我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。
我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。
中性粒细胞是先天免疫系统的关键效应细胞。它们在急性炎症部位被迅速募集，并根据炎症微环境发挥保护性或致病性作用。然而，尽管中性粒细胞在免疫中具有不可或缺的作用，目前对其在不同感染性疾病和炎症状态下介导效应功能及免疫病理作用的分子机制仍缺乏深入理解，部分原因在于这些细胞的半衰期较短、操作困难，以及缺乏可靠的实验方案来获取足够数量的中性粒细胞，以用于后续功能研究和过继转移实验。因此，迫切需要简单、快速、经济且可靠的方法，以获得足够数量的小鼠中性粒细胞，用于评估其吞噬、杀伤、细胞因子产生、脱颗粒和迁移等功能。为此，我们提供了一种可重复的基于密度梯度离心的实验方案，该方法可在任何实验室中用于从小鼠骨髓中分离出大量高纯度和高活性的中性粒细胞。此外，我们还介绍了一种简单的方法，使用CellTracker染料对分离得到的中性粒细胞进行标记，随后可将这些细胞过继转移至受体小鼠，并通过流式细胞术在转移后至少4小时内追踪其在多种组织中的分布情况。利用该方法，可通过不同CellTracker染料对来自野生型和基因缺陷型小鼠的中性粒细胞进行差异标记，从而成功开展竞争性重constitution实验，以评估特定基因在中性粒细胞从血液向靶组织迁移过程中的直接作用in vivo。
中性粒细胞是人体内最丰富的白细胞。它们是先天免疫系统的主要细胞组分，在抵御入侵微生物方面发挥着第一道防线的作用。获得性中性粒细胞减少症以及影响中性粒细胞数量和/或功能的原发性免疫缺陷患者容易发生危及生命的侵袭性细菌和真菌感染，这凸显了这些细胞在宿主防御中的重要性1。在感染部位，病原体通过其特异性模式识别受体被免疫系统识别，从而诱导协调的先天免疫应答，促使趋化因子的分泌，形成趋化梯度，将中性粒细胞从血液中募集至炎症组织2。当中性粒细胞进入感染部位后被激活，进而产生细胞因子和趋化因子，通过氧化和非氧化机制摄取并杀灭病原体3。除了在先天免疫中公认的作用外，近年来的研究还表明，中性粒细胞在启动有效的适应性免疫应答中也发挥着重要作用4。另一方面，除了在免疫防御中的保护性作用外，中性粒细胞也可能因在炎症部位过度聚集和/或过度活化，介导组织损伤和免疫病理过程，这一点已在多种感染性和自身免疫性疾病中得到证实5-7。
尽管中性粒细胞在启动有效的先天免疫应答以及在多种感染性疾病和炎症状态中具有多效性效应功能，但由于处理这些细胞的技术困难以及缺乏可靠的实验方案，过去几十年中中性粒细胞的研究一直受到阻碍。因此，采用可重复的检测方法分离中性粒细胞将有助于进一步开展体外（ex vivo）和体内（in vivo）的中性粒细胞介导的免疫学功能研究。迄今为止，已有....
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1. 小鼠骨髓细胞的分离
注意：骨骼发白表明细胞已被充分刮除。
注意：冲洗一对股骨/胫骨时，使用约 10 ml ....
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本方案经过优化，适用于从小鼠中收获骨髓细胞，并利用市售的Histopaque细胞分离介质通过密度梯度离心法从这些细胞中分离中性粒细胞。采用该方法分离的中性粒细胞可用于多种后续功能研究。 离体 用于受体小鼠的过继转移实验。
从一只未感染的8-12周龄C57BL/6小鼠的双侧股骨和胫骨中收集骨髓细胞，通常可获得约6000万至8000万个细胞，细胞活力约为94-98%。使用Histopaque密度分离介质对这些细胞进行后续密度梯度离心，通常可从一只未感染小鼠中获得约600万至1200万个中性粒细胞。经流式细胞术验证（图1），所获中性粒细胞纯度为80-95%，活力>95%。尽管可在密度梯度离心前将多只动物的骨髓细胞合并，但细胞合并会略微降低分离所得中性粒细胞的纯度。例如，将一只未感染小鼠的6000万至8000万个骨髓细胞重悬于1-3 ml PBS中进行分层，可获得>90%纯度的中性粒细胞；而当将约3亿个骨髓细胞合并后重悬于3 ml PBS中进行分层时，细胞纯度则下降至约80%。
此外.......
