计算机辅助多电极膜片钳系统

摘要

多电极膜片钳记录构成一个复杂的任务。这里，我们显示了如何通过许多的实验步骤的自动化，因此能够加速导致质的提高的性能和记录的数目的过程。

摘要

膜片钳技术是目前最行之有效的方法，用于记录电活动从单个神经元或他们的亚细胞区室。然而，实现稳定的记录，即使从单个细胞，仍具有相当复杂耗时的过程。在与高效率的信息显示结合多步骤的自动化可以极大地帮助实验者与更高的可靠性进行录音的数量较多，并在更短的时间。为了实现大规模的录音，我们得出的结论是最有效的方法是不完全使自动化过程，但为了简化实验步骤和减少人为错误的可能性，同时有效地掺入实验者的经验和视觉反馈。考虑到这些目标，我们开发了其中集中了所有必要的控制的多电极膜片钳实验中的单个接口，COMMERC计算机辅助系统ially可用的无线游戏手柄，在电脑屏幕上显示实验相关的信息和指导线索。在这里，我们描述系统使我们能够减少用于实现记录配置的时间，大幅增加成功记录大量的神经元同步的机会的不同组成部分。

引言

与微米精确记录和刺激多个站点的能力是通过实验获得更好地了解神经系统非常有用。许多技术已被开发，为此，但没有允许通过膜片钳技术，对于研究的亚阈值的活性和个体的突触后电位所必需的submillivolt分辨率实现的。这里我们介绍一个12 - 电极计算机辅助膜片钳系统旨在同时记录和刺激大量单个细胞以足够的精度对神经元连接的研究的发展。而许多其它应用中，可以设想这样一个系统，它本身特别好到的突触连接的研究考虑到在一组神经元的可能的连接的数量成比例地增大到所讨论的神经元的数量的平方。因此，在具有三个电极的系统允许测试发生多达六个连接和最经常记录单1，记录12的神经元可以检测多达132连接的发生，经常观察超过一打（ 图1）。几十个连接的观测同时使得能够分析小型网络的组织和推断出网络结构的统计特性不能被探测否则为^1。此外，许多细胞的精确刺激也允许招募突触后细胞²的定量。

方案

1。设备准备

1. 从电脑控制机械手
   1. 通过串口（RS-232）每个微操作控制盒连接到电脑。
   2. 实施命令进行定位，查询和调整设置通过串口发送。考虑到速度和硬件兼容性问题的C / C + +被推荐为编程语言。
   3. 标准化的操纵器的基准系统，以使零是相对于所述电动机和积极运动从马达引导离开最接近的可能位置。
   4. 定位显微镜在其中央位置2毫米以上的标本焦平面（坐标[0，0，2000]）。
   5. 存储，每个操纵器，该局部坐标系，使在视显微镜领域的中心到被观察的移液管的尖端。这是对每个电极的初始参考点。
2. Visua丽泽电极的位置。能够在实验中要跟踪的每个电极的位置是非常有用的。图形表示是解决这个问题的最直观的方法。为此各电极和参考的系统，在显微镜的必须匹配。做到这一点的简单方法是:
   1. 把一个电极的前端到所述视场的中心。
   2. 存储在机械手的各轴的位置和显微镜的各轴。
   3. 执行与该机械手相对大的运动（1毫米）的x轴。
   4. 找到一次只移动显微镜的尖端。
   5. 计算在显微镜位置的差异，因为它是最后一次测量。这些都是在电极轴运动到显微镜轴上的投影。
   6. 为Y和电极操纵器的Z轴上2.5 - 重复步骤2.3。这使得投影矩阵到显微镜轴来确定（图2），也称为余弦矩阵:
      
   7. 反转这个矩阵，使其能够计算运动，在三维空间中，以达到在显微镜坐标系统中的给定位置所必需的电极操纵器:
      
