需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

14.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50588

⸱

2013年9月13日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Chemical Biology and Signal Transduction, The Rockefeller University

本文内容

摘要

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。

摘要

为了促进对G蛋白偶联受体（GPCR）信号复合物的结构与动态研究，需要开发新的方法，将具有信息指示作用的探针或标记物引入表达的受体中，同时不干扰受体功能。我们利用琥珀密码子抑制技术，在哺乳动物细胞中外源表达的GPCR中，将非天然氨基酸 p-叠氮基-L-苯丙氨酸（azF）遗传编码至多个特定位点。本文展示了叠氮基团在不同应用中的多功能性，可用于在天然细胞环境或去垢剂溶解条件下研究GPCR。首先，我们展示了一种基于细胞的靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中与氚标记的小分子配体发生交联的残基，该交联发生在遗传编码的叠氮基氨基酸位点。接着，我们展示了利用靶向叠氮基团的生物正交Staudinger-Bertozzi连接反应，实现对GPCR的位点特异性修饰，该反应使用膦衍生物作为反应试剂。我们讨论了一种通用策略，用于在培养条件下对表达的膜蛋白进行靶向肽-表位标记，并通过基于全细胞的ELISA方法进行检测。最后，我们证明azF-GPCR可被选择性地标记荧光探针。文中讨论的方法具有普适性，原则上可应用于任何表达的GPCR中的任意氨基酸位点，以研究其活性信号复合物。

引言

七次跨膜G蛋白偶联受体（GPCRs）构成一个高度动态的膜蛋白超家族，可介导多种重要的胞外信号。在经典范式中，受体的激活与配体诱导的构象变化相偶联1, 2。近年来，GPCR结构生物学的进展为跨膜信号转导的分子机制提供了深入的认识3-5。然而，要以更高的化学精度理解GPCR信号转导的功能机制和结构动态，需要一套方法工具，以引入具有信息性的分子和化学探针，用于研究活性信号复合物。

为此，我们改进了一种方法，该方法基于非天然氨基酸（UAA）的琥珀密码子抑制技术，可将无干扰或最小干扰的探针位点特异性地引入表达的受体中，该技术早前由Schultz及其同事首创6。我们优化了UAA突变方法，以实现高效表达和突变系统，适用于如G蛋白偶联受体（GPCR）等在除哺乳动物细胞外的多数异源表达系统中难以表达的蛋白质。利用正交设计的抑制tRNA与进化获得的氨酰-tRNA合成酶配对，针对特定UAA，我们在表达的目标GPCR中实现了UAA的位点特异性插入。我们已在模型GPCR——视紫红质和人C-C趋化因子受体CCR5中，成功实现了对p-乙酰-L-苯丙氨酸（AcF）、p-苯甲酰-L-苯丙氨酸（BzF）和p-叠氮-L-苯丙氨酸（azF）等UAA的掺入7, 8。

理论上，非天然氨基酸（UAA）可在蛋白质序列的任意位置通过遗传编码引入，这一特性使其成为一种宝贵的生物化学工具，能够实现对目标G蛋白偶联受体（GPCR）的单密码子扫描。本文重点介绍一种具有反应性叠氮基团的非天然氨基酸——对-叠氮苯丙氨酸（azF）的多功能性。除了可作为独特的红外（IR）探针8, 9，azF还可作为光激活交联剂，与邻近的伯胺或脂肪族氢原子发生反应。此外，叠氮基团在生物体系中具有惰性，可在生物正交标记反应中作为选择性化学手柄。本文展示了将azF特异性地引入GPCR中的若干应用实例，例如通过靶向光交联捕获受体-配体复合物，以及利用生物正交表位标记和荧光标记策略对GPCR进行修饰。

