斑马鱼幼体的自动化高通量行为分析

摘要

本实验室开发了一种新型高通量自动成像系统，可用于检测7日龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为。该系统适用于在幼鱼暴露于环境毒物或药物后，检测其行为发生的细微变化。

摘要

我们开发了一种新型高通量成像系统，用于分析7日龄斑马鱼幼鱼在多通道板中的行为。该系统可测量幼鱼的自发行为以及对厌恶刺激的反应，厌恶刺激通过PowerPoint演示呈现给幼鱼。via该系统记录的图像使用ImageJ宏进行分析，该宏可自动分离颜色通道、扣除背景，并应用阈值识别幼鱼在通道中的位置。随后，我们可以将坐标导入Excel表格，以量化游泳速度、对通道边缘或侧壁的偏好、静止行为、接触趋向性（thigmotaxis）、幼鱼间的距离以及回避行为。利用本系统可轻松检测行为的细微变化，因此适用于环境毒物或药物暴露后的行为学分析。

引言

斑马鱼正成为遗传学、发育学和行为学研究的流行模式生物^1-4。它们在受精后2-3天（dpf）从绒毛膜中孵化，到4-5 dpf时器官已完全发育并具备功能，并在7 dpf时表现出多种行为^5,6。由于体型微小，斑马鱼幼体非常适合进行高通量分析^7,8。目前已有商业软件可用于斑马鱼幼体及成体行为的自动化分析^9-14。然而，这些软件价格昂贵，且在检测多孔板中斑马鱼幼体复杂行为方面功能有限。

我们开发了一种新型的高通量成像系统，该系统构建成本低廉，可对7天龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为进行定量分析^15,16。该系统使我们能够快速、高效地检测胚胎期暴露于多种药物和环境毒物后出现的细微行为异常^16-18。

该系统采用木制柜体构建，在柜体顶部安装一台数码相机。相机向下拍摄，正对柜体底部放置的笔记本电脑屏幕，屏幕朝上显示内容¹⁵。通过延时成像记录幼虫在通道中的位置变化。最多可将四个多孔板或多通道板置于笔记本屏幕上方，用于容纳幼虫。我们使用 PowerPoint 演示文稿作为厌恶刺激，诱导幼虫产生远离刺激区域（回避行为）并游向边缘区域（趋触行为）的反应^15,17。所采集的图像导入 ImageJ 软件，利用自动宏程序分离颜色通道、扣除背景，并应用阈值以识别单个幼虫。每幅图像中每个幼虫的坐标被逐一列出，并可导入 Excel 文件，用于量化分析回避行为与趋触行为、个体间距离、游泳速度以及静止时间等指标¹⁶。

方案

1. 斑马鱼胚胎的收集与幼鱼培养

1. 应在黎明时将带有“假”草（由绿色纱线制成）的玻璃派热克斯培养皿插入水箱中，并保留两小时以收集斑马鱼胚胎。图1。应将含有胚胎的玻璃培养皿倒入手持筛网中，并用去离子水冲洗。随后将胚胎在卵水中培养。卵水由去离子水中含60 mg/L Instant Ocean和0.25 mg/L的亚甲蓝组成，后者用作霉菌抑制剂。
2. 根据具体实验的假设，胚胎可在特定发育阶段立即处理，或使用毒物或药物进行处理。毒物和药物通常溶解于DMSO中（浓度为1,000倍），并应在卵水培养基中直接进一步稀释。
3. 在胚胎和幼体阶段使用药物或毒物处理期间，可将幼体和胚胎饲养在深型培养皿中，密度约为每50 ml 50–60尾幼体，直至7 dpf进行行为分析（应至少每隔一天更换一次卵水溶液，以避免死胚胎引起的真菌/细菌生长）。

2. 行为学分析用模具的制备

1. 专门设计的塑料模具尺寸为 11.7 cm x 7.6 cm x 5 mm，由本实验室定制。这些模具用于在 Thermo Scientific 的单孔塑料板（尺寸为 12.4 cm x 8.1 cm x 1.2 cm）中倒入琼脂糖以形成泳道。
2. 模具内含五个泳道，其侧壁呈 60° 倾斜。泳道高度为 3.5 mm，顶部宽度（最宽处）为 18 mm，底部宽度为 14 mm。模具中相邻泳道之间间距为 4 mm（图 2）。
3. 制备泳道时，将 50 ml 融化的琼脂糖（含 0.8% 琼脂糖的去离子水，添加 60 mg/L Instant Ocean）倒入单孔板中。随后应缓慢地将模具置于液态琼脂糖表面，以避免产生气泡；待琼脂糖冷却凝固（约需 45 分钟）后，即可取出模具。
4. 琼脂糖泳道应在行为学实验开始前不超过一天的时间内制备（以防止琼脂糖干燥）。带盖的培养皿可在室温下保存泳道，最长保存时间约为 36 小时。琼脂糖泳道仅可用于一次实验，使用后应丢弃。

