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方法文章

一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片

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DOI：

10.3791/50618

⸱

2013年10月15日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Applied Biosciences, ETH Zurich, Switzerland

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于单细胞分析的微流控芯片。该芯片可通过荧光检测或免疫检测方法，对细胞内蛋白质、酶、辅因子和第二信使进行定量分析。 

摘要

我们介绍了一种微流控装置，可实现对多个单细胞内生物分子进行并行的定量测定。该装置通过被动捕获的方式将细胞固定于微腔室中央。当控制层被激活时，细胞被隔离于一个微小腔室内，使其与周围环境分离。随后可在不影响被隔离细胞的情况下更换周围液体环境。通过短暂开启和关闭腔室，可在数百毫秒内完成腔室内溶液的置换。由于腔室操作具有可逆性，细胞可按需依次暴露于不同的溶液环境中，且调控精度极高。 例如 用于孵育、洗涤，最终进行细胞裂解。密封良好的微腔可有效保留裂解液，并在细胞裂解后最小化且可控地减少稀释效应。由于裂解和分析在同一位置进行，分析物在转移过程中不会发生进一步稀释或损失，因而保持了高灵敏度。因此，该微腔设计能够对单个细胞释放的极少量细胞内分子（zeptomoles，attomoles）进行可靠且可重复的定量分析。此外，多个微腔可排列成阵列形式，只要采用适当的光学仪器进行监测，即可实现对大量细胞的并行分析。我们已利用该平台开展概念验证研究，以相对或绝对定量的方式分析细胞内蛋白质、酶、辅因子以及第二信使。

引言

过去许多研究揭示了大量细胞群体中细胞与细胞之间的差异1-3，特别是信号传导过程4 以及细胞内生物分子（如蛋白质5,6、代谢物和辅因子7,8）的含量差异。这些异质性被认为对细胞的适应与进化具有根本性的重要意义9，同时在癌症等疾病的发生及治疗中也发挥着关键作用10-13。因此，在生物学和药理学研究中，单细胞水平的研究具有高度重要性，尤其是当这些研究能够揭示细胞在生物活性化学物质处理后所表现出的不同响应时。

近年来，已开发出多种分析平台，用于促进对单个活细胞或细胞内化学成分的分析。尽管荧光激活细胞分选（FACS）是高通量分析单个活细胞的金标准方法，但该方法无法用于细胞内或分泌化合物的定量分析。微流控平台的出现为单细胞的定位、处理和观察提供了新的分析策略。Quake 及其同事将柔性 PDMS 阀集成到微流控系统中，成为微流控技术发展的一个里程碑14,15。这些阀门非常有用，因为它们可以在芯片上隔离特定区域，例如 分隔两个细胞培养体系16。此外，它们特别适用于单细胞分析，从而有助于减轻分析物稀释的问题。Hansen 及其同事最近展示了该方法在单细胞分析中的强大能力，实现了对数百个单细胞基因表达的并行分析17。

在靶向蛋白质和代谢物时，由于缺乏合适的扩增方法、存在大量不同类型的化合物以及这些化合物在化学性质上的多样性，分析过程非常困难。此外，大多数细胞内生物分子的拷贝数预计仅为数万个量级18，因此所采用的分析方法必须具有高灵敏度。诸如免疫测定和酶联免疫吸附测定（ELISA）等更强大的检测方法难以整合到微流控装置中，因为它们需要多个洗涤和孵育步骤，以及表面固定化过程。

由于这些挑战，目前仅有少数研究报道了在单细胞水平上对蛋白质或代谢物进行定量分析。例如，已有研究报道了对荧光化合物分泌的检测19,20。最近，有研究将ELISA技术应用于细胞培养物（THP-1细胞）21以及单个（免疫）细胞10分泌的（非荧光）蛋白质分析。针对细胞内蛋白质，Shi et al. 开发了一种微流控装置，通过免疫分析法实现了肿瘤细胞信号通路相关细胞内蛋白质的鉴定11。然而，这些方法仅测定了蛋白质的相对含量，且未采用酶促扩增手段来增强低丰度蛋白质的检测信号。