自20世纪60年代以来，光活化试剂已被用于研究生物系统。10 在此期间，已有大量受体-配体交联实验被报道，用于研究G蛋白偶联受体（GPCR）复合物，其中大多数实验使用了光亲和配体。11, 12 然而，这些应用在技术上存在局限性，因为它们需要合成带有交联基团的配体。13-15 此外，由于配体中含有交联基团，难以确定交联位点在GPCR上的具体位置。利用琥珀密码子抑制技术将光交联基团作为非天然氨基酸（UAA）位点特异性地引入蛋白质，是一项重要的技术进步。16, 17 我们开发了一种光交联技术，通过将光敏基团引入GPCR，在活细胞中识别参与受体-配体复合物形成的受体结合界面。18, 19 本文描述了应用该靶向光交联技术识别小分子配体[³H]马拉维若（maraviroc）在CCR5上结合位点的实验方案及数据分析方法。该方法不仅能够精确量化配体上的放射性标记，同时保留了配体的天然化学结构。

基于荧光的技术可通过直接探测受体的构象状态，帮助精确理解受体激活的结构基础。20, 21 然而，能够灵活地将荧光标记特异性引入G蛋白偶联受体（GPCR）的技术仍有限。我们致力于采用生物正交化学修饰策略，以促进对GPCR信号复合物的单分子检测（SMD）。22 叠氮基团可参与多种生物正交化学反应，例如施陶丁格-贝托齐连接反应（Staudinger-Bertozzi ligation），23, 24 无铜应变促进的叠氮-炔环加成反应（SpAAC）25 以及铜催化的叠氮-炔环加成反应（CuAAC）。26 本文重点介绍施陶丁格-贝托齐连接反应，该反应涉及叠氮与膦基之间的特异性反应。我们展示了两种不同膦基衍生物的应用，分别与肽表位（FLAG肽）或荧光标记物（荧光素）偶联，以实现对GPCR的位点特异性修饰。

我们先前利用X射线晶体结构和动力学模拟优化了视紫红质azF突变体位点特异性标记的条件，以选择溶剂暴露的靶位点27, 28。我们还展示了通过施陶丁格-贝尔托齐偶联实现无背景标记的可行性29。本文演示了对去垢剂溶解并固定于免疫亲和基质上的受体进行荧光标记的通用操作流程，并通过凝胶内荧光成像进行检测。此外，我们还展示了该标记策略的一项实用拓展，用于鉴定结构未知的受体CCR5中适合标记的位点。该方法采用基于细胞的半高通量格式，依赖于对azF-GPCR突变体进行生物正交修饰的靶向肽-表位标记策略30。该方法利用细胞表面ELISA的多步检测特性来监测标记过程。

本文讨论的方法具有通用性，原则上可应用于任何通过琥珀密码子抑制技术将azF掺入的G蛋白偶联受体（GPCR）。在本文提供的实验方案中，我们详细描述了利用非天然氨基酸突变技术，在哺乳动物细胞中表达掺入了azF等非天然氨基酸（UAA）的受体的步骤，以及后续促进GPCR结构与动态研究的应用方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 在 GPCR 中进行非天然氨基酸的位点特异性基因整合

  1. 在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（葡萄糖4.5 g/L，谷氨酰胺2 mM）中，于37 °C、5% CO2条件下培养HEK293T细胞。
  2. 当细胞在10 cm培养皿中生长至60–80%融合度时，使用Lipofectamine Plus试剂进行转染。
    1. 向750 μl DMEM中加入10 μl Plus试剂、3.5 μg含有目标位点琥珀终止密码子的GPCR cDNA（pMT4. Rho或pcDNA 3.1. CCR5）、3.5 μg抑制性tRNA cDNA（pSVB.Yam）以及0.35 μg针对对叠氮苯丙氨酸（p-azido-L-phenylalanine）的突变型氨酰-tRNA合成酶cDNA（pcDNA.RS），室温孵育15分钟。同时使用不含琥珀终止密码子的野生型GPCR cDNA进行类似的转染作为对照。将该混合物加入含17 μl Lipofectamine的750 μl DMEM中，室温平衡15分钟后，加液至总体积为4 ml。
    2. 吸除10 cm培养皿中的培养基，加入转染混合物，放回37 °C、5% CO2培养箱中继续培养。4–6小时后，补充4 ml含20% FBS和1 mM azF的DMEM培养基。
  3. 次日，更换为含10% FBS和0.5 mM azF的DMEM培养基。
  4. 转染后48小时收集细胞，用于分析表达情况，或进行后续光交联或标记实验（见下文所述步骤）。
    1. 通过检测生长培养基中存在非天然氨基酸（UAA）时GPCR琥珀突变体的表达情况来确认其表达。我们采用Western免疫印迹法进行检测：将细胞沉淀在含1%（w/v）十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）的20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM NaCl缓冲液中，4 °C裂解1小时。裂解液于16,000 × g离心，上清在还原条件下进行SDS-PAGE电泳分离。转膜至PVDF膜后，使用1D4单克隆抗体（National Cell Culture Center）进行免疫印迹分析，以检测受体C末端工程化表位对应的全长受体表达。31

