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方法文章

小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验

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DOI：

10.3791/50586

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2013年7月10日

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

本文内容

摘要

我们描述了一种通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离和纯化中性粒细胞，并使用CellTracker染料对中性粒细胞进行标记的实验方案。该方法简单、快速、可重复且经济，适用于获取大量中性粒细胞，以用于后续的功能研究或过继转移与示踪实验。

摘要

中性粒细胞是先天免疫系统的关键效应细胞。它们在急性炎症部位被迅速募集，并根据炎症微环境发挥保护性或致病性作用。然而，尽管中性粒细胞在免疫中具有不可或缺的作用，目前对其在不同感染性疾病和炎症状态下介导效应功能及免疫病理作用的分子机制仍缺乏深入理解，部分原因在于这些细胞的半衰期较短、操作困难，以及缺乏可靠的实验方案来获取足够数量的中性粒细胞，以用于后续功能研究和过继转移实验。因此，迫切需要简单、快速、经济且可靠的方法，以获得足够数量的小鼠中性粒细胞，用于评估其吞噬、杀伤、细胞因子产生、脱颗粒和迁移等功能。为此，我们提供了一种可重复的基于密度梯度离心的实验方案，该方法可在任何实验室中用于从小鼠骨髓中分离出大量高纯度和高活性的中性粒细胞。此外，我们还介绍了一种简单的方法，使用CellTracker染料对分离得到的中性粒细胞进行标记，随后可将这些细胞过继转移至受体小鼠，并通过流式细胞术在转移后至少4小时内追踪其在多种组织中的分布情况。利用该方法，可通过不同CellTracker染料对来自野生型和基因缺陷型小鼠的中性粒细胞进行差异标记，从而成功开展竞争性重constitution实验，以评估特定基因在中性粒细胞从血液向靶组织迁移过程中的直接作用in vivo。

引言

中性粒细胞是人体内最丰富的白细胞。它们是先天免疫系统的主要细胞组分，在抵御入侵微生物方面发挥着第一道防线的作用。获得性中性粒细胞减少症以及影响中性粒细胞数量和/或功能的原发性免疫缺陷患者容易发生危及生命的侵袭性细菌和真菌感染，这凸显了这些细胞在宿主防御中的重要性1。在感染部位，病原体通过其特异性模式识别受体被免疫系统识别，从而诱导协调的先天免疫应答，促使趋化因子的分泌，形成趋化梯度，将中性粒细胞从血液中募集至炎症组织2。当中性粒细胞进入感染部位后被激活，进而产生细胞因子和趋化因子，通过氧化和非氧化机制摄取并杀灭病原体3。除了在先天免疫中公认的作用外，近年来的研究还表明，中性粒细胞在启动有效的适应性免疫应答中也发挥着重要作用4。另一方面，除了在免疫防御中的保护性作用外，中性粒细胞也可能因在炎症部位过度聚集和/或过度活化，介导组织损伤和免疫病理过程，这一点已在多种感染性和自身免疫性疾病中得到证实5-7。

尽管中性粒细胞在启动有效的先天免疫应答以及在多种感染性疾病和炎症状态中具有多效性效应功能，但由于处理这些细胞的技术困难以及缺乏可靠的实验方案，过去几十年中中性粒细胞的研究一直受到阻碍。因此，采用可重复的检测方法分离中性粒细胞将有助于进一步开展体外（ex vivo）和体内（in vivo）的中性粒细胞介导的免疫学功能研究。迄今为止，已有多种中性粒细胞分离方法被报道，例如通过密度梯度离心法从人血、小鼠血液或骨髓中分离中性粒细胞8,9，利用正向或负向免疫磁珠富集法从小鼠血液或骨髓中富集中性粒细胞10,11，以及在向小鼠腹腔内注射巯基乙酸盐或其他炎性试剂后从小鼠腹腔中收集中性粒细胞12。尽管可从人血中较容易地大量分离中性粒细胞，但由于小鼠血液体积有限，难以获得足够数量的中性粒细胞用于功能研究或过继转移实验，因此该方法在小鼠中并不理想13。此外，虽然腹腔注射巯基乙酸盐后诱导产生的细胞产量高于小鼠血液来源的细胞，但炎性腹腔灌洗液中中性粒细胞的纯度在60%-90%之间波动，且所分离的中性粒细胞呈现活化表型。因此，该方法获得的细胞仅可用于活化中性粒细胞的功能研究，而不能用于未刺激中性粒细胞的研究，因为在稳态下小鼠腹腔中的中性粒细胞数量极少12。相比之下，骨髓是获取大量未刺激或已活化中性粒细胞的便捷来源11,14，这些细胞随后可用于吞噬、杀伤和脱颗粒等下游功能研究，或用于过继转移至受体小鼠体内。

