从人脂肪抽吸物中手动分离脂肪来源干细胞

摘要

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从脂肪组织中分离成体干细胞群体的方法，这类细胞被称为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem Cells，ASCs）。本文概述了使用胶原酶进行人工酶消化法从吸脂术获取物中分离ASCs的步骤。

摘要

2001年，加州大学洛杉矶分校的研究人员描述了一种从抽脂术获取的脂肪组织中分离出的新成人干细胞群体，他们最初将其称为处理后的抽脂细胞（Processed Lipoaspirate Cells）或PLA细胞。此后，这些干细胞被重新命名为脂肪来源干细胞（Adipose-derived Stem Cells）或ASCs，并已成为干细胞研究和再生医学领域中最受欢迎的成人干细胞群体之一。目前已有数千篇文章描述了ASCs在多种再生动物模型中的应用，包括骨再生、周围神经修复和心血管组织工程。最近的一些文章开始报道ASCs在临床中的多种用途。本文所示方案概述了从整形手术获得的大量抽脂物中，通过人工和酶解方法手动分离ASCs的基本操作步骤。该方案可轻松根据抽脂物的体积进行放大或缩小，并可调整用于从腹壁成形术及其他类似手术获得的脂肪组织中分离ASCs。

引言

2001年，《组织工程》杂志报道了一群源自脂肪组织的多能干细胞群体 ¹这些细胞因来源于通过整形手术获得的经处理的抽吸脂肪组织，故被命名为处理后的抽吸脂肪细胞（Processed Lipoaspirate cells，PLA细胞）。本文所述的分离方法基于现有的酶消化法，用于从脂肪组织中分离基质血管组分（stromal vascular fraction，SVF）。 ²SVF 被定义为一种经最小程度处理的细胞群体，包含尚未贴附于组织培养基质的红细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、周细胞和前脂肪细胞。 ^{2, 3}随着时间推移对这一基质血管组分（SVF）进行培养，被认为可消除其中多数污染性细胞群体，从而获得一种贴壁生长的成纤维细胞样细胞群。在过去40年的文献中，这些成纤维细胞被认定为前脂肪细胞。然而，我们研究团队证实这些细胞具有中胚层多向分化潜能，并将贴壁的SVF细胞群重新命名为PLA细胞。随后，多个其他研究团队的进一步研究扩展了其分化潜能，提示其可能同时具备内胚层和外胚层分化潜能（综述见 ⁴）。自那时起，文献中陆续出现了许多用于描述这些细胞的其他术语。为了达成一定程度的共识，脂肪源性干细胞（Adipose-derived Stem Cells）或 ASCs 这一术语在第二届^nd 年度IFATS会议。因此，本文将使用术语ASC。

本文所述方案是一种相对简单的操作流程，仅需....

方案

本文所示方案描述了通过美容手术获得的脂肪抽吸物，利用酶消化法和差速离心法手动分离脂肪来源的基质细胞（ASCs）的实验步骤。该方案最初于2001年发表在《组织工程》（Tissue Engineering）期刊上。 ¹，由于这些细胞是从脂肪抽吸物中分离得到的，因此被称为加工后脂肪抽吸物细胞（Processed Lipoaspirate Cells）或PLA细胞。然而，目前“PLA细胞”这一术语已被“”所取代 脂肪来源的干细胞或ASCs 以使该领域在命名法上具有一定的规范性。通过本方案分离的细胞已被多项研究证实具有中胚层分化潜能 体外 和 体内 （综述详见 ⁴此外，还探索了ASC的外胚层和内胚层分化潜能 ⁴分离技术简单直接，完成整个过程约需一小时。获得的细胞在标准组织培养条件下进行培养。随着培养时间的延长，脂肪源性干细胞（ASC）群体逐渐趋于均一，主要由成纤维样细胞组成，这些细胞易于扩增，并在长期培养中保持良好的活力。

注意： 本文末尾列出了所需的以下设备。所有玻璃器皿、培养基和试剂均应通过高压灭菌或经0.22 μm滤器过滤进行灭菌。应始终遵循无菌细胞培养技术。为确保无菌操作，所有放入生物安全柜的材料均需用70%乙醇溶液喷洒，并用洁净的纸巾擦拭灭菌。

