实验性脑损伤中小胶质细胞/巨噬细胞极化标志物的三维共聚焦分析

摘要

本文介绍了一种深入了解脑部炎症反应复杂性的方法。我们描述了基于免疫荧光的实验方案，结合三维共聚焦分析，用于研究局灶性脑缺血小鼠模型中小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的共表达模式。

摘要

脑卒中后，小胶质细胞/巨噬细胞（M/M）会迅速活化，发生显著的形态学和表型改变，包括表达新的表面抗原以及产生介导并维持炎症反应的介质。新兴证据表明，M/M 是具有高度可塑性的细胞，在急性脑损伤后可表现为经典的促炎性（M1）或替代性的抗炎性（M2）活化状态。然而，对于损伤脑组织中 M/M 表型标志物的表达特征、共定位情况及其随时间演变的完整描述仍尚不完善。

可在脑缺血组织中实施特异性标记巨噬细胞/小胶质细胞（M/M）活化相关标志物的免疫荧光染色方案。本文介绍了一种基于免疫荧光染色并结合三维共聚焦分析的强大方法，用于研究在大脑中动脉永久性闭塞（pMCAO）诱导的小鼠局灶性脑缺血模型中，M/M表型标志物（如CD11b、CD68、Ym1）的定位模式与共表达情况。对染色区域的二维分析显示，每种标志物均与特定的M/M形态相关，并在缺血病灶中具有特定的分布位置。通过三维共聚焦成像可进一步评估缺血区域内M/M表型标志物的共表达模式。图像采集可在特定体积范围内（z轴10 μm，步进大小0.23 μm，对应180 × 135 × 10 μm的体积）采用逐帧扫描模式进行，以最大限度减少荧光串色效应并避免波长重叠。随后利用Imaris软件对图像进行处理，生成三维重建图像。三维重建图像的实体视图可清晰显示细胞簇中标志物的表达情况。结果表明，M/M具有向多种表型分化的能力，其分化方向取决于在病灶中的位置及损伤后的时间点。

引言

急性脑损伤后，小胶质细胞会迅速被激活，并发生显著的形态学和表型改变^1-3。这种内在反应常伴随外周血源性巨噬细胞的募集，这些巨噬细胞迁移至受损的脑实质中^4,5。目前对于在抗原表型上难以区分的小胶质细胞和巨噬细胞（以下简称M/M）在脑损伤中的作用仍存在争议。越来越多的研究表明，类似于外周巨噬细胞，小胶质细胞及脑内募集的巨噬细胞可呈现不同的表型，其两极分别为经典的促炎毒性表型（M1）和抗炎保护性表型（M2）。这些不同的活化状态，包括促炎或抗炎因子的分泌、神经营养分子的释放以及溶酶体活性，均表现出特定的表型标志物表达模式，而这些标志物的表达取决于局部微环境随时间的动态变化。目前对损伤脑组织中M/M表型的特征描述仍较为有限。我们采用一种成熟的鼠类永久性大脑中动脉闭塞（pMCAo）模型，以分析脑卒中后M/M的表达及其演变过程。本文所介绍的基于免疫荧光的实验方案，旨在深入了解特定M/M表型标志物在缺血区域的出现情况、定位分布及其细胞共表达特征。我们检测了若干与不同活化状态或表型相关的分子，包括CD11b（一种白细胞表面标志物，广泛用于标记M/M的活化或募集^6-8）、CD68（溶酶体标志物^6,7）以及Ym1（一种由替代活化型巨噬细胞（M2）表达的分泌蛋白，与功能恢复和修复过程相关^9-10）。

当两种标记物由同一细胞表达，但在不同的亚细胞区室中时，仅靠共定位可能无法提供足够的信息。在此情况下，可通过单平面视图和三维重建来进行共表达分析。本文介绍了一种对标记物共表达进行彻底三维分析的实验方案。

方案

1. 免疫荧光

以下实验方案使用经心脏灌流小鼠获取的脑冠状冷冻切片（先灌注 20 ml PBS，0.1 mol/L，pH 7.4，随后灌注 50 ml 预冷的含 4% 多聚甲醛的 PBS）。灌流后，小心取出脑组织并转移至含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，4 °C 下孵育过夜以进行冷冻保护。随后将脑组织浸入 -45 °C 的异戊烷中快速冷冻 3 分钟，然后密封于样品管中，-70 °C 保存备用。连续切割脑冠状冷冻切片（20 μm），并进行免疫荧光染色实验^{11, 6}。

