实时记录现场共聚焦成像。 PJ-34根除人类乳腺癌MDA-MB-231细胞有丝分裂窝藏额外中心体。额外中心体不像正常的双向焦点有丝分裂，不聚集在两个纺锤体的两极存在的PJ-34。

Abstract

菲衍生物作为有力PARP1抑制剂阻止编外中心体多中心体的人类癌症细胞有丝分裂的双焦聚类。菲啶PJ-34是最有力的分子。额外中心体的分簇多中心体细胞有丝分裂失败的原因和细胞死亡。最坚实的人力癌症有额外中心体的发生率较高。 PJ-34的活性共聚焦成像活的人乳腺癌MDA-MB-231细胞转染载体编码荧光γ-微管蛋白，这是非常丰富的中心体和荧光蛋白H2B目前在实时记录染色体。转染与PJ-34处理后的MDA-MB-231细胞中检测到异常的染色体安排和γ-微管蛋白聚集疫源代表declustered中心体。非集群额外两个纺锤体两极的中心体细胞死亡之前。这些结果与FOr的第一次检测独家额外中心体的聚类在有丝分裂，有丝分裂失败导致细胞死亡在人类癌细胞中的PJ-34的细胞毒活性。根据以前的研究结果固定细胞共聚焦成像，PJ-34独家消灭癌细胞的多中心体，而不损害正​​常细胞发生有丝分裂，两个中心和双焦主轴的观察。这PJ-34的细胞毒活性不共享等烈性PARP1抑制剂，观察，表明其独立性PARP1抑制PARP1缺失的MEF窝藏extracentrosomes。现场共聚焦成像提供了一个有用的工具，用于识别新的分子，消除细胞在有丝分裂过程中。

Introduction

菲衍生PARP1抑制剂，包括PJ-34，旨在保护耗能PARP1介导的DNA修复应力条件下（中风或心肌梗死^）1静止期细胞诱导细胞凋亡。然而，最近我们发现，PJ-34，比诱导PARP1抑制浓度高出一倍，完全可以导致细胞死亡在人类癌细胞中^2,3。更快速的细胞增殖，细胞更有效地消灭了。 PJ-34的细胞毒活性归因于额外中心体聚集在有丝分裂^2。许多人类癌细胞海港multicentrosomes ^4,5。孵化人类乳腺癌细胞MDA-MB-231，怀有编外中心体，为20μmPJ-34有效地根除这些细胞在72-96小时内不损害静止细胞或一些良性增生的细胞，窝藏两个中心在有丝分裂 ^{2,3。良性的细胞包括人类乳腺上皮细胞MCF-10，人类内皮细胞（HUVEC），从人胸腺制备的原代骨髓间充质细胞。这些细胞耐PJ-34的细胞毒活性。 PJ-34没有干扰他们的细胞周期过程中培养96小时，或影响其中心体和双焦主轴形成2,3。}

双极双极^4,5在有丝分裂纺锤体的形成是至关重要的中心体组装。因此，有两个以上的中心体的细胞已经开发了一种几乎不理解的分子机制，多余的中心体，在两极^4-9聚类。双极其中心体组装的失败可能会导致多极化扭曲纱锭和异常染色体分离逮捕细胞周期G2 / M期阻滞，并导致细胞死亡归因于有丝分裂失败^4,5。额外中心体....

Protocol

1。细胞培养制备

MDA-MB-231细胞购自美国典型培养物保藏中心 （ATCC），并保存于液氮中。

1. 种子10 ⁶个MDA-MB-231细胞在92毫米直径的陪替氏培养皿在10毫升完全培养基中Dulbeco改进的Eagle培养基（DMEM），10％马血清，1％L-谷氨酰胺和1％两性霉素B。Penstrep允许细胞的激增至约80-100％汇合。
2. 从盘取出培养基并丢弃。
3. 简单细胞层洗净，用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液（W / V）的血清清除所有痕迹。
4. 添加2.0毫升胰蛋白酶-EDTA溶液菜倒置显微镜观察细胞，直到细胞层分散（通常在5至15分钟内）。
5. 加入18毫升完全培养基，用吸管轻轻吸出细胞。转移到管。
6. 在1,200 rpm离心细胞悬浮液。
7. 重悬细胞沉淀在24毫升的铜介质lture。
8. 加入2 ml的细胞悬液，以35毫米的玻璃底菜（约25％汇合），在培养箱（5％CO _{2，37℃）。}
9. 解决方案:
   1. 的完整的细胞的增殖培养基:DMEM培养基含10％FBS，1％抗生素（100单位/毫升青霉素G，100微克/毫升链霉素，笔链球菌AMPHO的溶液）和2mM L-谷氨酰胺。
   2. 胰蛋白酶-EDTA溶液中....