2. 使用靶向光交联技术定位配体结合位点

  1. 转染后48小时，吸去细胞培养液，加入4 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS），于37 °C孵育15分钟。
  2. 用1×PBS重悬细胞，转移至Falcon管中。以1,500 rpm离心2分钟使细胞沉淀，吸除上清液。
  3. 将细胞沉淀重悬于含有20 mM HEPES（pH 7.5）、0.2% BSA及放射性标记配体的1×Hank's平衡盐溶液中，配体浓度为其受体结合饱和浓度，在所需时间和温度条件下孵育，以确保受体-配体复合物的形成。
  4. 将细胞悬液转移至24孔板或96孔板，用于在365 nm条件下对azF进行光激活（例如 使用紫外A波段（UV-A）灯在4 °C下照射15分钟。将培养板保持在冰上，以避免样品受热和细胞裂解。
  5. 将细胞转移至Eppendorf管中，离心沉淀细胞，弃去上清液，随后进行分析。沉淀物可于-20 °C保存，以备后续使用。
  6. 将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，缓冲液含1% (w/v) DDM、20 mM Tris-HCl（pH 7.5）及蛋白酶抑制剂。4 °C孵育1小时后，于16,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新管中。
  7. 将1D4单抗-Sepharose 2B树脂加入上清液中，4 °C孵育过夜，利用基因工程改造的C末端1D4单抗表位对GPCR进行免疫纯化。次日用裂解缓冲液洗涤树脂数次，随后加入1% SDS，37 °C振荡洗脱1小时。
  8. 将部分洗脱液转移至含有闪烁液的15 ml小瓶中，使用β闪烁计数器进行计数，以定量测定氚标记配体与受体的特异性结合量。
  9. 使用标准凝胶电泳分离剩余的1D4单抗纯化洗脱液。我们采用4-12%的SDS-PAGE凝胶，随后进行半干式转膜至PVDF膜，用于免疫印迹。同时设置一条标准蛋白ladder泳道，以直观估计分子量。
    1. 用含0.05% Tween-20的TBS缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭PVDF膜。使用1D4单克隆抗体探测膜以验证全长受体的表达，随后使用HRP标记的抗小鼠IgG二抗进行孵育。
    2. 使用增强型化学发光（ECL）试剂处理，将膜暴露于X射线胶片以显影条带。
  10. 用剃刀将膜切割，分离每个样品泳道，随后根据特定的分子量标记物进行切割。将膜片段转移至含有闪烁液的小瓶中。使用β-闪烁计数器对每个膜片段中的氚含量进行定量检测。
  11. 通过检测表观分子质量等于GPCR与配体分子质量之和处的氚信号，确定阳性光交联结果。