本文介绍一种简单且快速（约2小时）的实验方案，可从骨髓中获得高产量（每只未感染小鼠约6-12 × 106个中性粒细胞，或每只感染小鼠最多30-40 × 106个中性粒细胞）、高纯度（80–95%）且活力超过>95%的中性粒细胞。该方法利用市售的Histopaque介质（由Ficoll和泛影酸钠组成的密度梯度细胞分离介质）从小鼠骨髓中分离中性粒细胞。与从小鼠血液或腹腔获取相比，该方法每只小鼠可获得显著更多的中性粒细胞，可用于稳态或感染后小鼠中性粒细胞的收集，且操作上比使用PBS中55%/65%/75%不连续Percoll梯度的密度梯度离心法更易于分层9。此外，与荧光激活细胞分选法分离中性粒细胞相比，该方法在获取高纯度中性粒细胞时所需的时间和资源显著减少。同时，由于该方法不涉及免疫磁珠富集步骤，因此更具成本效益，并避免了细胞与磁性柱及抗体的接触，从而降低了中性粒细胞被激活的可能性。

除了对分离的中性粒细胞进行功能研究外 离体 以及将细胞过继转移至受体小鼠，本方案还描述了一种使用不同CellTracker染料对分离的中性粒细胞进行标记的方法。通过对不同遗传背景小鼠来源的中性粒细胞进行差异标记，可在竞争性重constitution研究中结合流式细胞术追踪受体小鼠组织内转移的中性粒细胞，从而揭示特定基因在中性粒细胞从血液向靶向炎症器官迁移过程中的直接作用机制 6.

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方案

1. 小鼠骨髓细胞的分离

  1. 按照所在机构动物护理委员会批准的方案实施小鼠安乐死，并用70%乙醇喷洒动物体表。
  2. 于腹部中线处切开皮肤，剥离小鼠远端皮肤，包括覆盖下肢部位的皮肤。
  3. 使用剪刀剪除下肢肌肉组织，并小心将髋臼从髋关节中脱位，注意避免破坏股骨头。
  4. 使用解剖刀和剪刀去除股骨和胫骨上残留的肌肉组织，在膝关节处分离股骨与胫骨，操作时注意避免损伤骨端。将分离的骨骼置于含有冰上预冷的RPMI 1640 1X培养基（添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）的培养皿中。
  5. 后续步骤均在组织培养超净台内进行。需格外注意保持严格的无菌操作，以避免中性粒细胞被激活。
  6. 用70%乙醇（在培养皿内）冲洗每根骨骼，随后用冰上预冷的无菌PBS冲洗三次（在培养皿内），以彻底去除骨骼表面残留的乙醇。
  7. 在洁净无菌的培养皿内，切除骨骼的骨骺端，并将其保留备用。
  8. 使用一支装有RPMI培养基（添加10%胎牛血清和2 mM EDTA）的12 ml注射器连接25号针头，从骨髓腔两端冲洗骨髓细胞，使细胞流入配有100 μm滤网的50 ml螺口Falcon管中。为充分释放所有细胞，可用25号针头刮擦骨内表面。

