基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

摘要

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。

摘要

为了促进对G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物的结构与动态研究，需要开发新的方法，将具有信息指示作用的探针或标记物引入表达的受体中，同时不干扰受体功能。我们利用琥珀密码子抑制技术，在哺乳动物细胞中外源表达的GPCR中，将非天然氨基酸 p-叠氮基-L-苯丙氨酸（azF）遗传编码至多个特定位点。本文展示了叠氮基团在不同应用中的多功能性，可用于在天然细胞环境或去垢剂溶解条件下研究GPCR。首先，我们展示了一种基于细胞的靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中与氚标记的小分子配体发生交联的残基，该交联发生在遗传编码的叠氮基氨基酸位点。接着，我们展示了利用靶向叠氮基团的生物正交Staudinger-Bertozzi连接反应，实现对GPCR的位点特异性修饰，该反应使用膦衍生物作为反应试剂。我们讨论了一种通用策略，用于在培养条件下对表达的膜蛋白进行靶向肽-表位标记，并通过基于全细胞的ELISA方法进行检测。最后，我们证明azF-GPCR可被选择性地标记荧光探针。文中讨论的方法具有普适性，原则上可应用于任何表达的GPCR中的任意氨基酸位点，以研究其活性信号复合物。

引言

七次跨膜G蛋白偶联受体（GPCRs）构成一个高度动态的膜蛋白超家族，可介导多种重要的胞外信号。在经典范式中，受体的激活与配体诱导的构象变化相偶联^{1, 2}。近年来，GPCR结构生物学的进展为跨膜信号转导的分子机制提供了深入的认识^3-5。然而，要以更高的化学精度理解GPCR信号转导的功能机制和结构动态，需要一套方法工具，以引入具有信息性的分子和化学探针，用于研究活性信号复合物。

为此，我们改进了一种方法，该方法基于非天然氨基酸（UAA）的琥珀密码子抑制技术，可将无干扰或最小干扰的探针位点特异性地引入表达的受体中，该技术早前由Schultz及其同事首创⁶。我们优化了UAA突变方法，以实现高效表达和突变系统，适用于如G蛋白偶联受体（GPCR）等在除哺乳动物细胞外的多数异源表达系统中难以表达的蛋白质。利用正交设计的抑制tRNA与进化获得的氨酰-tRNA合成酶配对，针对特定UAA，我们在表达的目标GPCR中实现了UAA的位点特异性插入。我们已在模型GPCR——视紫红质和人C-C趋化因子受体CCR5中，成功实现了对p-乙酰-L-苯丙氨酸（AcF）、p-苯甲酰-L-苯丙氨酸（BzF）和p-叠氮-L-苯丙氨酸（azF）等UAA的掺入^{7, 8}。

理论上，非天然氨基酸（UAA）可在蛋白质序列的任意位置通....

方案

1. 在 GPCR 中进行非天然氨基酸的位点特异性基因整合

1. 在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（葡萄糖4.5 g/L，谷氨酰胺2 mM）中，于37 °C、5% CO₂条件下培养HEK293T细胞。
2. 当细胞在10 cm培养皿中生长至60–80%融合度时，使用Lipofectamine Plus试剂进行转染。
   1. 向750 μl DMEM中加入10 μl Plus试剂、3.5 μg含有目标位点琥珀终止密码子的GPCR cDNA（pMT4. Rho或pcDNA 3.1. CCR5）、3.5 μg抑制性tRNA cDNA（pSVB.Yam）以及0.35 μg针对对叠氮苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine）的突变型氨酰-tRNA合成酶cDNA（pcDNA.RS），室温孵育15分钟。同时使用不含琥珀终止密码子的野生型GPCR cDNA进行类似的转染作为对照。将该混合物加入含17 μl Lipofectamine的750 μl DMEM中，室温平衡15分钟后，加液至总体积为4 ml。
   2. 吸除10 cm培养皿中的培养基，加入转染混合物，放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养。4–6小时后，补充4 ml含20% FBS和1 mM azF的DMEM培养基。
3. 次日，更换为含10% FBS和0.5 mM azF的DMEM培养基。....

