肌成纤维细胞是胃肠道间质中一种具有重要影响的细胞，可在正常及疾病状态下调控多种关键的生理过程。本文介绍一种可从鼠源和人源结肠组织中分离原代肌成纤维细胞的技术，该技术可用于 体外 实验。
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摘要
摘要
肌成纤维细胞是胃肠道（GI）间质中的一种细胞，因其在多种胃肠道功能中发挥的关键作用而日益受到关注。尽管目前已有多种商业化的肌成纤维细胞系可用于研究这些细胞 体外细胞系在实验性细胞培养条件下所得的研究结果，由于其实验体系的高度还原性，存在固有的局限性。使用原代肌成纤维细胞在验证细胞系中获得的实验发现方面具有显著优势。从动物模型中分离原代肌成纤维细胞，可使研究在更接近所研究疾病状态的条件下进行。而从人类结肠组织中分离原代肌成纤维细胞，则可提供最具相关性的实验数据，因为这些细胞直接来源于患有基础疾病的患者。本文描述了一种成熟可靠的技术，可用于从小鼠和人类结肠组织中分离原代肌成纤维细胞。这些分离得到的细胞经鉴定为α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin）和波形蛋白（vimentin）阳性、结蛋白（desmin）阴性，符合肠上皮下肌成纤维细胞的特征。原代肌成纤维细胞可在体外培养扩增，并在有限的传代次数内用于各类实验研究。
引言
胃肠道（GI）功能的调控涉及黏膜层与其下方间质之间复杂的动态相互作用。这些相互作用通常有助于维持内环境稳态，但在病理条件下也可能导致疾病状态的发生1。肌成纤维细胞是一类位于上皮层下方的间质细胞亚群，通过旁分泌方式与周围的细胞亚群进行通讯，调控多种关键的胃肠道生理过程，包括黏膜再生、修复以及纤维化2。
18Co 细胞系是一种广泛用于研究肌成纤维细胞功能的人结肠肌成纤维细胞系，因其具有许多原代肌成纤维细胞的特征 原位 肌成纤维细胞。这些特征包括α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白的蛋白表达，以及多种细胞表面受体的表达，如表皮生长因子受体或溶血磷脂酸受体3,4由于这些共同的超微结构特征以及生物学功能的相似性518Co细胞系已被广泛用于研究肌成纤维细胞在多种疾病状态（如炎症性肠病或结直肠癌）中的功能3,6然而，使用细胞系存在固有的局限性和问题。这些局限性包括细胞系随着时间推移出现的基因型不稳定性，使其与原代细胞产生差异，从而改变细胞的表型及生物学功能，如生长速率以及与其他细胞群体的相互作用。此外，细胞系缺乏胃肠道微环境的正常组分（上皮、间质和血管成分），这是其应用中的主要限制因素。因此，从细胞系实验研究中得出的结论需要进一步验证，以降低误读的风险。
可通过人和小鼠结肠组织获取原代肌成纤维细胞，以验证在细胞系中发现的实验结果7。该方法最初由 Mahida 等人et al.8 描述，而我们的方案是众多已详细描述的技术之一，可用于从小鼠和人结肠组织中分离原代肌成纤维细胞9。对于任何结肠疾病的小鼠模型，均可采用此技术分离原代肌成纤维细胞，以研究其如何与邻近细胞相互作用，或在正常及病理性的胃肠道过程中所起的作用10,11。该技术可用于研究肌成纤维细胞在黏膜愈合、纤维化以及结直肠腺瘤和癌发生中的作用。此外，还可从因良性疾病（如炎症性肠病、狭窄、憩室炎）或恶性病变在手术中切除的人结肠组织中获取原代肌成纤维细胞。从人和小鼠结肠组织分离的原代细胞可在体外培养，并在有限的传代次数内使用。
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方案
1. 获取结肠组织
小鼠
一项用于开展动物实验的方案，详细说明了研究的原理和目标，已提交并获得本机构动物研究监督办公室的批准。
- 使用吸入式异氟烷麻醉小鼠，随后行颈椎脱位处死。
- 沿腹侧正中线做切口，将小肠向一侧牵开以暴露结肠。将膀胱和子宫（如存在）向侧方牵开，暴露耻骨，用精细剪刀剪断耻骨以显露直肠。
- 解剖分离直肠背侧系膜与结肠的连接，从肛门向盲肠方向游离结肠，并横断结肠以将其与小肠分离。
- 将标本置于冰冻的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
- 用10 ml注射器吸取冰冻的PBS，反复冲洗结肠腔以清除内容物，然后用剪刀沿纵轴剪开结肠。
- 将结肠放入含有20 ml冰冻PBS的50 ml锥形管中。结肠无需特定方向放置。通过更换PBS清洗结肠，直至液体清澈、无任何颗粒物质。
人类
一项从外科手术患者获取人体组织的方案，详细说明了获取此类组织的重要性以及潜在风险与益处的评估，已提交并获得本机构人类研究保护项目办公室的批准。
- 为获取用于研究的人体组织，需与结直肠外科医生开展科研合作。获取人结肠组织的方案应提交并获得机构审查委员会的批准。
- 在手术前，需从患者处获得书面知情同意书。