3. 靶向表位标记与细胞表面酶联免疫吸附测定（ELISA）

  1. 转染后24小时，用1 ml 1× PBS洗涤细胞，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶消化3分钟。加入9 ml含10% FBS和0.5 mM azF的DMEM终止消化。重悬细胞并计数细胞密度。我们使用标准血细胞计数板进行计数。
  2. 用100 μl浓度为0.01 mg/ml的多聚-D-赖氨酸预处理高结合力、透明底96孔板的每个孔。室温孵育30分钟，反复用1× PBS洗涤后自然晾干。
  3. 将转染后的细胞以6 × 104 - 8 × 104 个细胞/孔的密度接种至96孔板中，每孔200 μl，然后置于37 °C、5% CO2条件下培养。
  4. 次日准备进行标记。用100 μl/孔的1× PBS轻柔洗涤三次，以去除含azF的培养基。确保细胞仍贴壁良好，例如可使用含Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液。
  5. 从以5–20 mM保存在PBS中的母液中，用1× HBSS/PBS配制50–200 μM的FLAG-三芳基膦标记试剂。每孔加入60 μl（每个琥珀突变体设三个重复），置于37 °C孵育30分钟至4小时。同时保留一组未加标记试剂的孔，仅加入1× HBSS/PBS作为空白对照。另设野生型GPCR对照组，用于与azF-GPCR变体进行比较。
  6. 用100 μl/孔的封闭缓冲液BB（1× PBS，0.5% BSA）洗涤细胞三次，彻底去除未反应的标记物。
  7. 向细胞中加入100 μl/孔的4%多聚甲醛（用1× PBS将16%母液稀释而成）。室温孵育20分钟，再用BB洗涤三次。
  8. 按照标准细胞表面ELISA流程检测标记受体及受体表达水平。先在冰上与一抗孵育1.5小时，再于室温下与二抗孵育1小时。
    1. 加入100 μl抗-FLAG M2抗体（例如，用BB缓冲液按1:2,000稀释）以检测FLAG-三芳基膦标记试剂中的FLAG肽段表位。同时对未标记处理的孔进行检测，作为阴性对照。另取一组孔加入抗-CCR5 2D7抗体（我们使用1:500稀释）以测定野生型或azF-GPCR的细胞表面表达水平。
    2. 用BB缓冲液洗涤细胞三次，每孔加入100 μl HRP偶联的抗小鼠IgG二抗（1:2,000稀释），室温孵育1小时。
    3. 仔细用BB缓冲液洗涤细胞五次。每孔加入50 μl检测缓冲液：Amplex Red、20 mM H2O2、1× PBS（按1:10:90比例混合），室温孵育15分钟。使用荧光多孔板读板仪在λex=530 nm和λem=590 nm条件下采集光谱数据。

4. GPCR 的生物正交荧光标记

  1. 在 4 °C 条件下，用 1 ml 含 1% (w/v) DM、50 mM HEPES 或 Tris-HCl（pH 6.8）、100 mM NaCl、1 mM CaCl2 及蛋白酶抑制剂的溶解缓冲液裂解 107 个表达野生型或含 azF 的视紫红质变体的收获细胞，孵育 1 小时。将细胞裂解物在 15,000 × g 离心 10 分钟，收集上清组分。
  2. 加入 100 μl 1D4-mAb Sepharose 2B 树脂，利用工程化 C 末端 1D4 表位捕获受体。4 °C 孵育 12 小时。用含 0.1% (w/v) DDM 的 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.3）洗涤树脂三次。
  3. 在总体积为 0.3–0.5 ml 的溶液中加入 0.1 mM 荧光素膦试剂，用于标记固定在免疫亲和基质（1D4-mAb Sepharose 2B）上的受体。室温孵育 12 小时。离心并移除上清液。洗涤树脂以去除未反应的标记物。
  4. 将树脂置于冰上，加入 100 ml 洗脱缓冲液（含 0.1% (w/v) DDM 和 0.33 mg/ml 九肽（C9 肽，针对 1D4 表位）的 2 mM 磷酸盐缓冲液，pH 6.0），孵育 1 小时，洗脱标记的受体。
  5. 在还原条件下通过 SDS-PAGE 分离标记样品。用 PBS 短暂洗涤凝胶，然后通过凝胶内荧光检测 azF-GPCR 的标记情况。例如，使用配备 488 nm 波长激光的共聚焦荧光扫描仪检测与荧光素修饰的受体。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们采用非天然氨基酸突变技术，利用琥珀密码子抑制技术，将分子探针位点特异性地引入G蛋白偶联受体（GPCR）中。该方案如图所示 图1 概述了该方法学的关键步骤以及引入多功能非天然氨基酸（UAA）的各种应用 p-将叠氮-L-苯丙氨酸（azF）引入G蛋白偶联受体（GPCRs）。在哺乳动物细胞中表达含azF的GPCRs，可实现对配体的靶向光交联，以及对GPCR进行靶向肽表位标记或荧光修饰 通过 生物正交标记化学反应

