建立一个 体外 用于研究细胞内行为的系统 白色念珠菌 在人THP-1巨噬细胞中

摘要

本文概述了一种建立 体外 用于研究兼性胞内人类真菌病原体相互作用的细胞培养模型系统 Candida glabrata 与人类巨噬细胞共同作用，这将成为推进我们对真菌毒力机制认知的有力工具。

摘要

一种细胞培养模型系统，若能高度模拟宿主的环境条件，则可作为研究微生物病原体感染特定步骤的廉价、可重复且易于操作的动物模型替代方案。人单核细胞系 THP-1 在佛波酯处理后可分化为巨噬细胞，此前已被广泛用于研究多种胞内病原体的致病机制，包括 结核分枝杆菌 在此，我们讨论一种实施的方案 体外 使用 THP-1 巨噬细胞建立细胞培养模型系统以阐明一种机会性人类酵母病原体的相互作用 白色念珠菌 与宿主吞噬细胞共培养。该模型系统操作简便、快速，适用于高通量突变体筛选，且无需复杂仪器设备。典型的THP-1巨噬细胞感染实验约需24小时，随后需额外24–48小时使回收的胞内酵母在富营养培养基上生长，以进行基于菌落形成单位的活力分析。与其他 体外 模型系统的一个可能局限性在于，难以将所获得的结果外推至人体宿主内高度复杂的免疫细胞调控网络。然而，尽管存在这一局限，本实验方案对于阐明真菌病原体可能采用的逃逸或对抗宿主抗菌反应并在免疫细胞内营养匮乏环境中存活、适应及增殖的策略仍具有重要价值。

引言

念珠菌属是免疫功能低下患者发生危及生命的侵袭性真菌感染的首要原因¹。Candida glabrata是一种新出现的医院内病原体，根据地理区域的不同，它是重症监护病房患者中第二或第三常见分离的念珠菌种^1-3。从系统发育关系来看，C. glabrata是一种单倍体出芽酵母，与非致病性的模式酵母Saccharomyces cerevisiae的亲缘关系比包括C. albicans在内的致病性念珠菌spp.更为接近⁴。与此一致的是，C. glabrata缺乏一些关键的真菌毒力特征，包括交配能力、分泌性蛋白水解活性以及形态可塑性^4-5。

尽管C. glabrata不形成菌丝，但它能够在小鼠和人类巨噬细胞内存活并复制^6-8，这表明其已进化出独特的致病机制。目前关于C. glabrata如何在营养匮乏的巨噬细胞内环境中存活，并抵抗宿主免疫细胞所启动的氧化性和非氧化性宿主反应的策略，相关信息仍然有限⁵。建立一个合适的巨噬细胞模型系统，是通过功能基因组学和蛋白质组学方法阐明C. glabrata与宿主吞噬细胞相互作用的前提。既往研究曾使用人源外周血单个核细胞（PBMCs）和小鼠源骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）来研究C. glabrata与宿主免疫细胞的相互作用^7,9。然而，PBMCs和BMDMs的获取困难、寿命有限以及不同哺乳动物供体之间的内在差异，限制了这些细胞作为通用模型系统的应用。

在此，我们介绍一种建立 体外 研究细胞内行为的系统 C. glabrata 人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞中的细胞。本方案的总体目标是建立一种简单、经济、快速且可重复的细胞培养模型系统，可方便地进行操作，以研究宿主与真菌病原体相互作用的不同方面。

THP-1 细胞此前已被用于解析宿主免疫系统对多种病原体（包括细菌、病毒和真菌）的免疫应答^10-12。单核细胞样 THP-1 细胞易于培养，经佛波酯处理后可分化为巨噬细胞，这些巨噬细胞模拟人源单核细胞分化的巨噬细胞，并表达相应的巨噬细胞标志物¹³。THP-1 巨噬细胞模型系统的主要优势在于操作简便，且无需复杂的仪器设备。

本文所述方案易于调整，可用于研究其他人类真菌病原体与宿主免疫细胞之间的相互作用。当前流程还可结合高通量突变体筛选，用于鉴定目标病原体的毒力因子。该概念验证的实例是成功利用THP-1细胞培养模型系统，鉴定出一组56个在人类巨噬细胞中维持C. glabrata存活所必需的基因⁸。