- 外科医生将以标准方式实施结肠切除术。一旦结肠从患者体内移除，标本将立即送至病理科。取一段直径约0.5英寸、不用于病理学评估的全层结肠壁组织，立即置于冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中。该标本不应包含结肠系膜，同时应去除网膜附件，因为脂肪的存在会影响消化过程。
2. 去除上皮细胞
- 将整段小鼠结肠放入含有25 ml 5 mM EDTA的HBSS溶液（室温）的50 ml锥形管中孵育。将锥形管置于37 °C振荡水浴摇床中（250 rpm）孵育15分钟。15分钟后，小心倾去液体，并重新加入25 ml 5 mM EDTA，重复洗涤，共进行5次洗涤。对于人结肠组织，从病理医生处获得约½英寸长的结肠壁条后，用剪刀将结肠组织剪成大小相等的四段。将其中两段放入一个50 ml锥形管中，其余两段放入另一个独立的50 ml锥形管中。随后加入25 ml 5 mM EDTA的HBSS溶液，并按上述方法进行洗涤。
- 用20 ml预冷的PBS冲洗结肠组织两次。
- 将小鼠结肠组织放入一个新的50 ml锥形管中，加入20 ml RPMI-5培养基、10 U分散酶（dispase）和2,000 U胶原酶D（collagenase D）（室温）。对于人结肠组织，使用两倍量的分散酶和胶原酶D（20 U分散酶，4,000 U胶原酶D）。
- 将锥形管垂直置于37 °C振荡水浴摇床中（若水平放置会导致过度通气，造成细胞损伤）。以250 rpm振荡最多60分钟。在分散酶和胶原酶D作用下，结肠组织将开始消化，逐渐呈现丝状外观，此过程通常约需30分钟。当结肠组织出现该形态时，立即将其从酶液中取出。
- 上下轻轻振荡每个锥形管2–4次以进一步破碎组织。在台式离心机中以200 × g于4 °C离心5分钟，使组织沉淀。小心倾去上清液并弃去。
3. 肌成纤维细胞的分离与培养
- 加入 10 ml ACK 裂解缓冲液（47 °C）重悬每个沉淀。再次在 200 × g 离心 5 分钟（4 °C），倾去并弃去上清液。
- 用移液器加入 10 ml RPMI-5 重悬每个沉淀。
- 用 10 ml 移液器将一半细胞悬液（5 ml）通过 70 µm 细胞筛过滤至一个 100 mm 组织培养皿中，然后额外加入 15 ml RPMI-5。将剩余的 5 ml 细胞悬液重复此操作，转移至另一个 100 mm 组织培养皿中。因此，一只小鼠结肠可获得两个 100 mm 组织培养皿，而一段 ½ 英寸的人结肠组织可总共获得四个 100 mm 组织培养皿。
- 将组织培养皿置于含 10% CO2 的 37 °C 培养箱中。小鼠和人原代细胞的培养条件相同。
- 3 小时后，用两次 HBSS 轻柔洗涤以去除未贴壁细胞。漂浮的碎片应被轻柔洗去。贴壁细胞包括上皮细胞、巨噬细胞和肌成纤维细胞。接种一周后，仅有肌成纤维细胞增殖，巨噬细胞和上皮细胞在首次传代后即进入衰老状态。加入新鲜 RPMI-5，并在细胞培养条件下继续培养细胞。
- 细胞通过胰酶消化 5 分钟进行传代，按 2:1 比例传代。
缩写
HBSS：Hank's 平衡盐溶液；RPMI-5：Roswell Park Memorial Institute 培养基；ACK：氯化铵-氯化钾溶液（Ammonium-Chloride-Potassium）；FCS：胎牛血清；TC处理：组织培养处理
溶液
ACK 裂解缓冲液 - （4.15 g NH4Cl，0.5 g KHCO3，18.6 mg Na2EDTA，400 ml H2O，用 1 N HCl 调节 pH 至 7.2–7.4）。经 0.2 µm 滤膜过滤除菌，4 °C 保存。RPMI-5 - （配制 500 ml：454.5 ml RPMI，25 ml FCS，5 ml 200 mM L-谷氨酰胺，5 ml 1 M HEPES，pH 7.4，5 ml 100 mM 丙酮酸钠，5 ml 100× 青霉素-链霉素，500 ml PBS 中含 50 mM β-巯基乙醇）。
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结果
原代人肌成纤维细胞分离后可在细胞培养中生长，并在有限的传代次数内使用（最多至第4代）。这些细胞的特征表现为α-平滑肌肌动蛋白和波形蛋白阳性，而结蛋白阴性（图1A），符合肠上皮下肌成纤维细胞的表型5,7。此外，它们具有典型的星状形态（图1B）。原代肌成纤维细胞可用于验证在细胞系中发现的实验结果。该方法已被用于证明促炎性细胞因子TNF-α（10 ng/ml）可诱导这些细胞中EGF受体表达及其信号通路的上调7。EGF受体表达和信号通路的上调最初是在前述的人结肠肌成纤维细胞系18Co中发现的（图2）。在图2A中，我们显示18Co细胞经TNF-α处理后，EGF受体的表达呈时间依赖性增加。这与细胞中EGF诱导的COX-2表达增强以及p42/44 MAPK磷酸化水平升高相关（图2B）。为了验证这些实验结果，研究使用从结直肠癌患者手术切除结肠组织中分离的原代人肌成纤维细胞重复了实验。如图2C和...
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讨论