   8. 使用初始基准点和余弦矩阵确定在显微镜各电极的位置坐标。
   9. 显示图形的基础上，在显微镜坐标，每个电极的定期的位置。我们选择使用的C / C + +的绘图库（GDI +）来绘制电极位置每隔40毫秒。
   10. 重复步骤1.2.1 - 1.2.7每个机械手的角度被改变，或者如果需要几毫米的位置变化时，例如，当电极的类型而改变。
3. 使存储positio的相关特征纳秒的组织，如细胞或解剖参考点，在显微镜坐标。
4. 获取视频和覆盖相关的信息。
   1. 机械地对准显微镜的运动的x-轴与显微镜照相机的水平轴。
   2. 在计算机上安装有视频直播和覆盖能力和软件开发工具包（SDK）图像采集卡。
   3. 实施实时视频显示操作的SDK。
   4. 转换显微镜的坐标系统到摄像机参考系统通过适当的平移和缩放。
   5. 绘制有关的功能中的实时视频所产生的图像以大约40毫秒（ 图3）定期照相机坐标和覆盖。
5. 控制放大器。
   1. 使用放大器的软件来控制从接口放大器设置。
6. 合作ntrol示波器。
   1. 使用串行端口的示波器连接到PC。
   2. 确定示波器规模，耦合和时间分辨率在电压钳的不同步骤的膜片钳程序（ 如电极的浴室，封口平整，全细胞配置）和电流钳。
   3. 发送相应的示波器设置命令时放大器的命令是从接口发出。
7. 控制吸管的压力。
   1. 根据图4的组合的压力控制系统。
      1. 使用12 V / 5 V电源适当地供给各电子元件。
      2. 一膜泵的输出连接到正压缓冲液（100毫升的容器）。
      3. 一个膜泵的输入端连接到负压缓冲液（100毫升容器）。
      4. 移液器支架管连接在pressu压力传感器重新控制系统和气动阀连接到主压力舱。
      5. 各压力缓冲器的连接连接到主压力室的阀。
      6. 连接主压力室与大气之间的阀。
      7. 压力传感器连接到主压力舱。
      8. 压力传感器连接到每个缓冲区。
      9. 压力控制系统连接到数据采集板。
      10. 每个压力传感器连接到一个模拟输入。
      11. 每个阀门连接到数字输出。
   2. 去除大气压力打开所有阀门除了那些连接到隔膜泵和减去测得的压力来自所有传感器的偏移。
   3. 实现压力控制
      1. 在接口定义控件激活或去激活每个移液器正压控制。
      2. 定义吸管最小正压的S约70毫巴。
      3. 定期（每0.5秒）检测时主动下压控制在吸液管压力低于设定的阈值。
      4. 当阈值交叉打开正压缓冲到主压舱和车厢这对有问题的吸管在短暂的周期（20毫秒），直到吸液管压力高于阈值。关闭所有其它阀门。
      5. 去激活更多的压力控制，对目标细胞的最终办法启动。
   4. 应用负压密封形成
      1. 关闭所有阀门，并打开向主压舱和车厢这对吸管有问题的实验者需要通过保持按下按钮期间负压缓冲阀。
8. 命令集中到一个人机接口设备。
   1. 连接市售wireleSS手柄到PC。
   2. 实施操纵杆状态读数。例如，使用DirectX库的C / C + +来进行读数，每5毫秒。
   3. 与以前的状态比较当前状态，以检测哪些按钮已被按下，释放或保持按下自最后一次一步。
   4. 在手柄的功能分配到每个按钮。这种映射的一个例子示于图5。

2。膜片钳程序

1. 制备所关注的区域的脑切片。
2. 放置的兴趣的脑切片，用在显微镜的位移范围的中心感兴趣区域。
3. 小区选择
   1. 通过浏览与显微镜识别感兴趣的细胞。存储单元的基础上，显微镜坐标系的位置与右上关注单元的顶部的实况视频显示器上的鼠标点击。
   图形化界面将显示选定的单元格，以及将微量的全球概览和软件将添加一个标记上，将要在图像上叠加的单元格位置。此外，该单元的图像在文件'细胞＃。JPG"捕获以供将来参考。

细胞的归属地移液器

1. 选择感兴趣的细胞后，分配哪些吸管将记录每一个细胞。图形化界面提供了应设置的分配控制。通过选择复选框"显示最终位置"可视化的最终配置的预览。
2. 选择它的最终位置预览期望或检查的"全选"复选框，每个吸管。如果需要禁用当前位置显示为更好的显示效果。

准备移液器

1. 填写移液器（6 - 8MΩ通常是最好的，如果很多移液器使用）无线TH细胞内的解决方案并将它们加载到其持有人。放置的探头在他们的注视，但不滑动他们前进，避免接触浴枪头。
2. 使正压控制和选择所有移液管，以确保提示将保持清洁。轻轻滑入到位每个探头。

定位移液器吸头

1. 显微镜定位与聚焦3毫米薄片按按钮R2固定按钮"A"，而上面的中心位置。使用相应的位置上的每个机械手按下按钮，L2为存储从以前的实验中同时按住按钮A。
   注:在这一点上应该有一个吸管鉴于无论是独特的阴影或沿吸管的轴的小运动应该足以观察它在大多数情况下。补偿在吸管的形状略有不同，必须手动执行。
2. 把枪头成焦点。将吸头在视频显示的红色圆点中央，而无需移动显微镜（它应该仍然是在位置[0，0，2000]）。
3. 通知移液器是在显示器的中心按下按钮z按住按钮C之后每个移液器吸头所在的软件，发送吸管向后，使下面的人能够同时按住按钮A位于按L1键

走近细胞

1. 一旦所有的枪头已精确定位，每个吸管被归结为一个单元格，自动定位接近各自细胞的移液管。只需右键单击该组细胞的中心，并选择弹出菜单上的选项'集群'。上会出现，选择所有你想要在这个时候定位移液器，点击'去了所有检查移液器'群集选项窗口。重复此操作所关注的细胞的每个集群。
2. PE手动rform最后的办法。相对于细胞的吸移管的位置可以被指定不同的，但通常是简单地200μm的距离的移液管和200μm的上方在垂直方向上，这是足以使移液管的尖端的组织以外的轴的小区。等到移液器的定位完成后，按R1键同时按住按钮C移动显微镜对吸管
3. 通过随时随地聚焦显微镜在其尖端的视频显示，然后按B键同时按住按钮C.一个正方形网格重新校准每个吸管的位置应该短暂地出现，指示移液管的位置确定。如果位置不正确，定位针尖上的视频显示，然后按下按钮z的中央点的同时按住按钮C。