使用前将所有试剂和样品恢复至室温。请注意，抗体和血清的工作稀释度是经过试验优化后确定的，以获得最佳实验效果。当使用不同的抗体和血清时，需对本实验方案进行验证。

需要注意的是，由于抗CD11b和抗CD68一抗均来源于大鼠，为避免使用抗大鼠Alexa 546二抗时产生交叉信号，我们采用高稀释度的抗CD11b抗体，随后使用TSA试剂盒（Cy5酪胺）进行荧光信号放大。我们通过执行本文所述实验流程（除步骤1.17外），并至少测试了7种不同稀释度的抗CD11b抗体（如表1所列），确定了其最佳工作稀释度。最终选择1:30,000稀释度，因为这是唯一满足以下条件的稀释度：1）在646 nm激发波长下可检测到Cy5的可见信号；2）在532 nm激发波长下无Alexa 546信号。通过此方法，Alexa 546荧光信号可特异性地反映CD68的表达。

抗CD11b和抗CD68抗体的最佳稀释度可能因组织类型而异，必须在开始共标记实验方案之前确定。

1. 用 PBS 清洗脑冷冻切片两次。
2. 将冷冻切片在含 1% H₂O₂ 的 PBS 中孵育 5 分钟（此步骤必需，因为荧光放大需要与辣根过氧化物酶链霉亲和素-HRP 孵育，请参见步骤 1.12）。
3. 用 PBS 清洗冷冻切片 2 次。
4. 将冷冻切片在含 10% NGS 和 0.3% Triton 的 PBS 中孵育 60 分钟。
5. 在 4 °C 下，将冷冻切片在含一抗 Rat anti-CD11b [1:30,000]、10% NGS 和 0.3% Triton 的 PBS 中过夜孵育。
6. 用 PBS 清洗冷冻切片 2 次（每次 5 分钟）。
7. 将冷冻切片在含生物素化二抗 anti-Rat Ab [1:200] 和 1% NGS 的 PBS 中孵育 60 分钟。
8. 用 PBS 清洗冷冻切片 2 次。
9. 用 TNT（Tris-HCl、NaCl、Tween：0.1 M TRIS-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05% Tween 20）清洗冷冻切片。
10. 将冷冻切片在 TNB（Tris-HCl-NaCl-封闭缓冲液：0.1 M TRIS-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.5% 来自相应试剂盒的封闭试剂）中孵育 1.5 小时。
11. 用 TNT 清洗冷冻切片 3 次。
12. 将冷冻切片在含 streptavidin-HRP [1:100] 的 TNB 中孵育。
13. 用 TNT 清洗冷冻切片 3 次。
14. 将冷冻切片在含 Cyanine 5 Tyramide [1:300] 的扩增稀释液中孵育 8 分钟。
15. 用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。
16. 将冷冻切片在含 10% NGS 和 0.1% Triton 的 PBS 中孵育 60 分钟。
17. 在 4 °C 下，将冷冻切片在含一抗 Rat anti-CD68 [1:200]、3% NGS 和 0.3% Triton 的 PBS 中过夜孵育。
18. 用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。
19. 将冷冻切片在含荧光标记二抗 Alexa 546 anti-Rat [1:500] 和 1% NGS 的 PBS 中孵育 60 分钟。
20. 用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。
21. 将冷冻切片在含 Hoechst（1 μg/ml）的 PBS 中孵育 10 分钟。
22. 用 PBS 清洗冷冻切片 3 次。
23. 用 Prolong Gold 封片剂封片。

2. 通过共聚焦显微镜获取三维图像

此处使用的显微镜为配备FV500共聚焦扫描单元的IX81显微镜，具有三条激光线：Ar-Kr（488 nm）、He-Ne红色（646 nm）和He-Ne绿色（532 nm），以及一个紫外二极管。

1. 根据待激发荧光染料的波长选择激发激光器（Cy5、CD11b 使用 He-Ne 红光；Alexa546、CD68 使用 He-Ne 绿光；Hoechst、细胞核使用紫外二极管激光）。
2. 选择最佳的二向色镜组合以收集光信号。
3. 将图像分辨率设置为至少 800 × 600 像素。
4. 使用落射荧光识别感兴趣区域，并逐步增加放大倍数至 40X 物镜。
5. 切换至激光扫描显微镜（LSM）模式。
6. 进行重复扫描，调节每个通道的光电倍增管（PMT）和增益。可单独开启各激光器以方便设置。增益应尽可能调低，以避免非特异性背景信号。
7. 在重复扫描过程中，调节焦距控制，确定 z 轴的上下极限位置（总 z 轴长度为 10 μm）。
8. 停止重复扫描。
9. 设定步进大小。步进大小应尽可能接近像素尺寸（0.225 μm），以在 z 轴上获得标准的 1:1 尺寸比例。
10. 至少启用两次 Kalman 滤波。
11. 启用顺序扫描模式，以避免串色干扰效应。
12. 沿 z 轴中点位置进行 xy 顺序扫描。检查 PMT 和增益的设置（良好的信噪比）。若结果不理想，重复步骤 2.6。
13. 执行 xyz 轴图像采集。
14. 将数据导出为多页 TIFF 文件。每个多页 TIFF 文件通常包含 3 个颜色通道（蓝色、绿色和红色）以及 44 个焦平面。