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本文介绍一种可靠、简单、快速且经济的方法，通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出大量高纯度和高活性的中性粒细胞。若正确执行本方案，可从一只未感染的小鼠中获得约 6-12 × 106 个中性粒细胞，而在感染后的小鼠中最多可分离出约 30-40 × 106 个中性粒细胞6。所分离的中性粒细胞纯度为 80–95%，活性超过>95%。
骨髓是获取小鼠中性粒细胞用于下游功能研究和过继转移实验的合适来源。首先，已有研究表明，小鼠骨髓中性粒细胞在功能上与血液中性粒细胞相似，因为这两个区室的细胞均表现出类似的氧化爆发和脱颗粒能力16。其次，研究显示小鼠骨髓中性粒细胞在体外培养中可存活较长时间，显著长于小鼠血液中性粒细胞16。因此，在进行离体（ex vivo）功能检测时，采集骨髓中性粒细胞相较于血液中性粒细胞可获得更高的细胞产量。第三，从中性粒细胞的分离角度而言，骨髓来源的优势在于能够回收到数量显著更多的中性粒细胞，这些细胞数量足以满足稳态条件下及感染后进行下游过继转移.......
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作者声明不存在任何竞争利益。
本工作得到了美国国家卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所（NIAID）院内研究部的支持。
所有小鼠均饲养于美国过敏与传染病研究所（NIAID）经美国实验动物照护评估认证协会（American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care）认证的动物实验设施中，并根据《实验动物照护与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）中所述程序，在NIAID动物照护与使用委员会批准的实验方案监督下进行管理。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| RPMI 1640 1X，含L-谷氨酰胺和25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| 胎牛血清（热灭活） | GemCell | 100500 | |
| 青霉素/链霉素（10,000单位青霉素 / 10,000 mg/ml链霉素） | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% 和 1.6% 氯化钠溶液 | JT Baker | 3624 | 使用蒸馏水配制并经无菌过滤的氯化钠溶液 |
| 无菌过滤的Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077在使用前需升温至18–26 °C |
| 无菌过滤的Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119在使用前需升温至18–26 °C |
| 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS） | Cellgro | 210-40-CV | |
| 乙醇（200 proof） | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green（CMFDA，5-氯甲基荧光素二乙酸酯） | Invitrogen | C-7025 | 用DMSO配制10 mM储存液，分装后于-80 °C保存 |
| CellTracker Orange（CMTMR，5-(和6)-4-氯甲基苯甲酰氨基四甲基罗丹明） | Invitrogen | C-2927 | 用DMSO配制10 mM储存液，分装后于-80 °C保存 |
| 抗小鼠CD45抗体（克隆30-F11） | eBioscience | 170451-82 | |
| 抗小鼠Ly6G抗体（克隆1A8） | BD Pharmingen | 551461 | |
| 抗小鼠Ly6G抗体（克隆1A8） | BD Pharmingen | 560599 | |
| 抗小鼠CD11b抗体（克隆M1/70） | eBioscience | 47-0112-82 | |
| 抗小鼠CD16/CD32抗体（小鼠BD Fc阻断剂） | BD Pharmingen | 553141 | 使用时稀释比例为1:100 |
| LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Molecular Probes | L-23105 | 使用时稀释比例为1:1000 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | 67-68-5 | |
| 4%多聚甲醛PBS溶液 | USB Corporation | 19943 | |
| 表1. 用于过继转移中性粒细胞的分离、标记和追踪的试剂。 | |||
| 材料 | |||
| C57BL/6小鼠 | Taconic | ||
| 15 ml离心管 | Corning | 430053 | |
| 50 ml离心管 | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml移液管 | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml移液管 | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml移液管 | Celltreat | 229205B | |
| 巴斯德吸管（3 ml） | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml注射器 | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G × 5/8 in. 针头（精密滑动针头） | BD | 305122 | |
| 100 mm细胞筛 | BD Falcon | 352360 | |
| 杀菌型培养皿 | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| 小鼠解剖器械（剪刀、镊子、手术刀） | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | 使用前已灭菌的器械 |
| 设备 | |||
| 组织培养超净台 | The Baker Company | SG403 | |
| 冷冻离心机 | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C振荡水浴箱 | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| 表2. 本实验方案中使用的材料和设备清单。 |
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