在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量

通过转导级联信号常常达到高潮蛋白的表达。这种表达谱中的表征对于理解生物学途径的功能的关键因素。上调的蛋白及其活化的动态频谱的识别可以通过例如微阵列，RNA印迹或蛋白质印迹^1-3的各种技术来实现。然而，这些技术平均细胞的全体人民的响应。了解蛋白质的表达的精细调节，理想的是收集的测量在单细胞水平。理想情况下，这些测量还应提供定量数据服从发展的基本途径的数学模型。

显微镜和流式细胞仪两种技术，这是非常适合提供这样的定量单细胞测量。蛋白质与荧光蛋白质的内源性标记可以bÉ用来量化其⁴表达水平。然而，由于在该蛋白质的末端增加了一个大的荧光部分可以使其不起作用的，它往往是更可取的，以产生根据一个启动子驱动的荧光构建体的表达特异性表达记者。此报告蛋白是外生给蜂窝系统，因此不影响正在发生在细胞内信号转导事件。

既显微镜和流式细胞仪已经被广泛应用于酵母的信令字段。作为例子;科尔曼-雷纳和同事相关的，在单个细胞中，配合特定的和组成性表达，记者通过显微镜来量化在酵母交配信号转导级联⁵的噪声的表达，阿贾尔和使用流式细胞仪来研究调控网络的同事控制的GAL基因⁶的表达。在先前的研究^7，我们已经使用了一个化合物-关于这两种技术从高渗透压甘油（HOG）途径在芽殖酵母研究的表达输出。这有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径是由超渗透胁迫触发。它导致MAPK Hog1，这转位到细胞的核的活化，诱导产生大约300个基因的表达的转录程序。为了研究这个过程，我们设计了一个基于该STL1启动子（响应Hog1活动⁸特异性诱导基因）驾驶一辆四金星荧光蛋白（P STL1-QV）的表达表达记者。流式细胞术测量露天细胞的两个群体的存在下，在中间应力水平（0.1M NaCl）中以表达荧光报道人口的一小部分。我们用显微镜来进一步研究这个问题，并发现这种噪声的蛋白质表达，内在因素⁹管辖。我们凑LD进一步观察到细胞Hog1活动的一个类似的水平可能显示明显不同的表达效果。这两种技术的结合允许我们来演示如何的应激反应基因的慢重塑的影响表达产物在单细胞水平^7。

在本文中，我们使用p STL1-QV记者通过超渗透休克诱导如通过显微镜蛋白表达的定量的一个例子中的表达和流式细胞术。一脉相承受到0.2M的NaCl胁迫，研究了这两种技术。这将允许我们强调在这两个高度互补的技术，一些关键的差别。

1。显微镜测量

1. 接种5毫升合成培养基中的酵母。
2. 细胞生长于30℃过夜。
3. 测量过夜培养物的OD _600，第二天早上。
4. 稀释过夜培养在5毫升合成培养基，以OD ₆₀₀ 0.05。
5. 生长的稀释的培养在30℃下为至少4小时。
6. 制备3倍浓缩在合成培养基（0.6 M）的NaCl溶液。
7. 准备1毫克/毫升的溶液刀豆蛋白A（刀豆）的PBS中。
8. 滤液〜200微升的溶液刀豆入井幻灯片。
9. 静置30分钟。
10. 删除刀豆解决方案。
11. 加入150μlH _{2 O}至井。
12. 除去H ₂ O
13. 测量细胞培养的外径_600。
14. 在1.5ml微管中制备300μl的细胞培养物在OD ₆₀₀ = 0.02。
15. 超声处理水浴中45秒的单元格。
16. 涡简要英里crotube。
17. 超声处理水浴中45秒的单元格。
18. 短暂涡旋微管。
19. 加入200μl细胞培养的好。
20. 等待30分钟，以让细胞沉降到井的底部。
21. 放置在显微镜的良好滑动。
22. 选择照明设置的荧光信道进行记录。
23. 选择两个亮场图像的照明设置（一个关注的焦点:3微米以下的焦平面以允许细胞的适当分割）。
24. 选择的时间间隔的延时测量
25. 选择视图图像的字段。
26. 开始采集数帧。
27. 暂停收购以添加100微升0.6 M氯化钠介质。
28. 恢复成像。

2。流式细胞仪测量

1. 接种5毫升合成培养基中的酵母。
2. 生长于30℃过夜。
3. 措施外径₆₀₀过夜培养的第二天早晨。
4. 稀释过夜培养在5毫升合成培养基，以OD ₆₀₀ 0.1。
5. 生长在30℃至少4小时到达外径₆₀₀ 0.2-0.4。
6. 准备在H ₂ O放线菌酮溶液1毫克/毫升
7. 制备3倍浓缩在合成培养基（0.6 M）的NaCl溶液。
8. 制备1 1.5mL微管加入100μl的0.6M的NaCl的培养基中对每个时间点进行测量。
9. 在时间0，加入200μl细胞培养到每个微管。
10. 孵育振荡在30℃下
11. 在时间T，加入30微升放线菌酮的微管。
12. 对于所有想要的时间点重复步骤2.11。
13. 所有孵育微管至少45分钟，最多3个小时，在30℃振荡。
14. 准备FACS管400微升PBS。
15. 超声处理的细胞在水浴中1分钟。
16. 短暂涡旋微管。
17. 儿子icate细胞在水浴中放置1分钟。
18. 短暂涡旋微管。
19. 加入100μl细胞培养在每个微管到其相应的FACS管。
20. 选择488 nm激发激光和三十〇分之五百三nm的带通滤波器进行检测。
21. 测试非表达，充分表达样品，以确认他们是否落在探测器的灵敏度范围。
22. 测量10,000个细胞的每个样品。

