在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量

Summary

基于流式细胞术和显微术的两个互补的方法给出，使定量基因表达的诱导通过MAPK途径在酵母的激活的动力学，在单细胞水平。

Abstract

基因表达在单细胞水平进行定量揭示了掩盖在在群体水平上进行测量，新的监管机制。基于显微镜和流式细胞仪两种方法都表现出这样的数据怎么可以被收购。荧光报道诱导活化时的高渗透压甘油MAPK途径在酵母中的表达被用来作为一个例子。每种方法的具体优点突出。流式细胞术测量大量细胞（10,000），并提供了直接的措施独立的荧光蛋白的慢动力学成熟的蛋白表达的动力学。通过显微镜活细胞成像是通过对比限于记者在较少的细胞的成熟形式的测量。然而，通过这种技术产生的数据集可以是非常丰富得益于多个记者的组合，以及在空间和时间信息从单个细胞中获得。这两种测量方法的结合，可以通过信号传导通路兑现蛋白表达的调控新的见解。

Introduction

通过转导级联信号常常达到高潮蛋白的表达。这种表达谱中的表征对于理解生物学途径的功能的关键因素。上调的蛋白及其活化的动态频谱的识别可以通过例如微阵列，RNA印迹或蛋白质印迹^1-3的各种技术来实现。然而，这些技术平均细胞的全体人民的响应。了解蛋白质的表达的精细调节，理想的是收集的测量在单细胞水平。理想情况下，这些测量还应提供定量数据服从发展的基本途径的数学模型。

显微镜和流式细胞仪两种技术，这是非常适合提供这样的定量单细胞测量。蛋白质与荧光蛋白质的内源性标记可以bÉ用来量化其⁴表达水平。然而，由于在该蛋白质的末端增加了一个大的荧光部分可以使其不起作用的，它往往是更可取的，以产生根据一个启动子驱动的荧光构建体的表达特异性表达记者。此报告蛋白是外生给蜂窝系统，因此不影响正在发生在细胞内信号转导事件。

既显微镜和流式细胞仪已经被广泛应用于酵母的信令字段。作为例子;科尔曼-雷纳和同事相关的，在单个细胞中，配合特定的和组成性表达，记者通过显微镜来量化在酵母交配信号转导级联⁵的噪声的表达，阿贾尔和使用流式细胞仪来研究调控网络的同事控制的GAL基因⁶的表达。在先前的研究^7，我们已经使用了一个化合物-关于这两种技术从高渗透压甘油（HOG）途径在芽殖酵母研究的表达输出。这有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径是由超渗透胁迫触发。它导致MAPK Hog1，这转位到细胞的核的活化，诱导产生大约300个基因的表达的转录程序。为了研究这个过程，我们设计了一个基于该STL1启动子（响应Hog1活动⁸特异性诱导基因）驾驶一辆四金星荧光蛋白（P STL1-QV）的表达表达记者。流式细胞术测量露天细胞的两个群体的存在下，在中间应力水平（0.1M NaCl）中以表达荧光报道人口的一小部分。我们用显微镜来进一步研究这个问题，并发现这种噪声的蛋白质表达，内在因素⁹管辖。我们凑LD进一步观察到细胞Hog1活动的一个类似的水平可能显示明显不同的表达效果。这两种技术的结合允许我们来演示如何的应激反应基因的慢重塑的影响表达产物在单细胞水平^7。

在本文中，我们使用p STL1-QV记者通过超渗透休克诱导如通过显微镜蛋白表达的定量的一个例子中的表达和流式细胞术。一脉相承受到0.2M的NaCl胁迫，研究了这两种技术。这将允许我们强调在这两个高度互补的技术，一些关键的差别。

Protocol

1。显微镜测量

1. 接种5毫升合成培养基中的酵母。
2. 细胞生长于30℃过夜。
3. 测量过夜培养物的OD _600，第二天早上。
4. 稀释过夜培养在5毫升合成培养基，以OD ₆₀₀ 0.05。
5. 生长的稀释的培养在30℃下为至少4小时。
6. 制备3倍浓缩在合成培养基（0.6 M）的NaCl溶液。
7. 准备1毫克/毫升的溶液刀豆蛋白A（刀豆）的PBS中。
8. 滤液〜200微升的溶液刀豆入井幻灯片。
9. 静置30分钟。
10. 删除刀豆解决方案。
11. 加入150μlH _{2 O}至井。
12. 除去H ₂ O
13. 测量细胞培养的外径_600。
14. 在1.5ml微管中制备300μl的细胞培养物在OD ₆₀₀ = 0.02。
15. 超声处理水浴中45秒的单元格。
16. 涡简要英里crotube。
17. 超声处理水浴中45秒的单元格。
18. 短暂涡旋微管。
19. 加入200μl细胞培养的好。
20. 等待30分钟，以让细胞沉降到井的底部。
21. 放置在显微镜的良好滑动。
22. 选择照明设置的荧光信道进行记录。
23. 选择两个亮场图像的照明设置（一个关注的焦点:3微米以下的焦平面以允许细胞的适当分割）。
24. 选择的时间间隔的延时测量
25. 选择视图图像的字段。
26. 开始采集数帧。
27. 暂停收购以添加100微升0.6 M氯化钠介质。
28. 恢复成像。