最近，我们成功地将单细胞捕获微装置与荧光分析8和免疫分析22相结合（图1）。细胞被动捕获在微米级障碍结构中，可在细胞不发生移动的情况下实现培养基及其他化学试剂的供给和（快速）更换。每个捕获位点周围设有环形阀门，可将细胞隔离至极小体积的“微室”中。在加入细胞裂解（低渗）缓冲液后，该阀门立即启动，从而防止细胞内分子或分泌分子扩散流失。尤为重要的是，由于微室体积很小（625 pl），可避免分子被大幅稀释。此外，由于裂解和分析均在芯片的同一位置进行，因此不会因样品转移造成分析物损失。本文所述芯片设计包含8排交替排列的微室，每排分别有7个或8个微室，共60个微室。微室按排进行控制，从而避免沿同一排发生交叉污染。

该平台可与荧光检测以及免疫学检测联用（图1d）。对于后者，我们建立了与芯片制备和组装过程兼容的抗体固定化方案。因此，该平台为在单细胞水平上开展高灵敏度、可靠且可定量的检测开辟了途径。迄今为止，我们已将该装置用于分析细胞内及分泌的酶（通过酶学检测进行相对定量）、细胞内辅因子、蛋白质和小分子（通过终点法检测或ELISA进行绝对定量）。下文将描述利用多层软光刻技术进行芯片制备的过程，以及通过微接触印刷和表面化学实现抗体图案化的相关方案。此外，还提供了一些芯片使用与操作的实例。

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方案

1. SU-8 母版制作

采用以下方案制备通道（流体和控制）的两个主模具（示意图和尺寸参见图2），但使用不同的掩模图案。该过程如图3a所示。

  1. 首先将一片4英寸的硅片在180 °C下加热10分钟。将脱水后的硅片装入旋涂仪中，并按照以下程序对SU-8 2015进行旋涂：
    1. 以100 rpm转速旋转硅片20秒（打开旋涂仪盖子，在此步骤中滴加SU-8，滴加完毕后关闭盖子）。
    2. 以500 rpm转速旋转硅片10秒（使光刻胶均匀铺展至整个硅片表面）。
    3. 以1,750 rpm转速旋转硅片30秒（使光刻胶厚度定义为20 µm）。
  2. 用丙酮（使用棉签）去除硅片边缘的光刻胶，否则在下一步中会粘附到加热板上。将硅片转移至95 °C的加热板上，加热4分钟。软烘结束后，在掩模对准仪中通过贴附于钠钙玻璃上的光掩模，用紫外光（365 nm处测量为150 mJ/cm2）照射光刻胶。
  3. 曝光后，再次将硅片置于加热板上，在95 °C下加热5分钟。随后将硅片冷却至室温，再浸入SU-8显影液中4分钟。轻轻摇晃以去除未曝光的SU-8。用洁净室级异丙醇清洗硅片，并用氮气吹干。在显微镜下检查显影是否成功（特别是细胞捕获结构）。若细胞捕获结构已完全显影，则应能观察到硅片表面的反射光。如有需要，可再延长显影数分钟。
  4. 将硅片放入烘箱中，在180 °C下烘烤2小时 ，以彻底去除残留溶剂。使用台阶仪检测微通道的高度。若高度与预期不符，则更换新硅片并从步骤1.1开始重复本方案，调整旋涂速度（步骤1.1.3）。最后，在干燥器中使用1H,1H,2H,2H-全氟癸基二甲基氯硅烷对硅片进行过夜硅烷化处理，完成母模的制备。