注意：骨骼发白表明细胞已被充分刮除。

注意：冲洗一对股骨/胫骨时，使用约 10 ml 培养基。在培养基中添加 EDTA 对防止细胞聚集至关重要。

  1. 用手术刀将骨骺切成约 0.5–1 mm3 的小块，并使用 2.5 ml Eppendorf Combitip Plus Biopur 移液器吸头的尾端将组织压过 100 μm 滤膜。
  2. 在 4 °C 下以 1,400 rpm 离心 7 分钟。
  3. 通过将细胞沉淀重悬于 20 ml 0.2% NaCl 溶液中约 20 秒以裂解红细胞，随后加入 20 ml 1.6% NaCl 溶液。（关键：低渗裂解时间不得超过 20–30 秒，以免导致骨髓细胞死亡。推荐使用低渗 NaCl 溶液进行裂解，而非 ACK 裂解缓冲液，因为后者可能激活中性粒细胞）。
  4. 在 4 °C 下以 1,400 rpm 离心 7 分钟，收集细胞。
  5. 用含 10% FBS 和 2 mM EDTA 的 RPMI 1640 1X 培养基洗涤细胞，并按照步骤 1.12 的条件进行离心。
  6. 采用此方法，每只未感染的 8–12 周龄 C57BL/6 小鼠可获得约 6,000 万至 8,000 万个骨髓细胞。

2. 通过密度梯度离心法分离中性粒细胞

  1. 计数骨髓细胞，并重悬于1 ml预冷的无菌PBS中。
  2. 在15 ml锥形管中加入3 ml Histopaque 1119（密度为1.119 g/ml）。
  3. 将3 ml Histopaque 1077（密度为1.077 g/ml）覆盖在3 ml Histopaque 1119之上。

注意：使用前应将 Histopaque 1119 和 Histopaque 1077 预热至 18–26 °C。

关键步骤：请在使用前立即制备梯度液，因为提前制备会导致两层之间发生扩散，从而降低中性粒细胞的纯度和回收率。

关键步骤：将 Histopaque 1077 缓慢覆盖在 1119 之上，以避免两种密度介质混合，否则会导致离心过程中细胞无法分离。

  1. 将骨髓细胞悬液覆盖在 Histopaque 1077 液面上方。

关键步骤：将骨髓细胞悬液覆盖在Histopaque 1077上时需缓慢操作，以避免扰动细胞与Histopaque 1077之间的界面。

注意：将未感染小鼠的骨髓细胞重悬于 1 ml PBS 中，可获得纯度 >90% 的中性粒细胞。然而，合并多个骨髓样本会降低中性粒细胞纯度；例如，将 300 × 106 个细胞重悬于 3 ml PBS 中，中性粒细胞纯度会从 >90% 下降至约 80%。因此，研究人员应进行预实验，以确定其特定实验所需的理想细胞数量与体积条件。

  1. 在25 °C下以2,000 rpm转速离心30分钟，不启用刹车。

注意：在室温下对梯度液进行离心是有效分离中性粒细胞的关键步骤，必不可少。

  1. 收集位于 Histopaque 1119 与 Histopaque 1077 层之间的中性粒细胞。
  2. 用添加了10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640 1X培养基将收集的中性粒细胞洗涤两次，并在4 °C下以1,400 rpm离心7分钟。
  3. 计数中性粒细胞并测定其活力。

注意：中性粒细胞通常 >95% 可存活且 >经FACS分析确定，纯度达90%。从骨髓中分离中性粒细胞的典型得率即 2根股骨和2根胫骨）的未感染8-12周龄C57BL/6小鼠中可获得约600万至1200万个细胞。当从中感染动物的骨髓中收获中性粒细胞时，该数量显著增加。因此，每只小鼠可回收约3000万至4000万个中性粒细胞。 假丝酵母用于细胞采集的感染小鼠 6.

3. 使用 CellTracker 染料标记中性粒细胞

  1. 将中性粒细胞重悬于预热至 37 °C 的 PBS 中，细胞密度为 5 × 106 个细胞/ml。
  2. 加入 CellTracker 染料，终浓度为 5 μM。

注意：本实验方案使用 CellTracker Green（CMFDA（5-氯甲基荧光素二乙酸酯））和 CellTracker Orange（CMTMR（5-(和-6)-4-氯甲基苯甲酰氨基四甲基罗丹明））对来自野生型小鼠和基因缺陷型小鼠的中性粒细胞进行差异标记。