3. 共聚焦图像的三维视图与三维重建

将多页TIFF文件上传至Imaris软件，并按以下步骤进行处理：

1. 打开软件。
2. 选择 surpass 视图。
3. 上传 multitiff 文件。
4. 为每个通道选择所需的颜色。
5. 通过在 display adjustment 面板中提高最小值来去除背景噪声。每个通道需单独调整。
6. 切换至 section 视图。沿 z 轴移动，寻找共定位（黄色像素）。
7. 点击黄色区域，查看共定位是否沿 z 轴连续存在（即是否属于一个完整的结构）。z 轴投影显示在图像的右侧和底部。
8. 拍摄快照。
9. 返回 surpass 视图。
10. 对 3D 图像进行裁剪，以分离单个细胞或细胞簇。
11. 在 display adjustment 面板中选择一个通道。
12. 选择 surpass/surfaces 算法构建器。算法步骤：
    1. 选择通道。
    2. 设定阈值（使用与 display adjustment 面板中相同的最小值）。
    3. 设定重定大小参数。
    4. 设定平滑度（最佳值 = 0.200）。
    5. 设定颜色显示效果。
    6. 结束算法。
13. 对每个通道重复步骤 3.12。
14. 在 display adjustment 面板中取消选择荧光通道，并选择全部三个 surfaces。
15. 旋转体积以找到最佳视角。
16. 拍摄快照。

结果

当在缺血区域执行标记方案和共聚焦采集时，所获得结果的一个示例如图1A和1B所示。图像的二维视图显示，在缺血后24小时(A)，溶酶体标志物CD68（绿色）表达于缺血核心区域存在的肥大阿米巴样CD11b细胞（红色）中。在边界区域(B)，CD11b阳性细胞呈现圆形胞体以及对CD68呈阳性反应的分支状突起。Z轴投影（A和B的右侧及底部部分）可用于观察在单平面视图中记录的标志物分布是否同样存在于Z轴方向上。当发生共定位时，会生成黄色像素。CD11b是C3片段的受体，呈膜分布；CD68标记溶酶体，因此主要存在于细胞质中。CD11b/CD68双阳性细胞通常仅有小部分体素发生共定位，在大多数情况下CD11b包围着CD68（图1A）。只有在吞噬过程中吞噬体与细胞膜结合时，才会实现CD11b与CD68之间的共定位（图1B）。

在

讨论

本文介绍了一种基于免疫荧光染色并结合三维共聚焦分析的实验方案，作为一种强大的方法用于研究缺血区域中巨噬/单核细胞（M/M）表型标志物的定位与共表达情况（更详细的分析参见参考文献 ⁶）。该方法结合了巨噬细胞/单核细胞（M/M）活化相关标志物的特异性染色与三维共聚焦成像技术。通过精确优化抗体、血清及荧光标记物的工作浓度，可实现目标标志物最佳的信噪比。图像处理以获得三维重建图像，有助于界定细胞簇中标志物的表达情况，从而使所获取的图像能够反映M/M的功能状态。目前越来越多的研究认为，M/M是具有高度可塑性的细胞，可根据周围环境信号的不同，获得多种表型并启动不同的功能程序。炎症微环境随时间动态演变，可能调控M/M的极化方向，从而影响其功能表型。 体内 研究远比……更有启发性 体外 模型，在这些模型中，无法重现所招募/激活细胞的完整网络。

修改与故障排除

本文所述方案专门针对小鼠脑组织冷冻切片（20 μm）开发。所用抗体的工作稀释度可根据动物种类或组织性质进行调整。此外，免疫荧光...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
大鼠抗小鼠 CD11b	由意大利米兰 Humanitas 临床研究所 A. Doni 博士惠赠
大鼠抗小鼠 CD68	AbD Serotec	MCA 1957
兔抗小鼠 Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life technologies	H21492
小鼠抗神经元核抗原（NeuN）	CHEMICON	MAB377
生物素化山羊抗大鼠抗体	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 系统	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
抗大鼠 Alexa 546	Invitrogen	A-11081
抗小鼠 Alexa 488	Invitrogen	A-21121
抗兔 Alexa 594	Invitrogen	A-11037
正常山羊血清	Vectors Laboratories	S-1000
Triton X-100	Sigma	T8787
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P4417-100
仪器
冷冻切片机 CM1850	Leica
Olympus IX81 共聚焦显微镜	Olympus
AnalySIS 软件	Olympus
Imaris 软件 5.0	Bitplane
Photoshop CS2	Adobe Systems
GraphPad Prism 4.0 软件包	GraphPad Software Inc.