结果

我们采用非天然氨基酸突变技术，利用琥珀密码子抑制技术，将分子探针位点特异性地引入G蛋白偶联受体（GPCR）中。该方案如图所示 图1 概述了该方法学的关键步骤以及引入多功能非天然氨基酸（UAA）的各种应用 p-将叠氮-L-苯丙氨酸（azF）引入G蛋白偶联受体（GPCRs）。在哺乳动物细胞中表达含azF的GPCRs，可实现对配体的靶向光交联，以及对GPCR进行靶向肽表位标记或荧光修饰 通过 生物正交标记化学反应

光交联技术可用于研究活细胞中G蛋白偶联受体（GPCR）与配体复合物的结构特征（图1a）。此类实验获得的代表性数据如图2所示。¹⁹ 在本研究中，我们使用放射性标记的小分子配体——氚标记马拉维若克（tritiated maraviroc），以确定其在CCR5上的结合位点。在此示例中，对预先孵育了氚标记马拉维若克的azF-CCR5突变体细胞进行紫外照射，可形成共价交联的复合物，并可通过配体上的高灵敏度放射性标签进行检测。在测试.......

讨论

本文介绍了一种将反应性探针azF特异性地插入G蛋白偶联受体（GPCRs）的稳健方法，并展示了该工具在研究GPCR结构与动态特性方面的三种重要应用。我们所采用的特异性插入非天然氨基酸（UAA）的方法，克服了另一种基于化学标记^{32, 33}或向单一可及的半胱氨酸突变体添加光交联剂³⁴策略的根本性问题。尽管已有针对半胱氨酸巯基的化学反应可用于连接荧光探针，但该策略要求构建无半胱氨酸的蛋白背景。这一要求具有局限性，因为所有GPCRs均含有多个半胱氨酸，其中许多可能对维持受体正常功能至关重要。因此，引入一种可进行化学修饰或能被紫外光激活的非天然氨基酸的策略极具吸引力。

光活化交联剂与靶分子之间的共价反应依赖于距离及邻近的侧链。因此，这类探针可用于鉴定与交联剂在特定距离范围内的相互作用；例如，基于二苯甲酮的交联剂据称其作用距离约为 3 Å。³⁵ 此前，我们已将对氟苯丙氨酸（azF）和苯甲酰基苯丙氨酸（BzF）——一种含有二苯甲酮反应基团的非天然氨基酸——应用于鉴定 G 蛋白偶联受体（GPCR）中与荧光素或氚标记配体在特定距离内的残.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒 pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
质粒 pcDNA.RS 用于 azF			(Ye et al., 2009)
质粒 pMT4.Rho 和 pcDNA 3.1.CCR5			可选择性地在目标位置包含琥珀终止密码子（TAG）
HEK 293T 细胞			贴壁细胞
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	10566
磷酸盐缓冲盐水	Gibco	14200
胎牛血清	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-叠氮-L-苯丙氨酸	Chem-Impex International	6162
			表 1. GPCR 中非天然氨基酸位点特异性遗传掺入材料
Maxima ML-3500S 紫外-A 灯	Spectronics Corporation		azF 可被 365 nm 光激活
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
牛血清白蛋白	Roche	3117405001
氚标记配体			来自合作者（Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	D310LA
1D4-琼脂糖树脂			1D4 单克隆抗体固定于 CNBr 活化的琼脂糖 2B 树脂上
1% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 凝胶	Invitrogen	NP0322BOX	在 NuPAGE 装置上进行 SDS-PAGE
Trans-Blot SD 装置	Biorad		用于半干转印的装置
Immobilon 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜	Millipore	IPVH00010
脱脂奶粉	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	闪烁液
闪烁瓶	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta 液体闪烁计数器	Perkin Elmer		β-闪烁计数器
抗视紫红质 1D4 单克隆抗体	National Cell Culture Center	custom
辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗小鼠 IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico 化学发光底物	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR 膜	Denville	E3018
			表 2. 靶向光交联材料
0.25% 胰蛋白酶	Invitrogen	15050065
FLAG-三芳基膦	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG 单克隆抗体	Sigma	F1804
抗 CCR5 2D7 单克隆抗体	BD Biosciences	555990
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
96 孔板	Costar	3601	透明底，高结合 EIA/RIA 板
磷酸盐缓冲盐水（含钙、镁）	Gibco	14040
16% 多聚甲醛	EMS	28908
HRP 偶联的	KPL, Inc.	474-1516
抗兔 IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
过氧化氢	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II 荧光多孔板读板仪	Perseptive Biosystems
			表 3. 靶向肽-表位标记及细胞表面 ELISA 材料
荧光素-膦			(Huber et al., 2012 年投稿)
九肽（C9 肽）	AnaSpec	62190	模拟 1D4 表位的肽段 NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	D310LA
1D4-琼脂糖树脂			1D4 单克隆抗体固定于 CNBr 活化的琼脂糖 2B 树脂上
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 凝胶	Invitrogen	NP0322BOX	在 NuPAGE 装置上进行 SDS-PAGE
共聚焦 Typhoon 9400 荧光扫描仪	GE Healthcare	已停产	配备 488 nm 波长激光的扫描仪
			表 4. 荧光标记材料