注意：配制 10 mM 的 CellTracker Green 和 CellTracker Orange 储存液，分装后于 -80 °C 保存，直至实验当日使用。

  1. 在避光条件下，于37 °C振荡水浴中，用5 μM相应的CellTracker染料孵育中性粒细胞10分钟。
  2. 用预冷的含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640 1X培养基洗涤细胞两次。

注意：在使用CellTracker染料标记后，对细胞进行有效洗涤至关重要，以避免在混合不同标记的中性粒细胞群体进行后续竞争性重constitution研究前发生染料交叉污染。

4. 小鼠中性粒细胞的过继转移及通过流式细胞术分析转移的中性粒细胞

  1. 将中性粒细胞在冰浴 PBS 中重悬，浓度为 25 × 106 个细胞/ml，每只小鼠经尾静脉注射 200 μl 悬液，使每只小鼠转移 5 × 106 个中性粒细胞。对于中性粒细胞竞争性重殖研究，将野生型与基因缺陷型中性粒细胞按 1:1 比例混合，并按上述方法每只小鼠注射总共 5 × 106 个中性粒细胞。

注意：每只小鼠可过继转移至少高达 10 × 106 个中性粒细胞，且对动物无明显急性毒性。

  1. 过继转移后的不同时间点（例如 转移后1、2、3或4小时，处死小鼠并采集血液和/或骨髓和/或其它目标器官。
  2. 采用已发表的方案从这些组织制备单细胞悬液，用于过继转移标记中性粒细胞的定量和定性分析 6,15.
  3. 经活/死细胞活力染色及Fc受体阻断后，使用CD45（克隆30-F11）、Ly6G（克隆1A8）和CD11b（克隆M1/70）对细胞进行标记，并圈选活的CD45阳性细胞群体+ Ly6G+ CD11b+ 中性粒细胞。此门控中的中性粒细胞包括受体小鼠自身的中性粒细胞以及通过过继转移导入的标记中性粒细胞，后者为FITC标记+ （若使用 CellTracker Green 标记）或 PE+ （若使用Cell Tracker Orange标记）

注意：中性粒细胞可在血液、骨髓和肾脏中进行追踪 假丝酵母-感染的小鼠至少4小时。

注意：在 PBS 中使用 2% 多聚甲醛固定至少 48 小时，不会对用 CellTracker Green 或 CellTracker Orange 标记的中性粒细胞的平均荧光强度产生不利影响。

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结果

本方案经过优化，适用于从小鼠中收获骨髓细胞，并利用市售的Histopaque细胞分离介质通过密度梯度离心法从这些细胞中分离中性粒细胞。采用该方法分离的中性粒细胞可用于多种后续功能研究。 离体 用于受体小鼠的过继转移实验。

从一只未感染的8-12周龄C57BL/6小鼠的双侧股骨和胫骨中收集骨髓细胞，通常可获得约6000万至8000万个细胞，细胞活力约为94-98%。使用Histopaque密度分离介质对这些细胞进行后续密度梯度离心，通常可从一只未感染小鼠中获得约600万至1200万个中性粒细胞。经流式细胞术验证（图1），所获中性粒细胞纯度为80-95%，活力>95%。尽管可在密度梯度离心前将多只动物的骨髓细胞合并，但细胞合并会略微降低分离所得中性粒细胞的纯度。例如，将一只未感染小鼠的6000万至8000万个骨髓细胞重悬于1-3 ml PBS中进行分层，可获得>90%纯度的中性粒细胞；而当将约3亿个骨髓细胞合并后重悬于3 ml PBS中进行分层时，细胞纯度则下降至约80%。

此外...