方案

建议在生物安全二级（BSL-2）防护级别的实验室中进行C. glabrata感染实验。

1. THP-1 巨噬细胞单层的制备。
2. C. glabrata 细胞悬液的制备。
3. 用 C. glabrata 细胞感染 THP-1 巨噬细胞。
4. 通过菌落形成单位实验测定吞噬率和细胞内复制情况。
5. 利用共聚焦激光扫描显微镜监测细胞内复制过程。

1. THP-1 巨噬细胞单层的制备

1. THP-1 是一种人单核细胞系，源自一名患有急性单核细胞白血病的1岁男童的外周血¹⁴. THP-1 是一种悬浮细胞系，通常在 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中培养₂ 在添加了10% FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基中。使用佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA，一种佛波酯）处理可诱导THP-1单核细胞终末分化为巨噬细胞。重要的是，PMA处理不影响细胞活力，且分化后的细胞不再分裂。
2. 种子大约 1.5 x 10⁶ RPMI-1640 完全培养基中 100 mm 培养皿内的 THP-1 单核细胞（RPMI-1640 培养基添加 10% 血清、2 mM 谷氨酰胺和 1x） 抗生素；10 ml/皿），于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂ 2天。
3. 当 THP-1 细胞密度达到 8 x 10⁵ 细胞/ml，将培养皿转移至细胞培养超净台中，轻轻摇晃以重悬已沉降的细胞。
4. 用移液器将细胞悬液移出，放入15 ml离心管中 无菌管中以1,000 rpm（130 × g）离心4分钟。弃去上清液，将THP-1细胞沉淀重悬于5 ml 新鲜的、预温的 RPMI-1640 完全培养基。
5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞悬液稀释至终密度为10⁶ 细胞/毫升 用预热的 RPMI-1640 完全培养基
6. 加入 1 µl 160 mM PMA 储存液（用二甲基亚砜配制的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯溶液）至 10 ml THP-1 细胞悬液（终浓度 16 nM），充分混匀，分装 1 ml 将细胞悬液加入24孔组织培养板的每孔中，并将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。₂ 12 小时。
7. 移除旧培养基，加入 1 ml 预热的 RPMI-1640 完全培养基，于 37°C、5% CO₂ 条件下培养 12 小时以恢复细胞₂.
8. 在倒置显微镜下观察细胞，以确认悬浮状态的卵圆形THP-1单核细胞已分化为扁平、梭形并贴壁生长的细胞  巨噬细胞。这些已分化的细胞现已可用于实验 C. glabrata 感染研究。

2. C. glabrata 细胞悬液的制备

C. glabrata 野生型菌株Bg2将用于感染THP-1巨噬细胞。C. glabrata 细胞常规在液体YPD（酵母提取物（1%）-蛋白胨（2%）-葡萄糖（2%））培养基中培养。固体YPD培养基则通过在培养基高压灭菌前加入2%琼脂制备而成。

1. 准备C. glabrata培养物时，用无菌一次性接种环从琼脂平板上挑取单个菌落，接种于10 ml YPD 液体培养基中，在30 °C条件下振荡培养14–16小时（200 rpm）。
2. 取1 ml上述培养物，在台式微量离心机中以4,000 rpm（1,800 ×g）离心5分钟，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）洗涤细胞三次，并将细胞沉淀重悬于1 ml PBS中。
3. 测定C. glabrata细胞悬液的OD₆₀₀，并用适量无菌PBS稀释，使细胞浓度达到2 × 10⁶个细胞/ml （OD₆₀₀ = 0.1）。或者，也可使用血细胞计数板计数酵母细胞，以获得所需细胞密度。

3. 用C. glabrata 细胞感染THP-1巨噬细胞

1. 取 50 µl C. glabrata 细胞悬液加入 THP-1 巨噬细胞（每孔接种 10⁶ 个细胞于 24 孔培养板中），使感染复数（MOI）为 0.1，并将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。
2. 为测定活酵母数量，将 50 μl C. glabrata 细胞悬液用无菌 PBS 稀释 100 倍，取 100 μl 涂布于 YPD 固体培养基上。将平板在 30 °C 下孵育 1–2 天，人工计数出现的酵母菌落数量。此后，这些数值将被称为 0 小时 C. glabrata 菌落形成单位（CFUs）。
3. THP-1 细胞与 C. glabrata 细胞共培养 2 小时后，将 24 孔组织培养板倒置于储液槽中弃去培养基，并用预热的无菌 PBS 轻柔洗涤三次，以去除未被吞噬的胞外 C. glabrata 细胞。用 PBS 进行轻柔洗涤至关重要，必须彻底清除所有胞外酵母，同时不损伤 THP-1 巨噬细胞单层。