建立细胞连接配置

1. 确认的利息为当前移液器细胞是正确的标记。否则，将显微镜的利益与中央红点的单元格相匹配。马克按下按钮Ÿ同时按住按钮C.按L2键同时按住按钮C定位吸管200微米远离其指定单元格的单元格，在显微镜会自动移动到相应的位置。
2. 调整吸管位置，它的红点相匹配。调整吸管按R1键同时按住按钮十偏移
3. 按L1键同时按住按钮十，慢慢地接近移液器其归因细胞激活测试脉冲。
4. 在观察细胞的膜表面上的凹坑的形成施加的负压的简要脉冲通过按下按钮Ÿ同时按住按钮Z到允许所施加的压力，以达到细胞。约-65mV的钳制电位应该在这一点上按下按钮，L2按住按钮成立十

全细胞构

1. 一旦一个千兆密封形成为每个小区，开始通过施加负压力破裂的膜。

进行录音

1. 使用刺激/采集系统来执行你的录音。应用脉冲或在一个单独的细胞的脉冲串的时间和观察剩余的细胞反应来映射记录细胞间的连接。

退去移液器

1. 一旦录音完成后，退去吸管慢慢地从组织通过右键单击该表单选按钮。选择"退去 - >移液器500μm的'有退去的移液管沿其轴线不远。观察漂移的细胞电位（通过应用一些正压清除提示可帮助）。
2. 退去移液器所有回来的路上，设置定位速度，以'快'，并重复相同的操作，但选择了"全部"选项。卸下用过的移液器轻轻滑出的探头和旋从人的移液管。为了避免扭曲持有人在各自的插槽中，因为这可能会极大地与枪头位置妨碍它是有用的。

结果

按照以上描述的方法，我们成功地同时进行多达12神经元的全细胞记录，几乎增加一倍的最大数目的神经元同时膜片钳制迄今。记录大鼠的躯体感觉皮层V层锥体神经元之间的直接的突触连接的网络的例子示于图6。

的连接概率访问，作为对于给定的细胞类型间体的距离的函数的确定为感兴趣的典型的测量，可以有效地与多电极膜片钳系统¹来进行。最近的照片刺激开始出现作为一个更有效的方式获得这些数据^3,4。重要的，但是，与多电极膜片钳系统获得的数据允许实验者获取所研究的网络的更完整的映射，以及高分辨率的染色用帧内细胞扩散染料。在多电极的膜片钳实验的每一个细胞都可以被记录和刺激，这常常是不与如光刺激或钙成像的其它技术的情况。此功能可让实验者跟踪偏差的连通性，如发生率高相互连接，不能进行测量，否则。通过刺激和记录每一个神经元的研究，我们发现，神经元不仅是偏向被相互连接，也形成集群。我们的录音的规模也使我们观察到一个更高的连接概率存在对神经元共同的邻居， 也就是被两个同时连接到采样网络（ 图7a）

讨论

一个直接的问题，通常发生关于我们描述的过程的成功率。对于高成功率的准备是必不可少的。移液器必须有尖端的孔，它们足以记录细胞生物。过滤该溶液内，以避免堵塞移液器也是重要的。非常干净的，新鲜的拉移液管是另一种要求。甲二项式分布，可用于理解这些问题如何影响最终产率的最简单的模型。它是合理的期望实验者有经验和适当的设备，以达到80％或以上的记录与视觉反馈的单个神经元中签率。初学者可以有望实现低得多的成功率，特别是如果重要的准备步骤被忽略。如何将这些翻译率在每个实验记录细胞的数量可以看出，在图10中 。同时在补丁蛤的数量进一步增加PED的神经元将可能需要操纵器的小型化和程序，而这又需要大量的关注细节的可靠性提高，而且是完全可行的。

这里介绍了系统的通用性仍在探索和新的应用经常被发现，特别是在细胞外信号和个别神经元活动⁷之间关系的探索。解剖学因素成为作为记录单元之间的距离增加更重要。然而，这个系统绝对可以让远程和层间连接的地方调查的连接保持不变下的切片过程。

微操作机器人控制

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Olympus	BX51WI	40X 浸没物
纵器	Luigs Neumann	SM-5	使用串行协议
放大器	Axon Instruments MultiClamp	700B	SDK 使用
相机	Till Photonics	VS 55	BNC 模拟输出
图像采集卡	数据转换	DT3120	SDK 使用
示波器	Tektronix	TDS 2014	串行通信
数据采集	InstruTECH	ITC 1600
数据采集	National Instruments	PCI-6221	库 二手 （.dll）
压力阀	SMC	SMC070C-6BG-32
压力传感器	霍尼韦尔	24PCDFA6G
膜片泵	Schego	Optimal