2. 微接触印刷用主模板的制备

  1. 为了制备用于微接触印刷的主模具，将硅片在 180 °C 下脱水 10 分钟。以 7,500 rpm 的转速在该硅片上旋涂 1 ml HDMS，持续 30 秒（光刻胶在硅烷化表面上附着性更好）。使用以下程序在硅片上旋涂 2 ml AZ1518 正性光刻胶：
    1. 将光刻胶静态滴加到硅片表面。
    2. 以 500 rpm 转速旋涂 5 秒。
    3. 以 4000 rpm 转速旋涂 60 秒。
  2. 在热板上于 100 °C 进行 50 秒的前烘后，通过掩膜版和掩膜对准仪将光刻胶暴露于紫外光下（365 nm 波长，剂量为 21 mJ/cm2）。将硅片浸入 AZ 726 显影液中显影 75 秒。用去离子水冲洗显影后的硅片，并用氮气吹干。在 115 °C 下加热 50 秒以去除残留溶剂。将硅片置于真空条件下过夜进行硅烷化处理。

3. 微流控芯片的制备

本实验采用双层装置设计。这两层需分别制备，然后键合在一起，最后将芯片键合到玻璃载片上（图3b）。此步骤描述了PDMS层以及用于微接触印刷的PDMS印章的制备过程。

  1. 制备 PDMS 与固化剂按 10:1 比例的混合物。总共准备约 80 g PDMS（使用我们的设计可制作 10 个芯片）。充分混合两组分，并对 PDMS 进行脱气处理，直至混合物中无气泡（约 30 分钟）。
  2. 将带有控制层的晶圆放入培养皿中，并用胶带固定于底部。随后，在其表面倒入  约 50 g PDMS，并将晶圆置于 80 °C 烤箱中至少 2 小时 ，以确保 PDMS 完全固化。对用于微接触印刷的晶圆重复相同操作，此步骤约需 20 g PDMS。
  3. 在带有流体层的晶圆上以 2,000 rpm 的转速进行旋涂 PDMS，形成厚度约为 40 µm 的 PDMS 层。将 PDMS 在 80 °C 烤箱中固化至少 1 小时 。
  4. 当两部分均完成固化后，将控制层从晶圆上取下，并用剃刀片切割成小片。使用 1 mm 组织打孔器打孔以形成压力连接孔。储存时，建议在通道上覆盖一片胶带。
  5. 为键合两层，取旋涂后的晶圆和上层部分，放入等离子清洗仪23中。经等离子处理后，迅速在长工作距离显微镜下对准两部分。在上层部分周围添加少量备用 PDMS。此步骤非必需，但有助于后续将 PDMS 从晶圆上剥离。将晶圆置于 80 °C 烤箱中至少 1 小时。
  6. 使用手术刀小心地将 PDMS 从晶圆上剥离，并切割成微芯片。使用 1.5 mm 组织打孔器为流体连接处打孔。
  7. PDMS 芯片现已完成，可长期储存数月。可选步骤：若芯片需与储液池配合使用，可截取 200 µl 移液枪头的上半部分，并用少量半固化 PDMS 将其粘接在芯片顶部。再次将芯片放入 80 °C 烤箱中至少 1 小时。

4. 与玻片的粘合

若要将该装置用于直接酶法测定，键合后唯一需要的步骤是表面封闭。对于本方案，请继续进行步骤A。然而，若要将微流控芯片用于免疫测定或ELISA，请参考方案B，以将结合位点仅限制在玻璃载玻片上（即 用于全内反射荧光显微镜或表面等离子体共振）。如果此限制不重要，请参考步骤A，但在步骤4.3中使用生物素化偶联物，并继续进行方案B中的步骤4.8，以构建一个完全功能化的表面。

在执行方案 A 和 B 之前：建议在将所有蛋白质溶液引入芯片前进行过滤。否则，杂质和蛋白质聚集体可能会堵塞细胞捕获结构，从而减少可用于分析的腔室数量。为此，应在将所有溶液引入通道前，使用非蛋白质吸附型滤器装置对溶液进行过滤。