通过菌落形成单位实验测定吞噬速率和细胞内复制

1. 裂解 C. glabrata 1 ml 感染的 THP-1 巨噬细胞 无菌 H₂O 孵育 2 分钟，轻轻刮擦以去除孔中的巨噬细胞碎片，并将细胞裂解液收集至微量离心管中。显微镜下验证巨噬细胞完全裂解对于回收所有内化酵母至关重要。
2. 将裂解液用无菌PBS稀释100倍，取100 μl涂布于YPD固体培养基上，30 °C培养平板。
3. 1-2天后，人工计数数量 C. glabrata 在YPD培养基上出现的菌落，乘以稀释倍数（2小时CFU），并计算吞噬率，即指百分比的吞噬作用 C. glabrata THP-1 巨噬细胞在共孵育 2 小时后吞噬的细胞  使用以下公式。
                          % 吞噬作用 = [（2 h 时的菌落形成单位）/（0 h 时的菌落形成单位）] × 100
4. 测量细胞内复制速率 C. glabrata 在THP-1巨噬细胞中，于感染后不同时间点收集细胞内酵母 即. 4、6、8、10、12 和 24 小时，通过重复步骤 3.3–4.3。
5. 计算存活/复制倍数 C. glabrata 通过将任意时间点的总菌落形成单位（CFUs）除以2小时时间点的菌落形成单位（即被吞噬的酵母）来计算THP-1巨噬细胞内的菌落形成单位。

5. 使用共聚焦激光扫描显微镜监测细胞内复制

1. 按照第1节所述步骤，接种经PMA处理的5 x 10⁵ 将THP-1细胞接种至两片四孔细胞培养板的每孔中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 12 小时。
2. 更换为预热的RPMI-1640完全培养基，使细胞从PMA处理中恢复12小时。
3. 制备GFP（绿色荧光蛋白）标记的 C. glabrata 细胞悬液，如第2节所述，并以感染复数（MOI）为1的条件感染THP-1巨噬细胞 C. glabrata 表达GFP的菌株不可用时，可用FITC（异硫氰酸荧光素）标记酵母细胞  可用于监测感染后的早期事件 即. 吞噬率及2小时时相的吞噬溶酶体成熟情况
4. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育载玻片 2 小时₂，小心倒置以弃去培养基，并用无菌预热的PBS洗涤3次。
5. 向一张载玻片的每个腔室中加入 500 µl 预热的 RPMI-1640 完全培养基，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 22 小时。
6. 固定2小时 C. glabrata-感染的 THP-1 巨噬细胞中，向另一张载玻片的每个孔中加入 500 µl 用 PBS 配制的 3.7% 多聚甲醛，在室温避光孵育 20 分钟。
7. 用 PBS 清洗载玻片三次，加入 500 µl Triton-X（0.7%），室温避光孵育 5 分钟.
8. 用 PBS 洗涤载玻片 3 次，从培养载玻片上取下腔室，并在避光条件下静置干燥 3–5 分钟。
9. 使用含DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的Vectashield封片剂，小心地将盖玻片封于载玻片上，避免产生气泡。用擦镜纸轻轻吸去多余液体，并用指甲油密封盖玻片边缘。将载玻片置于4°C避光保存，直至使用。
10. 重复步骤 5.4 和 5.6–5.9，处理感染后 24 小时的 THP-1 细胞。
11. 使用激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像（60倍油镜，DAPI 和 GFP 染色的激发波长分别为 405 nm 和 488 nm）。