2。流式细胞仪测量

1. 接种5毫升合成培养基中的酵母。
2. 生长于30℃过夜。
3. 措施外径₆₀₀过夜培养的第二天早晨。
4. 稀释过夜培养在5毫升合成培养基，以OD ₆₀₀ 0.1。
5. 生长在30℃至少4小时到达外径₆₀₀ 0.2-0.4。
6. 准备在H ₂ O放线菌酮溶液1毫克/毫升
7. 制备3倍浓缩在合成培养基（0.6 M）的NaCl溶液。
8. 制备1 1.5mL微管加入100μl的0.6M的NaCl的培养基中对每个时间点进行测量。
9. 在时间0，加入200μl细胞培养到每个微管。
10. 孵育振荡在30℃下
11. 在时间T，加入30微升放线菌酮的微管。
12. 对于所有想要的时间点重复步骤2.11。
13. 所有孵育微管至少45分钟，最多3个小时，在30℃振荡。
14. 准备FACS管400微升PBS。
15. 超声处理的细胞在水浴中1分钟。
16. 短暂涡旋微管。
17. 儿子icate细胞在水浴中放置1分钟。
18. 短暂涡旋微管。
19. 加入100μl细胞培养在每个微管到其相应的FACS管。
20. 选择488 nm激发激光和三十〇分之五百三nm的带通滤波器进行检测。
21. 测试非表达，充分表达样品，以确认他们是否落在探测器的灵敏度范围。
22. 测量10,000个细胞的每个样品。

Results

显微镜

酵母细胞轴承表达式记者p STL1-QV（ySP9 ^7）被附连到良好的滑动件的底部并在显微镜下放置。将细胞通过加入应力介质的成像会话的过程中刺激直接进入井。这使我们能够通路诱导前获得细胞的一些图片，并按照他们的命运刺激后。在本案中，随访细胞为〜2小时，以10分钟的时间间隔。 图1A是诱导和图1B前非荧光的细胞的图像显示2小时后的应力相同的细胞时，表达报道有被诱导，并已成为荧光。

以提取存在于这些图像的量化信息，一个复杂的图像分析处理，必须执行。它包括细胞的分割到第i定义对象法师，这些对象的跟踪从一帧到下一帧，并为这些对象（形状和强度特性）的特征的测量。我们已经开发了一个名为YeastQuant自己的平台来进行这种分析^10。其他一些非商业软件可用来执行这些任务。CellProfiler ^{11，CELLID 12}或CellX ¹³ 图1C

Discussion

显微镜

井经ConA的治疗是一个重要的步骤，以确保电池的正确成像。因为刀豆具有低溶解度的在PBS中的（5毫克/毫升）中，过滤过程可以去除大的聚集体存在于未过滤溶液，并干扰成像。细胞相对强烈地附着到被处理的表面和在加入诱导溶液不应妨碍细胞的定位，从而允许连续跟踪之前和之后的刺激。这个处理也可以应用到流动通道或微流体装置进行的细胞进行的恒定流量^7,15。如果油井是不正确的处理后用水冲洗，将细胞将不能正确附着在玻璃，大概是因为在ConA的溶液直接结合到细胞中，并防止它们形成在玻璃表面上的强粘合。在洗涤步骤之后，该井可保持干燥3 -在加入细胞前4小时，而不影响显着的细胞至玻璃的结合。

的曝光时间的荧光信道的选择是用于实验的成功的一个关键的设置。由于细胞的荧光将在整个时间推移增加，测试事先与诱导样品是什么，可以用来避免在采集过程中的图像的饱和度的最大曝光时间是很重要的。另一个参数选择曝光时间时要考虑到的是荧光信号的漂白。对于每个样品，就必须找到信号的图像和退化的亮度之间的权衡，由于漂白时间推移过程中。每个采集之间的时间间...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
酵母氮基	用于中	CYN6202
CSM氨基酸混合物	用于中	DCS0011
伴刀豆球蛋白A	GE医疗保健	17-0450-01
放线菌酮	Fluka Aldrich Sigma	C7698	毒性
ySP9			W303Mataleu2：：LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 （-800 -0） - quadruple V enus
Material
显微镜	康	Ti-Eclipse
显微镜控制软件	Micro-manager	Ver 1.4.11
孵育室	LIS	The Box
荧光灯来源	Lumencor	SpectraX
相机	滨松	闪光灯 4.0
流式细胞仪	BD	FACS 口
超声波浴	Telesonic	TUC-150
8 孔载玻	Thermo Lab-tek	155409
96 孔板	基质生物科学	MGB096-1-2-LG
FACS管	BD Falcon	352054