方案 A（酶学测定）

  1. 为完成微流控装置，需将PDMS部件键合到玻璃载片上。首先，用肥皂、蒸馏水和乙醇清洗玻璃载片，然后用氮气流吹干。用透明胶带清洁PDMS部件。
  2. 将PDMS部件和已清洁的玻璃载片放入等离子清洗仪中，在18 W条件下处理45秒。为确保牢固键合，将芯片置于加热板（100 °C）上加热5分钟。
  3. 键合完成后，向芯片内填充液体。一种简便的方法是利用离心力。剪去200 µl移液器吸头的底部。对于流体通道，使用封闭溶液（牛血清白蛋白（4% w/v）或聚-L-赖氨酸）接枝的聚乙二醇（0.05% w/v）填充，并将吸头插入入口。控制层的入口则填充水或等渗溶液，e.g. PBS。将芯片放入离心机中（800 × g）离心5分钟。此时通道应已完全充满液体。若未完全填充，请重复此步骤。
  4. 在室温下孵育封闭溶液至少30 min 。使用注射泵以10 µl/min的流速用PBS冲洗流体层中的溶液。该装置现在可用于细胞实验。

方案B（免疫测定）

有关从步骤 4.7 开始的表面修饰的完整概述，请参见表 1。

  1. 将用于微接触印刷的PDMS印章与bBSA/BSA溶液孵育（例如 1–100）。30 分钟后，用蒸馏水彻底清洗印模，并用氮气流吹干印模。迅速将印模放置在已清洁的玻璃载片上（图4).
  2. 将带有印章的载玻片与微流控芯片的上部一同置于等离子清洗仪中，在最大功率（18 W）下进行氧气等离子体处理45秒。等离子处理后，取下印章，将印有图案的一面与器件的微腔区域对齐。将芯片置于50 °C加热板上30分钟。
  3. 为封闭剩余表面，使用离心机将经无菌过滤的牛血清白蛋白溶液（4% (w/v) 溶于 PBS）引入芯片（参见步骤 4.2）。孵育 1 小时后，用 PBS 洗去流体层中的溶液（参见步骤 4.3）。芯片可立即使用，或置于湿盒中于 4 °C 保存最多 2 周。
  4. 为获得完全功能化的结合表面，将亲和素（0.025% (w/v)，溶于PBS）引入储液池中，以5 µl/min的流速作用30分钟。 通过流体通道抽出亲和素溶液。随后用 PBS 冲洗 10 分钟。彻底清洗储液池。
  5. 随后，加入蛋白G（PBS中0.0025% (w/v)），冲洗30分钟。再用PBS洗涤10分钟。 随后，加入目标抗体（PBS 中浓度为 0.0001% (w/v)），孵育 10 分钟。10 分钟后，停止流动，静置 15 分钟。 以促进结合。随后，用PBS洗涤10分钟。

5. 细胞实验

由于可能的检测方法种类繁多，本方案以通用形式撰写。以下以G6PDH毒性检测所需的试剂为例进行说明。该装置的初始细胞捕获效率约为2.5%，即 每200个细胞中约有5个被成功捕获。细胞捕获腔的最终占据率在很大程度上取决于所使用的细胞系、细胞系的悬浮处理方法以及细胞流经通道的时间。对于天然悬浮生长的细胞（如U937），在数分钟后约75%的微腔中可观察到单个细胞。其余微腔则要么未被填充，要么被两个或更多细胞占据。通常情况下，贴壁细胞系的单细胞占据率较低。当采用本文所述的较为温和的悬浮处理方法时，单细胞占据率下降至约30%（HEK、MLT细胞）。可通过胰酶处理细胞来提高单细胞占据率，但这可能同时改变实验结果。

根据目标分子的不同，吸附或吸收至PDMS可能会影响实验结果。可通过使用BSA或PLL-g-PEG封闭表面来减少吸附。大多数亲水性生物分子不易发生吸收，但应检查（小分子）亲脂性细胞组分是否存在吸收情况。

  1. 根据特定方案准备细胞（例如 药物添加）。对于悬浮细胞，直接将细胞加入芯片中；对于贴壁细胞系，使用无酶解离缓冲液制备细胞悬液。在将细胞引入芯片前进行过滤，以减少细胞团块的数量。
  2. 使用注射泵以正向流的方式将细胞加载到芯片上，而不是回抽细胞悬液。悬浮细胞系的流速为 5 µl/min 对于粘附性细胞，使用10–20 µl/min的较高流速，以减少细胞在通道壁上的非特异性黏附。
  3. 当捕获装置充满后，关闭腔室。若大量细胞非特异性地黏附于表面，可尝试使用细胞解离缓冲液以10-30 µl/min的流速冲洗去除。

