立体定位微量注射表达Cre重组酶的病毒载体以研究靶基因在可卡因条件性位置偏爱中的作用

摘要

本文介绍了如何将病毒载体微量注射到小鼠脑内，随后在条件性位置偏爱范式中进行测试，该范式包括获得、消退和复燃三个阶段。

摘要

将表达Cre重组酶的重组腺相关病毒（rAAV）载体微量注射至小鼠大脑的不同区域，可实现对目的基因的选择性敲除，相较于现有方法，该技术在时间特异性和区域特异性基因删除控制方面更具优势。虽然通过将特定基因启动子驱动Cre重组酶表达的小鼠与携带floxed基因的小鼠杂交，也可实现条件性基因删除，但立体定位微量注射技术能够使研究者根据实验需求，在特定时间点精准靶向大脑的特定区域。在可卡因条件性位置偏爱以及其他涉及戒断、消退和/或复吸阶段的可卡因行为范式（如自我给药或精神运动敏感化）研究背景下，该技术特别适用于探索靶基因在可卡因诱导的神经可塑性行为模型各个阶段中的独特作用。具体而言，该技术能够在行为的特定阶段选择性地敲除靶基因，从而检验这些基因在不同时间点对行为的贡献。最终，这种理解有助于开发更具靶向性的治疗策略，以更有效地应对成瘾行为各个阶段中出现的关键风险因素。

引言

可卡因是一种具有高度强化效应的精神兴奋剂。反复暴露于可卡因后，与奖赏相关的脑环路会发生多种分子和细胞水平的适应性改变，这些改变被认为会导致强迫性觅药行为，从而引发高复发率，构成严重的临床问题¹。可卡因通过调控基因表达来产生这些持久的行为效应。为了研究慢性使用可卡因所引发的适应性变化，研究人员广泛采用了临床前啮齿类动物模型。其中一种模型是条件性位置偏爱（conditioned place preference, CPP）范式。该模型涉及在先前中性的环境与可卡因的奖赏效应之间建立一种习得性关联。在将可卡因与特定环境多次配对后，允许动物自由探索与可卡因配对的环境和未与可卡因配对的环境；若动物更偏好与药物配对的区域，则认为其已形成可卡因诱导的位置偏爱。此外，在经过一段消退训练期后，该范式还可用于研究情境特异性的可卡因觅药行为的复现。

与其他成瘾样行为模型相比，如用于研究长期可卡因诱导的行为和分子可塑性的精神运动敏化模型^2,3，以及被认为能更准确模拟人类成瘾样行为的自我给药（SA）模型，条件性位置偏爱（CPP）范式是一种研究可卡因情境学习的简单方法⁴。CPP实验方案可方便地扩展，加入消退和复燃阶段，类似于自我给药模型，从而可用于探究药物渴求和复吸的潜在机制^5-7，并被认为能够重现人类觅药行为以及药物和线索诱发复吸过程中的某些特征^8-10。

方案

所有操作均按照威尔康奈尔医学院机构动物护理和使用委员会的规定进行。

1. 病毒载体立体定位注射的准备与设置

1. 若器械、无菌棉签或戴无菌手套的手因接触非无菌表面而受到污染，应丢弃该器械或使用高温珠灭菌器重新灭菌，丢弃棉签或更换新的无菌手套。
2. 将带有垫料的小鼠笼置于加热块上，用于术后恢复时保温。
3. 准备电动剃刀以剃除头部毛发，并准备好乙醇和碘液用于头皮消毒。
4. 用70%乙醇擦拭立体定位仪的耳杆和口部固定装置。
5. 使用5 μl Hamilton注射器抽取5 μl病毒载体（1 × 10⁶ 病毒颗粒/μl），并将注射器安装至立体定位仪的注射器架上。
6. 开启微波加热垫或电热垫并放置于立体定位仪上，表面覆盖清洁的吸水垫以降低烫伤风险。在整个操作过程中频繁监测小鼠体温（维持在97–99.5 °F之间）。
7. 对体重在22–35 g之间的小鼠注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）的混合物。麻醉后，轻捏尾尖以检查小鼠反射，观察是否有任何运动或反应，以确认小鼠已充分麻醉。
8. 剃除两耳之间及眼睛之间的头部毛发。
9. 使用乙醇和碘液浸湿的无菌棉签交替擦拭已剃净的头部进行清洁。
10. 将小鼠转移至立体定位仪上的加热垫上。

结果

细胞穿膜肽

在对显微注射小鼠进行条件性位置偏爱（CPP）实验后，应验证对照组注射（rAAV-GFP）小鼠是否正常获得了对药物配对箱室的偏爱（图1A、1B）。当可卡因偏爱值（在可卡因配对箱室中停留的时间减去在生理盐水配对箱室中停留的时间）显著高于基线偏爱评分时，即认为小鼠已获得对特定箱室的偏爱（图1B，A与B比较）。如果作为群体的对照组注射小鼠未表现出对可卡因配对箱室的偏爱，甚至出现厌恶反应，应立即通过组织学方法验证病毒注射位点（参见rAAV注射部分），并对定位错误的小鼠予以剔除。

如果对照注射组小鼠已正常建立偏好，可随后通过启动消退阶段来扩展该实验范式（图1A；第6天及以后）。当小鼠在连续两个消退日对可卡因配对箱室的偏好得分显著低于获得阶段的偏好得分时，即认为其已消退了药物诱导的偏好（图1B，E3、E4、E5 与 A 比较）。此时，可给予药物激发以诱导复吸（图1A、1B

讨论

通过立体定位微注射病毒载体并结合包含消退和复吸阶段的 CPP 范式，实现特定脑区和特定时间的基因敲除，从而能够研究基因在成瘾样行为三个不同阶段中的具体作用。虽然利用传统的 Cre-LoxP 系统实现的条件性基因敲除已可达到时空受限的基因失活，但通过立体定位技术将 Cre 重组酶微注射至特定脑区的 floxed 小鼠中，可实现对基因敲除时间和空间更为精确的控制。此外，该方法避免了发育过程中可能出现的代偿性改变，而这类代偿机制有时会导致基因敲除小鼠中表型变异不明显。更重要的是，通过对在行为学实验不同时间点接受微注射的小鼠队列进行研究，可建立基因表达变化与行为改变之间的因果关系。值得注意的是，该技术可应用于多种可卡因相关行为范式，包括自我给药和心理运动敏化。

手术后必须等待至少10-14天，以确保Cre重组酶达到最大程度的激活²⁰。在此时间之前开始行为学测试，可能导致使用Cre表达未达最大水平的小鼠，从而使行为学结果难以解释。Cre的最大激活可实现基因的完全敲除，但这仅发生在实际被感染的细胞中。根据病毒载体的体积和滴度，特定脑区大约50-70%的细胞被感染，导致相应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
条件性位置偏爱实验活动箱	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
小鼠立体定位对准系统	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton 注射器	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004