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方法文章

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

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DOI：

10.3791/50637

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2013年10月4日

 ,  , 
1Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

本文内容

摘要

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。

摘要

在单细胞水平上对基因表达进行定量，能够揭示在群体水平测量中被掩盖的新型调控机制。本文介绍了基于显微镜和流式细胞术的两种方法，以展示如何获取此类数据。以酵母中高渗甘油应答MAPK通路激活后诱导的荧光报告基因表达为例，突出说明了每种方法的具体优势。流式细胞术可测量大量细胞（10,000个），并能够直接反映蛋白质表达的动力学过程，而不受荧光蛋白缓慢成熟动力学的影响。相比之下，显微镜对活细胞的成像仅限于检测少数细胞中已成熟报告蛋白的形式。然而，该技术所产生的数据集可能极为丰富，这得益于多种报告基因的组合以及从单个细胞获得的空间和时间信息。结合使用这两种测量方法，可为信号通路对蛋白质表达的调控机制提供新的见解。

引言

信号转导级联反应通常最终导致蛋白质的表达。对这种表达谱的表征是理解生物通路功能的关键环节。通过多种技术可鉴定上调蛋白质的谱系及其活化动态，例如微阵列、Northern印迹或Western印迹1-3。然而，这些技术反映的是整个细胞群体反应的平均值。为了深入理解蛋白质表达的精细调控，理想情况下应在单细胞水平进行测量。此外，这些测量还应提供可用于建立潜在通路数学模型的定量数据。

显微镜和流式细胞术是两种非常适合提供此类定量单细胞测量结果的技术。通过将荧光蛋白与内源蛋白进行末端标记，可用于定量其表达水平4。然而，由于在蛋白末端添加较大的荧光基团可能导致其失去功能，因此通常更理想的方法是构建基于启动子驱动荧光表达元件的特异性表达报告系统。该报告蛋白为细胞系统的外源蛋白，因此不会影响细胞内发生的信号传导事件。

显微镜和流式细胞术在酵母信号传导研究领域均得到了广泛应用。例如，Colman-Lerner 及其同事通过显微镜在单细胞水平上关联了交配特异性报告基因与组成型表达报告基因的表达情况，以量化酵母交配信号转导级联中的噪声5；Acar 及其同事则利用流式细胞术研究了调控 GAL 基因表达的调控网络6。在之前的一项研究中7，我们结合使用了这两种技术，以研究芽殖酵母中高渗甘油（HOG）通路的表达输出。该通路是一种丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，可由高渗应激激活，导致 MAPK Hog1 激活，并转位至细胞核内，诱导转录程序，从而引发约 300 个基因的表达。为研究这一过程，我们构建了一种基于 STL1 启动子（一个特异性响应 Hog1 活性而被诱导的基因8）驱动四聚体 Venus 荧光蛋白表达的报告系统（pSTL1-qV）。流式细胞术检测发现，在中等应激水平（0.1 M NaCl）下存在两个细胞群体，其中仅有一部分细胞表达荧光报告蛋白。我们进一步利用显微镜深入探究了这一现象，发现蛋白表达中的这种噪声主要由内在因素决定9。我们还观察到，即使 Hog1 活性水平相似的细胞，其基因表达结果也可能表现出显著差异。结合使用这两种技术使我们得以揭示应激响应基因的缓慢重塑如何在单细胞水平上影响基因表达结果7。

在本文中，我们以高渗冲击诱导的 pSTL1-qV 报告基因表达为例，说明通过显微镜和流式细胞术对蛋白质表达进行定量的方法。使用相同菌株在 0.2 M NaCl 胁迫条件下，分别采用这两种技术进行研究。这将有助于我们突出这两种高度互补技术之间的一些关键差异。

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方案

1. 显微镜测量

  1. 用酵母接种5 ml合成培养基。
  2. 在30 °C条件下培养细胞过夜。
  3. 次日早晨测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600）。
  4. 将过夜培养物用5 ml合成培养基稀释至OD600为0.05。
  5. 将稀释后的培养物在30 °C下培养至少4小时。
  6. 在合成培养基中配制3倍浓缩的（0.6 M）NaCl溶液。
  7. 在PBS中配制1 mg/ml的刀豆球蛋白A（ConA）溶液。
  8. 将约200 μl ConA溶液过滤加入载玻片的孔中。
  9. 静置30分钟。
  10. 移除ConA溶液。
  11. 向孔中加入150 μl H2O。
  12. 移除H2O。
  13. 测定细胞培养物的OD600。
  14. 在1.5 ml离心管中制备300 μl、OD600 = 0.02的细胞培养物。
  15. 在水浴中超声处理细胞45秒。
  16. 短暂涡旋振荡离心管。
  17. 在水浴中超声处理细胞45秒。
  18. 短暂涡旋振荡离心管。
  19. 向孔中加入200 μl细胞培养物。
  20. 等待30分钟，使细胞沉降到孔底。
  21. 将载玻片置于显微镜上。
  22. 选择待记录的荧光通道的照明设置。
  23. 选择两个明场图像的照明设置（其中一个略微失焦：焦平面下方3 μm，以实现细胞的准确分割）。
  24. 选择延时成像的时间间隔。
  25. 选择待成像的视野。
  26. 开始采集若干帧图像。
  27. 暂停采集，加入100 μl 0.6 M NaCl培养基。
  28. 恢复成像。