显微镜

酵母细胞轴承表达式记者p STL1-QV（ySP9 7）被附连到良好的滑动件的底部并在显微镜下放置。将细胞通过加入应力介质的成像会话的过程中刺激直接进入井。这使我们能够通路诱导前获得细胞的一些图片，并按照他们的命运刺激后。在本案中，随访细胞为〜2小时，以10分钟的时间间隔。 图1A是诱导和图1B前非荧光的细胞的图像显示2小时后的应力相同的细胞时，表达报道有被诱导，并已成为荧光。

以提取存在于这些图像的量化信息，一个复杂的图像分析处理，必须执行。它包括细胞的分割到第i定义对象法师，这些对象的跟踪从一帧到下一帧，并为这些对象（形状和强度特性）的特征的测量。我们已经开发了一个名为YeastQuant自己的平台来进行这种分析10。其他一些非商业软件可用来执行这些任务。CellProfiler 11，CELLID 12或CellX 13 图1C显示与YeastQuant进行分析的结果。每个红色迹线代表单个细胞的平均荧光强度随时间的演化。蓝线显示500多个细胞进行分割和跟踪整个五年时间推移电影从来自同一个很好的看法五个不同领域获得的20帧的中位数。淡蓝色区域表示在给定时间点测量所有强度的第25和第75百分位。

流式细胞仪

对于流式细胞术measuremENTS，细胞培养液洒在含压力介质的微管。为了研究在p STL1-QV表达的时间演化，翻译被抑制在不同时间点（5到10分钟的间隔）与放线菌酮（ 图2）。这种药物的块合成新的蛋白质，但已表达的荧光蛋白的成熟不被干扰。因此，45分钟至孵育一小时后，该细胞可以在流式细胞仪测定使蛋白质在放线菌酮添加时产生的量的定量。这种策略规避荧光蛋白成熟的问题，以及由此量化的荧光蛋白质合成的真实动态。

这两种技术的比较

图3A比较表达式记者通过显微镜和流式细胞仪的动态。而荧光信号开始上升30-40最小应力与显微镜后，流式细胞仪测量清楚地证明该蛋白质是10至15分钟之间已经产生的刺激之后。这个半小时的延迟是由于荧光蛋白14的缓慢成熟。虽然这两种方法定量的细胞的荧光强度，人们必须牢记，在这种研究中，他们不测量相同的生物学过程。同时，显微镜下的荧光信号的幻影，流式细胞仪实际上是定量的蛋白的合成。重要的是进行活细胞成像时要考虑到这一点成熟的一步。在一个情况下的内源蛋白被标记有荧光的蛋白质，内源性蛋白将表达和活性可以检测其标记的荧光之前。

如上文所示，这两种方法提供补充信息。流式细胞仪可以测量大量细胞的非常迅速（10,000或更多）。因此，它可以提供在两个重叠的群体可以被识别或一些罕见的事件可以观察到统计上丰富的数据集。显微镜提供了对细胞的数目有限（100级）的信息。但是，由于该数据集包含的时间和空间信息，并允许在同一单元多次测量的相关性，它可以提供非常有价值的见解所研究的生物过程。

图1。测量显微镜记者表达。细胞带有荧光表达记者p STL1-QV刺激前用0.2 M氯化钠（B）C试验（A）和2小时的A和B。图片。流感的时间过程 orescence幽灵。红色曲线代表的几个有代表性的单细胞痕迹的平均细胞的荧光强度。蓝色曲线代表的550单细胞痕迹平均荧光。淡蓝色区域表示细胞群的荧光表达在各时间点的第25和第75百分位。 点击这里查看大图 。

图2。通过流式细胞术报告基因表达的测定。细胞轴承荧光表达记者p STL1-QV用0.2M NaCl和抑制与放线菌酮在不同时间点处理的细胞的荧光直方图。www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg"目标="_blank">点击这里查看大图。

图3。通过显微镜和流式细胞仪的表达动态的比较。荧光强度的平均数A.通过流式细胞术（实线）和显微镜（虚线）测量的时间为3次生物学重复的功能。误差棒代表平均值，B和 120分钟的归一化荧光强度C.直方图的标准误差应力显微镜（B）和应力流式细胞仪（C）三个重复后的60分钟后。 点击这里查看大图。

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。