氧微环境中的单个胰岛水平的定量和临时控制

Summary

微流控氧赋予的不仅仅是方便和速度超过低氧室的生物实验。通过扩散穿过膜实现的，特别是当，微氧可以在微尺度级同时提供液相和气相的调制。这项技术使动态多参数实验的关键学习islet病理生理学。

Abstract

同时氧化葡萄糖刺激分泌耦合系数在一个单一的技术和监测是模拟胰岛缺氧的病理生理状态的关键，尤其是在移植环境。同时标准的缺氧室技术无法调节两个刺激，也不提供葡萄糖刺激分泌耦合系数的实时监控。为了解决这些问题，我们应用了多层微流控技术，通过扩散膜水性和气相调制集成。这将创建在周围的透明聚二甲基硅氧烷（PDMS）设备的microscaled胰岛刺激夹层，可以监控通过荧光显微镜前述的耦合因素。此外，气体输入由一对微分配器的控制，提供了定量，分分钟之间0-21％氧气的调制。这种间歇性缺氧是适用于调查小岛的一个新现象吨预处理。此外，手持多式联运显微镜，我们能够在这些缺氧事件来看看详细的钙和K _ATP通道的动态。我们设想微缺氧，特别是这个同步双相位技术，如胰岛细胞研究以及许多离体组织的重要工具。

Introduction

动态缺氧是很重要的生物学，专为胰岛移植

动态缺氧是一种重要的生理，以及在许多生物组织的病理生理参数。变化中的氧，例如，是在血管生成一种强效的发育信号。此外，在缺氧的空间和时间模式调节HIF1-α，像胰腺癌疾病中发挥作用。缺氧也是影响胰岛移植结果的混杂因素。近日，缺氧，或间歇性低氧（IH）的时间上振荡"预处理"小岛¹展示了好处。然而，胰岛生理静态和暂态缺氧的影响还没有得到很好的理解或学习，主要是由于缺乏适当的工具来控制胰岛的微环境。

胰岛血管化以及在体内

胰岛是50-400 56;米球形聚集体内分泌细胞，包括β-细胞和α-细胞是负责葡萄糖稳态。当胰岛在血液中，摄取和糖酵解导致ATP的产生，这带来了ATP敏感性钾离子（K _ATP）通道，并导致钙离子内流触发胰岛素颗粒的胞吐暴露于刺激的葡萄糖。氧气是很重要的，以驱动此沉重的代谢过程和胰岛素分泌显著由血流量和氧供应的动力除了葡萄糖梯度的影响。胰岛容易在体内内从毛细血管一个单元格的长度执行此葡萄糖-胰岛素反应，因为它们是高度灌注胰腺，每个。然而，密集的网络intraislet毛细血管被胶原酶期间胰岛分离^2,3移除。因此，氧气和养分供应被约束到一个100微米的周长由于扩散限制。

在重建胰岛微环境的步骤">目前的技术已经成功....

Protocol

1。准备小鼠胰岛

1. 解剖C57BL / 6小鼠，并通过胶原酶消化和Ficoll密度梯度分离孤立小岛。 （参见在^2,3 JOVE引用的文章）。
2. 培养在含有10％FBS，1％青霉素/链霉素，和20mM HEPES在培养皿中的胰岛在RPMI-1640培养基（37℃，5％CO _2）。后分离，培养胰岛实验中使用前24小时。使用1-2天以内的小岛，以确保一致的结果。

2。使得微流体平台

1. 生成的微观结构几何形状的透明的光掩模对每个器件层:1）的入口和出口，2）葡萄糖微流体层与表面灌流室（直径8毫米×3毫米，150微升），3）200微米的膜具有微孔（500微米的直径， 100微米深），以及4）气体的微流体层。
2. 为了制造入口和出口层，倒脱气，预混PDMS到为1.5毫米的空白培养皿中并固化在80℃下进行2小时的高度。冲头直径为2毫米的输入/输出端口。
3. 到制作葡萄糖微流体层，自旋2 350微米层的SU8-2150，以形成一个单一的700微米的层上形成4中的硅晶片。
   1. 通过适当的光掩模暴露紫外光显影后到微通道图案转印到SU8，产生700微米高的主人。
   2. 倾脱气，预混合的PDMS到这个主到3mm的高度和固化在80℃下搅拌2小时。切这个PDMS塑造一个刀片。
   3. 冲头直径为2毫米的输入/输出端口以及将直径8毫米的腔....