方案 A（酶学测定）

  1. 通过芯片抽吸裂解缓冲液。本示例中，该缓冲液为低渗缓冲液，含有添加的Tween 20（10 mM Tris-HCl，10 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1% (v/v) Tween 20）。进行裂解时，快速开启并关闭腔室（即 在流速为10–50 µl/min时，持续约500毫秒7,21）。对于G6PDH测定，需在裂解缓冲液中加入2 mM葡萄糖-6-磷酸、0.5 mM NADP、0.5 U/ml 甲臜还原酶（diaphorase）和0.3 mM刃天青（resazurin）。裂解后应立即开始监测动力学反应。

注意：可选择任何适用于检测的缓冲液，但需注意强效去污剂（如Triton、SDS）会立即裂解细胞，导致在打开检测室时分析物丢失。

方案B（免疫测定）

ELISA 细胞实验的简要描述（流速、腔室状态， 等等。），请参阅 表1.

  1. 对于ELISA，加入所需的检测试剂（例如 二抗、标记抗原）直接加入裂解缓冲液中。此处添加的Tween 20可减少非特异性吸附。按照步骤5.4裂解细胞。孵育混合物10–15分钟，以促进结合（孵育时间取决于所用抗原和抗体）。
  2. 非特异性吸附在通道壁上的抗体-酶偶联物可能导致储液池和通道内已存在的检测试剂发生转化。为减少此类吸附带来的问题，可在孵育期间（在加入检测试剂前，关闭腔室）将所用检测试剂酶的永久性抑制剂冲洗通过芯片。对于辣根过氧化物酶（HRP），可使用20 mM盐酸水溶液以永久失活非特异性吸附的酶。
  3. 孵育结束后，加入检测试剂（例如 Amplex Red 和过氧化氢用于 HRP）加入芯片。短暂打开反应室，洗去未结合的二抗，并加入检测试剂。立即开始监测动力学反应。
  4. 校准：固定针对目标分子的抗体，封闭反应室。在芯片外使用缓冲液或细胞裂解液配制不同浓度的分析物。将某一浓度的分析物施加到芯片上，并快速置换反应室内的液体体积（开启时间为500毫秒）。该开启时间足够短，可确保在冲洗过程中分析物不会额外累积，仅检测微室体积内特定数量的分子。根据溶液中抗原的已知浓度和反应室体积（625皮升），计算反应室内分子的数量。随后，继续执行步骤5.5，引入检测组分。

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结果

我们的平台能够分析存在于单个细胞内或由单个细胞分泌的多种分子。在此，我们展示不同的示例研究，以突出该检测方法的广泛应用范围。我们将分别举例说明一种分泌型酶（图5a）、一种细胞内酶（图5b）以及细胞内蛋白（图5c 和 图5d）。有关辅因子或小分子等其他示例，请参见 Eyer et al. (2012) 和 Eyer et al. (2013)。

首先，我们介绍一种针对分泌型酶的检测方法（图5a）。在佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）激活后，人单核细胞会诱导分泌溶菌酶，这是一种可导致细菌细胞裂解的酶。在该检测中，细胞缓冲液含有4-甲基伞形基-β-D-N,N′-二乙酰壳二糖苷（4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside），它是溶菌酶的弱荧光底物。当酶切解糖残基后，荧光基团被释放，可在微室内部被检测到。此处，微室的优势在于显著减少了...