3. 图像采集

1. 每个孔中最多可放置 20 条幼鱼。通常每个孔使用 5 条幼鱼，以便更准确地追踪游泳速度，并减少每次实验所需的幼鱼数量。根据实验需要，孔中可加入含或不含药物或毒物的养卵水。然而，在将孔板放入成像箱之前，不应将液体加满；这可以防止溢出。为保证一致性，幼鱼在被放入琼脂糖模具并置于笔记本电脑屏幕上方后，应有十分钟的适应期。高效地将幼鱼从培养皿转移到琼脂糖孔道中，有助于减少幼鱼的应激反应。当幼鱼饲养在较浅的培养皿或水箱中时，操作最为方便。
2. 成像箱包含一台用于延时摄影的佳能数码相机和一台笔记本电脑。相机应放置在成像箱顶部，镜头朝下，对准箱底朝上放置的 15.6 英寸屏幕笔记本电脑（图 3）。四个孔板应手动直接放置在笔记本电脑屏幕上方。此时可将养卵水或化学处理液加至与孔道顶部齐平（以消除图像中孔道边缘的阴影）。
3. 使用 PowerPoint 演示文稿作为对幼鱼的厌恶刺激。过去曾向斑马鱼幼鱼呈现移动的红色圆球，用于 6 或 12 孔多孔板实验^15,17,18。当前的 PowerPoint 演示文稿首先显示 15 分钟的纯白色背景，随后在孔板上半部分显示 15 分钟移动的红色条带（图 4）。为避免幼鱼过热，建议选用屏幕温度不超过 28 °C 的笔记本电脑。为防止琼脂糖孔道内液体蒸发，最大成像时间应控制在 1 小时以内。
4. 数码相机应设置为延时摄影模式，每 6 秒拍摄一张照片，每次实验共采集 300 张图像。然而，拍摄频率和时长可根据具体实验和行为量化需求进行调整。过去曾采用较长的时间间隔以实现更长的成像时间。相机也可设置为较低分辨率，以视频速度（每秒 30 帧）进行成像。虽然较低分辨率仅能覆盖单个多孔板区域，但视频记录适用于捕捉快速游泳事件¹⁵。

4. 图像分析

1. 应使用 ImageJ 打开图像，并配合实验室内部专门编写的宏进行操作。该宏可自动分离颜色通道以去除红色，进行背景扣除，应用阈值，并通过颗粒分析识别幼鱼。目前用于五通道幼鱼分析的最新宏为 Zebrafish_macro25k。请根据宏中的提示设置图像数量、需扣除的颜色、图像阈值等参数。
2. 所有图像完成 ImageJ 宏处理后，将显示一个结果文件，其中包含每幅图像中各个幼鱼的 x、y 坐标，以及对应的图像编号和通道编号。
3. 结果文件应以 Excel 格式保存，并根据空白背景与移动条纹背景、以及孔位编号进行排序。应使用内置公式的 Excel 模板，该模板可自动计算幼鱼在孔板中的位置、幼鱼间的距离、运动速度及静止时间。目前最新的 Excel 模板为 Creton 实验室开发的 25ib，可应要求提供。应在 Excel 表格中构建显示各处理组的图表，并包含处理组与对照组之间比较的 t 检验结果。进一步的统计分析可使用 SPSS 完成。

结果

在我们早期的实验中，使用弹跳球作为厌恶刺激，未经处理的野生型幼鱼在受到移动球体刺激时会向孔板底部游动（回避行为）并向孔板边缘移动（接触趋向行为）¹⁵。我们随后证实，在该实验中，接触趋向行为可作为斑马鱼幼鱼焦虑相关行为的指标¹⁷。与空白白色背景相比，幼鱼在远离球体运动以及对边缘区域的偏好方面表现出显著差异。这些行为在我们新建立的移动红条实验中也得到了验证，且表现更为显著¹⁶。此外，我们现在可在单次实验中检测更多种类的行为，包括游泳速度、静止时间、对孔板末端或侧边的偏好，以及个体鱼之间的距离（图5）。在卵水中培养的对照组幼鱼在受到厌恶刺激（移动红条）后，表现出更强的向孔板底部及通道边缘聚集的偏好。当幼鱼在含有1 μg/ml DMSO的卵水中培养时，也获得类似结果；DMSO是一种常用于溶解多种药物和毒物作为1,000倍储备液的溶剂。

代表性结果如图所示 图5 在用蛋水和DMSO（作为对照）以及不同浓度的有机磷农药处理的幼虫中，该有机磷农药常见于非有机食品。所示结果来自一次实验的取样。然而，重复实验表明，低浓度的有机磷农药会改变幼虫的游动速度和趋触行为，该浓度范围模拟了人类通过食物摄入的水平 ¹⁸.