结果

对经PMA处理的THP-1巨噬细胞感染分析显示，与C. glabrata野生型（wt）细胞共孵育2小时后，巨噬细胞对wt细胞的吞噬率为55–65%。此外，C. glabrata细胞能够在THP-1巨噬细胞中抵抗杀伤作用，并在与THP-1巨噬细胞共培养24小时后，菌落形成单位（CFU）显著增加5至7倍⁸。通过共聚焦荧光显微镜也验证了携带GFP表达质粒的野生型细胞在THP-1巨噬细胞内的胞内复制：在24小时期间，每个THP-1巨噬细胞内的酵母细胞数量从一至两个增加至七至十二个（图1）。

讨论

先天免疫系统在控制机会性真菌感染中发挥重要作用。巨噬细胞通过吞噬和杀灭真菌病原体参与抗真菌防御。因此，阐明真菌存活所需或拮抗巨噬细胞抗菌功能的相关因子，将有助于深入理解真菌的毒力策略。在此背景下，我们建立了一种 体外 使用源自人单核细胞系 THP-1 的巨噬细胞构建的细胞培养模型系统，用于表征人机会性真菌病原体的相互作用 C. glabrata 与宿主吞噬细胞相互作用。尽管该THP-1巨噬细胞模型系统已成功用于鉴定 C. glabrata 存活率降低且在小鼠系统性念珠菌病模型中表现出毒力减弱的突变株⁸该系统的一个可能局限性在于其孤立的环境，因此所得结果可能并不总是适用于复杂的哺乳动物宿主免疫系统。此外，与活细胞成像方法不同，该系统无法计入那些未被THP1-巨噬细胞吞噬或在吞噬过程中被杀灭的酵母细胞。

本实验方案的重要性在于其操作简便、可重复性强且具有可扩展性。该方法可缩小至96孔板，也可放大至150 cm²的组织培养瓶。本方案中的关键步骤包括选择合适的感染复数（MOI）、进行充分的PB...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	人急性单核细胞白血病细胞系
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	用于维持 THP-1 细胞生长
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate）	Sigma-Aldrich	P 8139	注意：具有危害性
YPD	BD-Difco	242710	用于培养Candida glabrata细胞
甲醛（Formaldehyde）	Sigma-Aldrich	F8775	用于固定C. glabrata感染的 THP-1 巨噬细胞
磷酸盐缓冲液（PBS）			洗涤用缓冲液（137 mM NaCl，10 mM 磷酸盐，2.7 mM KCl， pH 7.4）
氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）			洗涤用缓冲液（3 M NaCl，0.3 M 柠檬酸钠，20×浓度）
预杂交缓冲液			杂交用缓冲液（50% 甲酰胺，5× Denhardt’s 溶液，5× SSC，1% SDS）
VECTASHIELD 封片剂	Vector Labs	H-1200	用于共聚焦显微镜载片封片
32P 标记的 α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	用于特征标签的放射性标记
100 mm 组织培养皿	Corning	430167	用于培养 THP-1 细胞
24 孔组织培养板	Corning	3527	用于在 THP-1 巨噬细胞中进行C. glabrata感染实验
4 孔组织培养处理玻璃腔室载片	BD Falcon	REF354104	用于成像C. glabrata感染的 THP-1 巨噬细胞
血细胞计数板	Rohem India		用于细胞计数
台式微量离心机	Beckman Coulter	Microfuge 18	用于离心微管中的细胞
台式离心机	Remi	R-8C	用于离心 15 ml 管中的细胞
分光光度计	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	用于监测酵母细胞的吸光度
平板培养箱	Labtech	Refrigerated	用于培养C. glabrata细胞
摇床培养箱	New Brunswick	Innova 43	用于培养C. glabrata细胞
水套式 CO2 培养箱	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	用于培养 THP-1 细胞
共聚焦显微镜	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	用于观察C. glabrata感染的 THP-1 巨噬细胞
复式显微镜	Olympus	CKX 41	用于观察C. glabrata细胞和 THP-1 巨噬细胞
PCR 仪	BioRad	DNA Engine	用于从输入和输出基因组 DNA 中扩增独特标签
杂交炉	Labnet	Problot 12S	用于杂交
磷屏成像仪（PhosphorImager）	Fujifilm	FLA-9000	用于扫描杂交膜
恒温混匀仪	Eppendorf	Thermomixer Comfort	用于放射性标记特征标签的变性
凝胶成像系统	Alphainnontech	Alphaimager	用于观察琼脂糖凝胶中溴化乙锭染色的 DNA