使用小鼠或人结肠时，该通用技术类似。该技术也可用于从小肠中分离肌成纤维细胞。以下将分别讨论从小鼠和人结肠分离肌成纤维细胞的具体细节。
1. 小鼠结肠
通过将一根4英寸、16 G的Popper钝端针连接到结肠的一端，可方便小鼠结肠的灌洗。这在沿纵轴切开结肠时也有帮助。可将结肠组织像手风琴一样折叠到针上，然后将剪刀尖端朝上放置，一边切割一边将结肠组织滑过剪刀刃，从而沿纵轴打开结肠。
在步骤2.1中，需要明确的是，死亡细胞的核物质可能导致细胞聚集。可通过添加DNase（50 mg/ml）来解决此问题。
最关键的步骤是第2.4步。需密切观察结肠组织。当结肠开始呈现丝状时，立即将其从酶液中取出。结肠无需孵育完整的60分钟。若结肠组织暴露于中性蛋白酶和胶原酶D的时间过长，细胞将死亡。这是导致细胞得率低下的常见错误。
细胞污染是另一个常见问题。通过规范的操作技术、适当的清洗和过滤，...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 5KO8DK085136-02 对 JY 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂名称 | 公司 | 目录编号 | 备注（可选） |
| Dispase I | Invitrogen/GIBCO | #17105-041 | |
| Collagenase D | Roche | #1 088 858 | |
| 4 英寸，16 G Popper 钝端针头 | Fisher | #14-825-16K |
参考文献
- Armaka, M., et al. Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases. J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).
- Powell, D. W., et al. Paracrine cells important in health and disease. Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).
- Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).
- Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).
- Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line. Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).
- Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).
- Yoo, J., et al. TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).
- Mahida, Y. R., et al. Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2. Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).
- De Wever, O., et al. Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts. Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).
- Edwards, R. A., Smock, A. Z. Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts. Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).
- Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).
- Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis. J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).
- Saada, J. I., et al. Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa. J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).
- Lahar, N., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 6, e26898(2011).
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重印与许可