图 1. 收集托盘。 使用玻璃Pyrex培养皿从成年斑马鱼养殖箱中收集胚胎。将Pyrex培养皿的盖子裁剪后嵌入塑料网格，并在塑料网格上缝上绿色纱线。通过模拟自然环境，为成年斑马鱼营造繁殖氛围。

图2. 塑料模具与琼脂糖加样孔。A) 左侧显示模具。将0.8%琼脂糖倒入单孔板中，待琼脂糖冷却后，缓慢插入模具，随后取出。B) 右侧板显示由塑料模具在琼脂糖中形成的加样孔。

图3. 成像柜。 成像柜由我们实验室专门搭建，用于高通量行为分析。一个1500万像素的数码相机安装在柜子顶部，镜头朝下，用于采集放置在笔记本电脑屏幕上的多通道培养板中幼虫的时间推移图像。在培养板与屏幕之间有一块塑料漫射器，用于防止采集的图像中出现莫尔条纹。

图 4. 空白背景与 PowerPoint 厌恶刺激。 此为当前用于诱发斑马鱼幼体行为变化的 PowerPoint 图像。它在 A) 空白背景与 B) 移动的红色条形之间产生显著的行为差异。

讨论

尽管我们仍在持续改进这种新型的行为检测方法，但它始终可用于检测斑马鱼幼鱼的回避行为和趋触性行为¹⁵。我们已开展多次试验以优化该检测的结果，例如所用刺激的颜色、每条通道中幼鱼的理想数量以及行为检测的持续时间。此前，我们使用多孔板（6孔或12孔）进行实验^15,17,18。然而，最近我们设计了一种新型通道模具，为幼鱼提供了更大的游泳空间，从而能够在单次检测中获取更多的行为数据¹⁶（图5）。其他改进还包括所用PowerPoint演示内容的变化（如调整运动方式或检测时长）以及通道尺寸的调整（我们也制备了适用于更窄通道的模具）。

目前，该高通量自动化系统在同时测量斑马鱼幼鱼多种行为方面具有独特优势，例如在多通道孔板中测量运动速度、避让行为、与其他幼鱼的接近程度以及趋触性等。系统可在成像的同时快速获得结果，并对大量幼鱼进行分析。该系统的构建成本低廉，安装快速且操作简便。该系统的一个局限性在于无法评估斑马鱼幼鱼的三维运动。能够追踪成年斑马鱼的自动化系统具备三维检测能力，可识别更广泛的行为，例如在水体中上下移动的行为^10,19。另一个局限性是，我们的成像系统目前尚未针对视频速度下的高通量分析进行优化。虽然通过将相机设置为较低分辨率可实现视频速度成像¹⁵，但这会将分析限制在单个孔板上。

使用新创建的“泳道”方法时，实验的多个步骤必须精确操作。将幼虫放入泳道时，必须确保液体量非常少，直到将培养板放置在笔记本电脑屏幕上方。如果泳道中液体过多，幼虫会逃逸至培养板的边缘区域。此外，将模具插入琼脂糖时，必须缓慢地降低模具。如果插入速度过快，琼脂糖中会产生气泡，并被Image J宏识别为额外的幼虫。建议即使琼脂糖泳道中仅存在少量气泡，也最好重新制备新的泳道。

未来，我们希望优化行为检测方法，以分析斑马鱼幼鱼的其他复杂行为，例如学习能力，并研究早期发育阶段暴露于有毒物质和药物对学习能力的影响。目前，我们正在开发可用于分析学习行为的检测方法，其行为结果可能有助于确定特定有毒物质或药物在发育过程中影响了哪些脑区。已有研究开发出用于测量斑马鱼幼鱼学习行为的自动化检测方法²⁰，这些检测方法可通过多通道培养板中的强效回避反应，进一步改进用于高通量筛选。

我们建议，该行为检测方法可在未来的研究中用于测试大量药物和有毒物质对发育的影响。此类研究将提供有关特定风险因素的大量信息，并有助于为孕妇和儿童制定更完善的健康与安全指南。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
Instant Ocean	That Pet Place	198262
琼脂糖	Fisher	BP1356-100
亚甲蓝	那家宠物店	214325
<强>仪器设备
一块六孔板	Fisher	12-565-493
数码相机	佳能	EOS Rebel T1i
成像柜	木工塔楼
笔记本电脑	宏碁 非凡	只要具有15.6英寸LCD屏幕、1366 x 768像素分辨率和220 cd/m²亮度，任何型号均可2.
相机镜头	佳能	EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS 变焦镜头
塑料扩散器	Pendaflex	52345
<强>软件
PowerPoint 2010	微软
ImageJ	美国国立卫生研究院		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010	微软
统计软件	SPSS 20