Results

中央到此胰岛缺氧的方法是调节水相和气相的刺激在相同微流体腔室与微小尺度瞬变的能力。 图1是一个）的有代表性的结果胰岛室中测量的双重刺激和b）快速调制。水调制，通过引入荧光素所显示的腔，实现了在三到四分钟混合平衡。此外，氧可以从5-21％会加强与快速瞬变，使氧气与循环周期短至2分钟。不同循环深度和频率也可以实现为如图2所示。

当此循环被施加在胰岛创建间歇性低氧，人们可以观察到预处理胰岛对缺氧的好处相比，有规律的，含氧量正常的脉冲， 图3a。由于细胞内钙离子通量的信号mechanis胰岛素米分泌是在实时监控，缺氧和IH的效果可以在钙瞬变， 图3b的过冲和振荡阻尼被观察到。这些都是有关联的重要参数K _ATP通道建议，以控制预处理过程。此外，线粒体的链接，代谢和缺氧可通过监测线粒体电位使用罗丹明可视化。最后，收集微流控废水允许总胰岛素量的酶联免疫吸附测定法。钙，线粒体膜电位，而胰岛素是开始建立缺氧下的瞬态， 图3c中<.......

Discussion

集成在这个小岛缺氧技术的多模式现在几点注意这里进行故障排除。首先，分离出的胰岛继续降解，在文化瓦解由于来自腺泡细胞消化酶。后胰岛分离标准化的实验来1-2天，因此，在获得一致的结果至关重要。第二，所述水性流缺氧和间歇性缺氧期间被停止，以防止对流的间隙在层流和扩散之间的边界。这似乎限制了胰岛预处理的持续时间。在水通道的气体交换未来整合可以消除这一微小的间隙，同时还允许快速调制气体在膜。第三，在加载小岛，水管道应仔细按相反的顺序重新连接（出口再进口），以避免捕获气泡。最后，未来的设备可与扇出微流体分配器进行扩展，以帮助分布忒胰岛的簇在整个室中，在底部它可以与捕集器的口袋的阵列图案化。这除了口袋阵列微流分布将有助于创造小岛的位置阵列的高通量实验。

在此之前的微流体胰岛缺氧技术，最快的间歇性缺氧调制分别在一至三个分钟循环次数通过使用小的自定义低氧室与加压气体的高流速来实现。然而，这些只能用于整体动物，而不是在单个胰岛水平。此外，在整个动物的胰腺（呼吸平衡后）达到的实际低氧水平的不确定性也有无法探测葡萄糖胰岛素响应于实时，控制良好的微环境。相比之下，无论是水和气体的刺激被控制到分钟的时间尺度在.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂/材料
Spinner	Laurell	WS-400
SU8 MicroChem		SU8-2150/SU8-2100
数字热板	PMC 数据表	722A
紫外线固化灯	OmniCure	S1000
PMDS	陶氏化学	Sylgard 184
Corona Wand	ETP	BD-20AC
真空室	Bel-Art	420220000
微量分配器	The Lee Company	IKTX0322000A
5 V 和 20 V 直流电源	无线电棚
NI USB 国家	仪器	NI USB-6501
温度计	Omega Engineering， Inc.
蠕动泵	Gilson	Minipulse 2
氧传感器	海洋光学	NeoFox
馏分收集器	Gilson	203
Pippette	Fisher Scientific	Finnpipette II 100μl
倒置落射荧光显微镜	Leica	DMI 4000B
50 ml 锥形管	Fisher Scientific
Fura-2 荧光染料	分子探针，Life Technologies
罗丹明 123 荧光染料	分子探针，Life Technologies
培养基	Sigma-Aldrich	RPMI-1640
HEPES	Sigma-Aldrich
葡萄糖	Sigma-Aldrich
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich
30 英寸硅胶管	Cole-Parmer		1/16 英寸 x 1/8 英寸
1.5 ml Eppendorf 管	Fisher Scientific
Y 型连接器	Cole-Parmer		1/16 in 和 4 mm
注射器连接器	Cole-Parmer		母鲁尔插头 1/16 in
直连接器	Cole-Parmer		1/16 in
弯头连接器	Cole-Parmer		1/16 in