光交联技术可用于研究活细胞中G蛋白偶联受体（GPCR）与配体复合物的结构特征（图1a）。此类实验获得的代表性数据如图2所示。19 在本研究中，我们使用放射性标记的小分子配体——氚标记马拉维若克（tritiated maraviroc），以确定其在CCR5上的结合位点。在此示例中，对预先孵育了氚标记马拉维若克的azF-CCR5突变体细胞进行紫外照射，可形成共价交联的复合物，并可通过配体上的高灵敏度放射性标签进行检测。在测试...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文介绍了一种将反应性探针azF特异性地插入G蛋白偶联受体（GPCRs）的稳健方法，并展示了该工具在研究GPCR结构与动态特性方面的三种重要应用。我们所采用的特异性插入非天然氨基酸（UAA）的方法，克服了另一种基于化学标记32, 33或向单一可及的半胱氨酸突变体添加光交联剂34策略的根本性问题。尽管已有针对半胱氨酸巯基的化学反应可用于连接荧光探针，但该策略要求构建无半胱氨酸的蛋白背景。这一要求具有局限性，因为所有GPCRs均含有多个半胱氨酸，其中许多可能对维持受体正常功能至关重要。因此，引入一种可进行化学修饰或能被紫外光激活的非天然氨基酸的策略极具吸引力。