2. 流式细胞术检测

  1. 用酵母接种5 ml合成培养基。
  2. 在30 °C下培养过夜。
  3. 次日早晨测定过夜培养物的OD600。
  4. 将过夜培养物用5 ml合成培养基稀释至OD600为0.1。
  5. 在30 °C下继续培养至少4小时，使OD600达到0.2–0.4。
  6. 用H2O配制1 mg/ml的环己酰亚胺溶液。
  7. 在合成培养基中配制3倍浓缩（0.6 M）的NaCl溶液。
  8. 为每个待测时间点准备一个含100 μl 0.6 M NaCl培养基的1.5 ml微量离心管。
  9. 在时间0时，向每根微量离心管中加入200 μl细胞培养物。
  10. 在30 °C下振荡孵育。
  11. 在时间T时，向一个微量离心管中加入30 μl环己酰亚胺。
  12. 对所有需要的时间点重复步骤2.11。
  13. 将所有微量离心管在30 °C下振荡孵育至少45分钟，最长不超过3小时。
  14. 在流式管中预先加入400 μl PBS。
  15. 在水浴中超声处理细胞1分钟。
  16. 短暂涡旋振荡微量离心管。
  17. 在水浴中超声处理细胞1分钟。
  18. 短暂涡旋振荡微量离心管。
  19. 从每根微量离心管中取100 μl细胞培养物加入对应的流式管中。
  20. 选择488 nm激发激光和530/30 nm带通滤光片进行检测。
  21. 检测非表达和完全表达的样品，以确认其是否处于检测器的灵敏度范围内。
  22. 每份样品至少检测10,000个细胞。

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结果

显微镜检查

携带表达报告基因 pSTL1-qV（ySP97）的酵母细胞被固定在载玻片孔的底部，并置于显微镜下。在成像过程中，通过直接向孔中加入应激培养基来刺激细胞。这种方法使我们能够在信号通路诱导前获取少量细胞图像，并持续追踪刺激后细胞的命运变化。在本实验中，细胞被连续观察约 2 小时，时间间隔为 10 分钟。图 1A 为诱导前非荧光状态的细胞图像，图 1B 显示同一组细胞在受到应激处理 2 小时后的状态，此时表达报告基因已被诱导并产生荧光。

为了提取这些图像中包含的定量信息，必须进行复杂图像分析过程。该过程包括对细胞进行分割以在图像中定义对象，对这些对象进行逐帧追踪，以及测量这些对象的特征（形态和强度特性）。我们开发了名为 YeastQuant 的自主分析平台来完成此类分析10。此外，还有一些其他非商业软件可用于执行此类任务：CellProfiler 11、CellID ...

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讨论

显微镜检查

用ConA处理小室是确保细胞成像质量的关键步骤。由于ConA在PBS中的溶解度较低（5 mg/ml），过滤过程可去除未过滤溶液中存在的大颗粒聚集体，这些聚集体会影响成像效果。细胞能够相对牢固地附着在经处理的表面，加入诱导溶液不应干扰细胞的定位，从而实现刺激前后对细胞的连续追踪。该处理方法也可应用于细胞处于持续流动条件下的流道或微流控装置7,15。如果处理后未用清水充分冲洗小室，细胞将无法正常黏附于玻璃表面，原因可能是溶液中的ConA直接与细胞结合，阻碍了细胞在玻璃表面形成牢固的黏附。洗涤步骤完成后，小室在接种细胞前可干燥放置3-4小时，而不会显著影响细胞在玻璃表面的黏附能力。

荧光通道曝光时间的选择是实验成功的关键设置之一。由于细胞的荧光信号会随着时间推移而增强，因此在正式实验前，使用已诱导的样品预先测试可用于避免图像采集过程中信号饱和的最大曝光时间至关重要。在选择曝光时间时，另一个需要考虑的参数是荧光信号的漂白效应。对于每个样品，必须在图像亮度与因时间推移过程中漂白导致的信号衰减之间找到平衡点。每...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢苏黎世联邦理工学院生物化学研究所的 Matthias Peter 及其研究团队，这些方法即在其实验室中开发完成。本研究得到了瑞士国家科学基金会的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
酵母氮源基础培养基对于培养基CYN6202
CSM氨基酸混合物用于培养基DCS0011
Concanavalin AGE Healthcare17-0450-01
环己酰亚胺Fluka Aldrich SigmaC7698有毒的
ySP9W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34pRS305 pSTL1 (-800 -0) - 四重V Venus
<强>材料
显微镜尼康Ti-Eclipse
显微镜控制软件Micro-manager版本 1.4.11
孵育室LIS盒子
荧光光源LumencorSpectraX
相机HamamatsuFlash 4.0
流式细胞仪BDFACS calibur
超声波清洗机超声波遥控TUC-150
8孔板 Thermo Lab-tek155409
96孔板基质生物科学MGB096-1-2-LG
FACS 管BD Falcon352054

参考文献

  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
  3. Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  4. Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
  5. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
  6. Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
  7. Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
  8. de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
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  12. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).
  13. Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
  14. Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
  15. Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
  16. Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).

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