Results

PJ-34是一种稳定的水溶性菲啶^1（ 图1）。我们先前的研究发现细胞死亡和集群额外中心体在几种类型的固定的多中心体肿瘤细胞，分别用PJ-34。相比之下，正常增殖细胞没有受损^2,3。针对centrine1在固 ​​定的额外中心体细胞²和γ-微管蛋白的抗体双标记进行鉴定中心体。

在这里，记录在这些现场额外中心体细胞的杀伤活性PJ-34实时通过现场共聚焦显微镜。现场人乳腺癌MDA-MB-231细胞，其中有一个发生率较高（> 50％）的额外中心体^4,5，专注于与γ-微管蛋白GFP转染细胞共聚焦成像扫描至少16小时（荧光标记的γ-微管蛋白灶^2）和组蛋白H2B红（荧光拉贝染色体玲）。六至十个活转染的细胞平行扫描，在每个实验中。 γ-微管蛋白在转染细胞centrin1灶双免疫标记在技术上是不可能的。

灶分散的γ-微管蛋白和异常染色体的安排，很少发现在随机选取的未经处理的MDA-MB-231细.......

Discussion

实时共焦成像提供了一种实时PJ-34的细胞毒作用在活的多中心体的细胞在有丝分裂过程中（ 图3和补充信息）的文档。这是第一次现场文档PJ-34在人类癌细胞中的细胞毒性归因额外中心体聚类和细胞死亡，表明诱导细胞死亡的有丝分裂灾难PJ-34 ^5-9。与此相反，双焦聚类数目的超中心体中观察到活的未处理的MDA-MB-231细胞进行正常的有丝分裂与双向focali的群集的多余的中心体（ 图2，补充资料）。

根据这些结果，活转染细胞共聚焦成像牵连额外中心体聚类在转染细胞的蛋白质在有丝分裂过程中^5,9,15,16检测易位可能是有用的。 PJ-34的影响在多centros的蛋白质的鉴定理解的死亡机制，激活额外中心体聚类，OMAL细胞可能会提供一些​​线索。

在活细胞的有丝分裂过程中提供实时信息，现场共聚焦成像的优势也势必一些限制。扫描每个实验的细胞的数量是有限的。因此，检测细胞在有丝分裂中的机会是低，并且所需要的一个实时文件扫描细胞.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
DMEM	Invitrogen （GIBCO）	41965
FBS （胎牛血清）	Invitrogen （GIBCO）	12657
Pen-Strep-Ampho solution	以色列生物工业	03-033-1B
L-谷氨酰胺	Invitrogen （GIBCO）	25030-024
0.25% 三萃辛-EDTA	Invitrogen （GIBCO）	25200
92 mm 培养皿	Nunc，Thermo Scientific	150350
35 mm 聚-D-赖氨酸涂层玻璃底培养皿	美国 MatTek Corporation	P35GC-0-14-C
发光 ATP 检测试剂盒	Abcam	ab113849
NDS（正常驴血清）	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
抗 α-微管蛋白抗体	Sigma	T9026	1：250 稀释度 （IF）
抗 &γ;-微管蛋白抗体	Sigma	T5192	1：200 稀释度 （IF）
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	A-11017	1：1,000 稀释度 （IF）
Alexa Fluor 568 驴抗兔 IgG	Invitrogen	A-10042	1：1,000 稀释度 （IF）
ProLong Gold 抗淬灭试剂（含 DAPI）（封片）	Invitrogen	P36935
JetPEI （脂质体转染试剂）	Polyplus	101-10
设备
共聚焦显微镜	Leica （德国曼海姆）	TCS SP5II