光活化交联剂与靶分子之间的共价反应依赖于距离及邻近的侧链。因此，这类探针可用于鉴定与交联剂在特定距离范围内的相互作用；例如，基于二苯甲酮的交联剂据称其作用距离约为 3 Å。35 此前，我们已将对氟苯丙氨酸（azF）和苯甲酰基苯丙氨酸（BzF）——一种含有二苯甲酮反应基团的非天然氨基酸——应用于鉴定 G 蛋白偶联受体（GPCR）中与荧光素或氚标记配体在特定距离内的残...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢多家基金会和慈善捐赠者的慷慨支持（详见 SakmarLab.org）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
质粒 pSVB. Yam(Ye et al., 2008)
质粒 pcDNA.RS 用于 azF(Ye et al., 2009)
质粒 pMT4.Rho 和 pcDNA 3.1.CCR5可选择性地在目标位置包含琥珀终止密码子（TAG）
HEK 293T 细胞贴壁细胞
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco10566 
磷酸盐缓冲盐水Gibco14200 
胎牛血清Gemini Bio-products100-106 
Lipofectamine PlusInvitrogenLipofectamine: 18324-012
Plus: 11514-015		 
p-叠氮-L-苯丙氨酸Chem-Impex International6162 
 表 1. GPCR 中非天然氨基酸位点特异性遗传掺入材料
Maxima ML-3500S 紫外-A 灯Spectronics CorporationazF 可被 365 nm 光激活
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）Gibco14065 
HEPESIrvine Scientific9319 
牛血清白蛋白Roche3117405001 
氚标记配体来自合作者（Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷AnatraceD310LA 
1D4-琼脂糖树脂1D4 单克隆抗体固定于 CNBr 活化的琼脂糖 2B 树脂上
1% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）Fisher ScientificBP166 
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 凝胶InvitrogenNP0322BOX在 NuPAGE 装置上进行 SDS-PAGE
Trans-Blot SD 装置Biorad用于半干转印的装置
Immobilon 聚偏二氟乙烯（PVDF）膜MilliporeIPVH00010 
脱脂奶粉Fisher ScientificNC9934262 
Tween-20Aldrich274348 
Ecoscint ANational DiagnosticsLS-273闪烁液
闪烁瓶Fisher Scientific333726 
LKB Wallac 1209 Rackbeta 液体闪烁计数器Perkin Elmerβ-闪烁计数器
抗视紫红质 1D4 单克隆抗体National Cell Culture Centercustom 
辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗小鼠 IgGKPL, Inc.474-1806 
SuperSignal West Pico 化学发光底物Thermo Scientific34080 
Hyblot CL AR 膜DenvilleE3018 
 表 2. 靶向光交联材料
0.25% 胰蛋白酶Invitrogen15050065 
FLAG-三芳基膦SigmaGPHOS1 
M2 FLAG 单克隆抗体SigmaF1804 
抗 CCR5 2D7 单克隆抗体BD Biosciences555990 
聚-D-赖氨酸SigmaP6407 
96 孔板Costar3601透明底，高结合 EIA/RIA 板
磷酸盐缓冲盐水（含钙、镁）Gibco14040 
16% 多聚甲醛EMS28908 
HRP 偶联的KPL, Inc.474-1516 
抗兔 IgGKPL, Inc.474-1516 
Amplex RedInvitrogenA12222 
过氧化氢DE Healthcare Products97-93399 
CytoFluor II 荧光多孔板读板仪Perseptive Biosystems 
 表 3. 靶向肽-表位标记及细胞表面 ELISA 材料
荧光素-膦(Huber et al., 2012 年投稿)
九肽（C9 肽）AnaSpec62190模拟 1D4 表位的肽段 NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷AnatraceD310LA 
1D4-琼脂糖树脂1D4 单克隆抗体固定于 CNBr 活化的琼脂糖 2B 树脂上
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS 凝胶InvitrogenNP0322BOX在 NuPAGE 装置上进行 SDS-PAGE
共聚焦 Typhoon 9400 荧光扫描仪GE Healthcare已停产配备 488 nm 波长激光的扫描仪
 表 4. 荧光标记材料