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讨论

本文介绍一种可靠、简单、快速且经济的方法，通过密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出大量高纯度和高活性的中性粒细胞。若正确执行本方案，可从一只未感染的小鼠中获得约 6-12 × 106 个中性粒细胞，而在感染后的小鼠中最多可分离出约 30-40 × 106 个中性粒细胞6。所分离的中性粒细胞纯度为 80–95%，活性超过>95%。

骨髓是获取小鼠中性粒细胞用于下游功能研究和过继转移实验的合适来源。首先，已有研究表明，小鼠骨髓中性粒细胞在功能上与血液中性粒细胞相似，因为这两个区室的细胞均表现出类似的氧化爆发和脱颗粒能力16。其次，研究显示小鼠骨髓中性粒细胞在体外培养中可存活较长时间，显著长于小鼠血液中性粒细胞16。因此，在进行离体（ex vivo）功能检测时，采集骨髓中性粒细胞相较于血液中性粒细胞可获得更高的细胞产量。第三，从中性粒细胞的分离角度而言，骨髓来源的优势在于能够回收到数量显著更多的中性粒细胞，这些细胞数量足以满足稳态条件下及感染后进行下游过继转移...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作得到了美国国家卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所（NIAID）院内研究部的支持。

所有小鼠均饲养于美国过敏与传染病研究所（NIAID）经美国实验动物照护评估认证协会（American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care）认证的动物实验设施中，并根据《实验动物照护与使用指南》（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）中所述程序，在NIAID动物照护与使用委员会批准的实验方案监督下进行管理。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 试剂
RPMI 1640 1X，含L-谷氨酰胺和25 mM HEPESCellgro10-041-CV 
胎牛血清（热灭活）GemCell100500 
青霉素/链霉素（10,000单位青霉素 / 10,000 mg/ml链霉素）GIBCO15140 
0.5 M EDTAQuality Biological Inc351-027-101 
0.2% 和 1.6% 氯化钠溶液JT Baker3624使用蒸馏水配制并经无菌过滤的氯化钠溶液
无菌过滤的Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077在使用前需升温至18–26 °C
无菌过滤的Histopaque 1119Sigma11191Histopaque 1119在使用前需升温至18–26 °C
不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）Cellgro210-40-CV 
乙醇（200 proof）The Warner Graham Company64-17-5 
CellTracker Green（CMFDA，5-氯甲基荧光素二乙酸酯）InvitrogenC-7025用DMSO配制10 mM储存液，分装后于-80 °C保存
CellTracker Orange（CMTMR，5-(和6)-4-氯甲基苯甲酰氨基四甲基罗丹明）InvitrogenC-2927用DMSO配制10 mM储存液，分装后于-80 °C保存
抗小鼠CD45抗体（克隆30-F11）eBioscience170451-82 
抗小鼠Ly6G抗体（克隆1A8）BD Pharmingen551461 
抗小鼠Ly6G抗体（克隆1A8）BD Pharmingen560599 
抗小鼠CD11b抗体（克隆M1/70）eBioscience47-0112-82 
抗小鼠CD16/CD32抗体（小鼠BD Fc阻断剂）BD Pharmingen553141使用时稀释比例为1:100
LIVE/DEAD可固定蓝色死细胞染色试剂盒Molecular ProbesL-23105使用时稀释比例为1:1000
二甲基亚砜（DMSO）Sigma67-68-5 
4%多聚甲醛PBS溶液USB Corporation19943 
 表1. 用于过继转移中性粒细胞的分离、标记和追踪的试剂。
 材料
C57BL/6小鼠Taconic 
15 ml离心管Corning430053 
50 ml离心管BD Falcon352070 
25 ml移液管Celltreat229225B 
10 ml移液管Celltreat229210B 
5 ml移液管Celltreat229205B 
巴斯德吸管（3 ml）BD Falcon357575 
12 ml注射器Kendall monoject512878 
25 G × 5/8 in. 针头（精密滑动针头）BD305122 
100 mm细胞筛BD Falcon352360 
杀菌型培养皿BD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
小鼠解剖器械（剪刀、镊子、手术刀）Biomedical Research Instruments10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000使用前已灭菌的器械
 设备
组织培养超净台The Baker CompanySG403 
冷冻离心机Thermo Fischer Scientific75004521 
37 °C振荡水浴箱Thermo Fischer Scientific3166721 
 表2. 本实验方案中使用的材料和设备清单。

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标签

密度梯度离心细胞示踪标记流式细胞术分析红细胞裂解Histopaque梯度竞争性重constitution研究小鼠骨髓分离中性粒细胞功能研究
小鼠骨髓中性粒细胞的分离、纯化及标记用于功能研究与过继性转移实验
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