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讨论

微流控技术为单细胞分析开辟了崭新而引人入胜的可能性。特别是利用微流控工具对细胞进行单个捕获和固定，使得针对单细胞特性及其响应的系统性短期和长期研究成为可能。此外，在芯片上生成的高频微液滴中封装细胞，实现了单细胞分泌研究，而这是传统流式细胞仪无法完成的。然而，当分析流程需要孵育和洗涤步骤时，微液滴方法存在一定的局限性。我们的方法结合了细胞捕获与隔离两种理念，因而有助于开展更为复杂的检测，包括基于表面固定化抗体的免疫分析。此外，该方法在应用和目标分析物方面具有很高的灵活性。

该微芯片的设计具有以下特点：(i) 高效捕获细胞，(ii) 可供给多种缓冲液和试剂，以及 (iii) 在需要时可在极小体积下实现可靠隔离。通过这种方式，可避免目标分子被稀释。单个装置上设有六十个（至数百个）微腔室，可同时进行大量平行实验。用于封闭微腔室的圆形阀门可通过行或列的方式统一或独立控制，这在需要防止相邻腔室之间发生交叉污染时尤为重要。当微腔室处于封闭状态时，通道可用盐酸等有害溶液进行清洗处理，而不会影响已被捕获的细胞。另一方面，微腔室内部体积的快速置换也是可行的。目前，完全打开腔室并引入新试剂所需的最短时间...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者衷心感谢 Tom Robinson 对手稿的校对，感谢 C. Bärtschi 和 H. Benz 设计并搭建了定制的压力控制系统。我们还要感谢苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的 FIRST 洁净室设施和光学显微镜中心（LMC）的使用支持。本研究由 Merck Serono 和欧洲研究理事会（ERC）第七框架计划（ERC 起步基金，项目编号 203428，nμLIPIDs）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂：
试剂名称公司货号评论（可选）
SU-8 2015MicroChem公司（美国马萨诸塞州牛顿市）无
1H,1H,2H,2H-全氟癸基二甲基氯硅烷ABCR（德国卡尔斯鲁厄）AB103608
4-甲基伞形基 β-D-N,N′二乙酰基壳二糖苷水合物Sigma AldrichM9763
丙酮默克 VWR（德国达姆施塔特）100014
亲和素AppliChem（Axon Lab AG）A-2568
AZ 1518AZ电子材料（德国威斯巴登）无可用数据
AZ 726 显影液AZ电子材料公司（德国威斯巴登）未提供
牛血清白蛋白Sigma AldrichA-4503
牛血清白蛋白，生物素Sigma AldrichA-8549
细胞解离缓冲液Invitrogen13151-014
六甲基二硅氮烷（HDMS）Sigma Aldrich40215
盐酸Fluka84422
异丙醇默克 VWR（德国达姆施塔特）109634
六水合氯化镁Fluka63068
MR显影剂600Microresist technology GmbH（德国柏林）无可用数据
PBSInvitrogen10010-031
PLL-g-PEG 接枝SuSoS, (Dü本多夫，瑞士未提供
PLL-g-PEG 接枝生物素SuSoS, (Dü本多夫，瑞士未提供
氯化钾Fluka60132
蛋白G，生物素Sigma精细化学品41624
硅片Si-Mat（德国考弗灵）无可用数据
Sylgard 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）道康宁39100000
三(羟甲基)氨基甲烷伯乐（Bio-Rad）1610716
Tween 20伯乐（Bio-Rad）1706531
<强>设备：
材料名称公司目录编号评论（可选）
0.22 µm PES 注射器滤器瞬时受体电位99722
1/1.5 mm 活检穿孔器Miltex，约克，宾夕法尼亚州，美国33-31AA/33-31A
Cell Trics 滤膜 20 µmPartec04-004-2325
Sigma 3-18K 离心机Kuehner无可用数据
Hotplate HP 160 III BMSawatec，Sax，瑞士未提供
MA-6 掩模对准器Karl Suess未提供
多焦距AZ100M显微镜尼康公司无可用数据
光刻掩模英国埃塞克斯米克罗利托无
等离子清洗机 PDC-32GHarrick无
甩涂机型号 WS-400 BZ-6NPP/LITELaurell未提供
Spin Modules SM 180 BMSawatec，Sax，瑞士未提供
台阶仪 Dektak XT AdvancedBruker未提供
Syringe pump neMESYSCetoni未提供

参考文献

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一种用于单细胞多功能化学分析的微流控芯片
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