参考文献

  1. Huber, T., Menon, S., Sakmar, T. P. Structural basis for ligand binding and specificity in adrenergic receptors: Implications for GPCR-targeted drug discovery. Biochemistry. 47, 11013-11023 (2008).
  2. Steyaert, J., Kobilka, B. K. Nanobody stabilization of G protein-coupled receptor conformational states. Current opinion in structural biology. 21, 567-572 (2011).
  3. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  4. Wu, B., et al. Structures of the CXCR4 chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  5. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  6. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301, 964-967 (2003).
  7. Ye, S., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. The Journal of biological chemistry. 283, 1525-1533 (2008).
  8. Ye, S., Huber, T., Vogel, R., Sakmar, T. P. FTIR analysis of GPCR activation using azido probes. Nature chemical biology. 5, 397-399 (2009).
  9. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464, 1386-1389 (2010).
  10. Singh, A., Thornton, E. R., Westheimer, F. H. The photolysis of diazoacetylchymotrypsin. The Journal of biological chemistry. 237, 3006-3008 (1962).
  11. Nakayama, T. A., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bovine rhodopsin determined by cross-linking using a photoactivatable analog of 11-cis-retinal. The Journal of biological chemistry. 265, 15762-15769 (1990).
  12. Chen, Q., Pinon, D. I., Miller, L. J., Dong, M. Molecular basis of glucagon-like peptide 1 docking to its intact receptor studied with carboxyl-terminal photolabile probes. The Journal of biological chemistry. 284, 34135-34144 (2009).
  13. Huang, K. S., Radhakrishnan, R., Bayley, H., Khorana, H. G. Orientation of retinal in bacteriorhodopsin as studied by cross-linking using a photosensitive analog of retinal. The Journal of biological chemistry. 257, 13616-13623 (1982).
  14. Zoffmann, S., Turcatti, G., Galzi, J., Dahl, M., Chollet, A. Synthesis and characterization of fluorescent and photoactivatable MIP-1alpha ligands and interactions with chemokine receptors CCR1 and CCR5. Journal of medicinal chemistry. 44, 215-222 (2001).
  15. Janz, J. M., et al. Direct interaction between an allosteric agonist pepducin and the chemokine receptor CXCR4. Journal of the American Chemical Society. 133, 15878-15881 (2011).
  16. Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichiacoli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11020-11024 (2002).
  17. Hino, N., et al. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature. 2, 201-206 (2005).
  18. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50, 3411-3413 (2011).
  19. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS chemical biology. 7, 967-972 (2012).
  20. Dunham, T. D., Farrens, D. L. Conformational changes in rhodopsin. Movement of helix f detected by site-specific chemical labeling and fluorescence spectroscopy. The Journal of biological chemistry. 274, 1683-1690 (1999).
  21. Maurel, D., et al. Cell-surface protein-protein interaction analysis with time-resolved FRET and snap-tag technologies: application to GPCR oligomerization. Nature. 5, 561-567 (2008).
  22. Huber, T., Sakmar, T. P. Escaping the flatlands: new approaches for studying the dynamic assembly and activation of GPCR signaling complexes. Trends in pharmacological sciences. 32, 410-419 (2011).
  23. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  24. Kiick, K. L., Saxon, E., Tirrell, D. A., Bertozzi, C. R. Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 19-24 (2002).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. Journal of the American Chemical Society. 126, 15046-15047 (2004).
  26. Kolb, H. C., Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug discovery today. 8, 1128-1137 (2003).
  27. Huber, T., Botelho, A. V., Beyer, K., Brown, M. F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys. J. 84, 2078-2100 (2004).
  28. Okada, T., et al. The retinal conformation and its environment in rhodopsin in light of a new 2.2 Å crystal structure. J. Mol. Biol. 342, 571-583 (2004).
  29. Huber, T., Tian, H., Ye, S., Naganathan, S., Kazmi, M. A., Duarte, T., Sakmar, T. P. Bioorthogonal labeling of functional G protein-coupled receptors at genetically encoded azido groups. , submitted (2013).
  30. Naganathan, S., Ye, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Site-specific epitope tagging of GPCRs by bioorthogonal modification of a genetically-encoded unnatural amino acid. Biochemistry. , (2013).
  31. Molday, R. S., MacKenzie, D. Monoclonal antibodies to rhodopsin: characterization, cross-reactivity, and application as structural probes. Biochemistry. 22, 653-660 (1983).
  32. Gether, U., et al. Agonists induce conformational changes in transmembrane domains III and VI of the beta2 adrenoceptor. The EMBO journal. 16, 6737-6747 (1997).
  33. Hubbell, W. L., Altenbach, C., Hubbell, C. M., Khorana, H. G. Rhodopsin structure, dynamics, and activation: A perspective from crystallography, site-directed spin labeling, sulfhydryl reactivity, and disulfide cross-linking. Advances in Protein Chemistry; Membrane Proteins. 63, 243-290 (2003).
  34. Cai, K., Itoh, Y., Khorana, H. G. Mapping of contact sites in complex formation between transducin and light-activated rhodopsin by covalent crosslinking: use of a photoactivatable reagent. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4877-4882 (2001).
  35. Dorman, G., Prestwich, G. D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry. 33, 5661-5673 (1994).
  36. Zhang, Z., et al. A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo. Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).
  37. Dirksen, A., Hackeng, T. M., Dawson, P. E. Nucleophilic catalysis of oxime ligation. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7581-7584 (2006).
  38. Yanagisawa, T., et al. Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modification. Chemistry & biology. 15, 1187-1197 (2008).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

GPCR
基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。