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结果

上述方案概述了一种从大体积脂肪抽吸物样本中分离基质血管组分（SVF）的手动酶解方法。该SVF中含有多种细胞群体，包括脂肪源性基质细胞（ASC）。大量研究表明，在标准组织培养条件下培养该SVF可富集贴壁的成纤维细胞样细胞群，其主要成分为ASC。与此一致，我们通过流式细胞术和免疫荧光分析证实，培养后的SVF细胞沉淀物基本上消除了主要的污染细胞类型，即红细胞（RBCs）、平滑肌细胞以及内皮细胞谱系细胞。 ¹. 所获得的ASC群体在形态上相对均一，由成纤维细胞样细胞组成（图2这些贴壁的ASCs在标准的组织培养条件下培养时生长良好，且具有中等的群体倍增时间 ¹ 使其适用于多种分子与细胞生物学研究 体外 再生研究 在体然而，鉴于分离得到的基质血管组分（SVF）具有异质性，有必要对ASC群体进行验证。已有大量研究采用流式细胞术来表征培养后ASCs的CD抗原谱，作为识别这些细胞的潜在方法 体外 和 在体 ^5-9. 表1 总结了多项此类研究的结果。.......

讨论

用于分离ASCs的脂肪组织有多种来源：可通过切除术或抽脂术获得的实体组织块，也可通过注射器抽取或负压辅助抽脂术获得的较小组织块即 吸脂术）。目前尚不明确从切除或抽吸获得的脂肪样本中是否能获取更多的基质血管组分（SVF）细胞（从而获得更多的脂肪来源干细胞，ASCs），因为已有相互矛盾的研究结果被报道 ^{16, 17}有可能，只要操作者熟练掌握分离技术，任一种脂肪组织均足以用于分离基质血管组分（SVF）细胞和脂肪源性间充质干细胞（ASCs）。然而，与手术切除相比，抽脂术具有创伤更小、术后护理需求显著减少的优势。尽管过去十年间抽脂术的类型不断增加，包括超声辅助、动力辅助以及激光辅助抽脂术等技术 ¹⁸最常见的是肿胀性吸脂术，即在抽吸前向脂肪组织注入大量无菌生理盐水、麻醉剂和血管收缩剂 ¹⁹不同外科医生在技术选择上可能有所不同。然而，尽管提取方法对研究者而言似乎并不重要，但必须认识到，这些技术可能会对脂肪来源干细胞（ASC）的数量和活性产生影响。例如，增加抽脂术的负压可能会对基质血管组分（SVF）细胞的得率产生负面影响。 ²⁰此外，已有研究测得在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
DMEM（Dulbecco）’s 改良的伊格尔培养基’s 培养基)	Mediatech Cellgro	10-013-CV	含 4.5 g/ml 葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠
青霉素/链霉素	Mediatech Cellgro	30-002-CI	10,000 IU/ml 青霉素/10,000 μg/ml 链霉素
两性霉素B	Mediatech Cellgro	30-003-CF	250 μg/ml 两性霉素B
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）	Mediatech Cellgro	25-053-CI	无钙，无镁
胰蛋白酶/EDTA	Mediatech Cellgro	20-031-CV	0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA
胶原酶 IA 型（来自溶组织梭菌）	Sigma	C2674	粗提物 <125 胶原消化单位/毫克固体
FBS（胎牛血清）热灭活	Gemini Bioproducts	100106	美国农业部来源，热灭活
10 ml 血清移液管	Genesee Scientific	12-104
25 ml 血清移液管	Genesee Scientific	12-106
50 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-106
100 mm 组织培养皿	Genesee Scientific	25-202
150 毫米组织培养皿	Genesee Scientific	25-203
500 ml Stericup 滤器单元	Millipore	SCGPU05RE	PES 膜，0.22 μ微孔
细胞筛	FisherBrand	22-363-549	100 μm 尼龙网
地塞米松 - 水溶性	Sigma	D-2915
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma	A-8960
β甘油磷酸二钠盐	Sigma	G-9422	也称为甘油磷酸酯
胰岛素	Sigma	I-6634	由牛胰腺制成
吲哚美辛	Sigma	I-7378
脱铁转铁蛋白	Sigma	T-4382
TGFβ1	R&D Systems	240-B-002	重组人
油红O	Sigma	O-0625
阿利新蓝	Sigma	A-5268
硝酸银	Sigma	S-0319
盐酸	Fisher Scientific	A144
多聚甲醛	Fisher Scientific	30525-89-4	以16%的储存液形式提供
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<强>所需设备
II 级 A/B 型生物安全柜	赛默飞世尔科技		确保通风橱配有用于抽吸的真空管路
台式离心机	赫姆勒实验室网	Z383	需要用于50 ml离心管的甩平式转子，可承受1200×g离心力
水浴锅	Fisher Scientific Isotemp	S52602Q	容量5-10升，可达到37°C
自动移液器辅助装置	Drummond Pipette Aid XL	4-000-105
CO2 培养箱	赛默飞世尔科技	Forma 310	直接加热或水套式