细胞和生物膜细胞外成分的定量并发

Summary

提出了一种用于同时定量和比较生物膜内三种细胞和细胞外成分的方案。该方法涉及使用共聚焦激光扫描显微镜、生物膜结构分析和可视化软件以及统计分析软件。

Abstract

共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 是研究生物膜的强大工具。很少有研究成功量化生物膜中两种以上成分的同时分布，因为：1） 选择具有最小光谱重叠的荧光染料很复杂，以及 2） 多种荧光染料的定量存在多因素问题。目标：报告一种量化和比较在相关基质上生长的生物膜的三种细胞/细胞外成分同时 3 维分布的方法。方法：该方法包括不同的、相互关联的步骤，涉及生物膜生长、染色、CLSM 成像、生物膜结构分析和可视化以及结构参数的统计分析。变形链球菌（菌株 UA159）的生物膜在 Point 4 和 TPH³ 树脂复合材料的无菌标本上生长 48 小时。随后将标本浸入 Biotène PBF （BIO） 或 Listerine Total Care （LTO） 漱口水或水中 60 秒（对照组;n=5/组）。在用 CLSM 成像之前，用细胞外聚合物物质、蛋白质和核酸的荧光染料对生物膜进行染色。使用 ISA3D 图像分析软件计算的生物膜结构参数为生物体积和平均生物膜厚度。混合模型统计分析比较了漱口水和对照组之间的结构参数（SAS 软件;α=0.05）。Volocity 软件允许可视化叠加生物膜成分（荧光染料）的 3D 分布。 结果：漱口水 BIO 在两种树脂复合材料上产生的生物膜结构与对照 （p<0.05） 显着不同，而 LTO 在两种产品上均未产生差异 （p>0.05）。结论：该方法有效且成功地量化和比较了变形链球菌生物膜中三个主要成分在相关底物上的同时 3D 分布，从而克服了同时评估生物膜成分的两个挑战。该方法还可用于确定抗菌剂/防污剂对多种生物膜成分的功效，如使用漱口水所示。此外，这种方法具有广泛的应用，因为它有助于比较各种学科中生物膜的 3D 结构/结构。

Introduction

生物膜是结构化的微生物群落，被封装在自产的细胞外基质中，并附着在生物或惰性表面¹。生物膜代表了许多细菌的常见生活方式，通过从自由漂浮（浮游）细胞分阶段过渡到复杂的多物种群落而形成。生物膜对抗菌剂的固有抵抗力是许多持续性和慢性细菌感染的根源^1,2，口腔生物膜（牙菌斑）证明了这一点。致龋微生物（如变异链球菌）加工蔗糖和其他碳水化合物以产生细胞外基质并产生酸，这些酸会使牙齿结构脱矿并导致龋齿。大多数生物膜基质是由细胞和细胞外成分（如胞外多糖 （EPS）、蛋白质和核酸）组成的生物聚合物^3,4。

共聚焦激光扫描显微镜 （CLSM） 是荧光成像中使用最广泛的技术，它从根本上改变了生物学中的光学成像，因为它能够在不固定的情况下收集水合生物结构的 3D 图像^5,6,7。这种无损技术涉及收集标本上感兴趣区域内薄片的图像，以消除离焦光的贡献。CLSM 捕获的图像质量和分辨率超出了使用宽场荧光显微镜所能达到的水平。CLSM 的一个主要缺点是图像扫描的速度比宽场显微镜技术慢，在宽场显微镜技术中，整个图像是同时收集的⁵。然而，随着荧光染料、激光器和滤光片的选择范围不断扩大，CLSM 已成为多光谱成像的主流技术之一^5,7。

先前的研究表明，CLSM 是一种有用的工具，通过使用一个或两个荧光标签或染色剂来更好地了解 EPS 和细胞在生物膜内的分布，尤其是在细胞外基质中^7,8。从理论上讲，多种成分的荧光染色/标记对于探索生物膜内细胞和细胞外成分的详细结构和共定位是可取的。然而，同时分析生物膜内的各种成分可能具有挑战性，因为：1） 选择具有最小光谱重叠的荧光染料很复杂，以及 2） 多种荧光染料的定量会带来多因素问题。使用多种荧光染料进行共定位需要使用光谱干扰极小的高度特异性染料，以避免任何渗漏效应，当两种荧光染料的光谱峰显著重叠时，就会发生这种情况，导致一种荧光染料比其他⁹ 种荧光染料激发得更强烈。理想情况下，激发光谱不重叠的荧光染料将提供最佳结果，但是很难找到符合此标准的染色剂。相反，通过选择发射光谱重叠最小的荧光染料来优化染色剂的选择，从而允许在有限的观察波段⁹ 内逐个观察染色剂。

荧光图像的叠加可能是评估荧光染料并发分布的最广泛使用的方法。各种组分的共定位表现为通过被检查的荧光染料创建的多个通道不同颜色的重叠¹⁰。大多数 CLSM 软件和生物图像分析软件都提供了将多通道荧光图像显示为合并彩色图像的工具。尽管图像叠加对于共定位的空间评估很有用，但只能通过视觉分析对图像进行定性检查。这提供的信息量有限，因为这些表示通常对不同实验条件下的共定位量化没有帮助，也不能确定共定位是否超过随机重合¹¹。迄今为止，很少有研究使用定量方法来分析生物膜和生物膜成分的 3 维结构，而量化抗菌处理或防污措施对生物膜成分的影响的研究就更少了。

本研究的目的是报告一种量化和比较生物膜三种细胞和细胞外成分同时 3 维分布的方法。该方法包括不同但相互关联的步骤，涉及生物膜生长、染色、生物膜的 CLSM 成像、生物膜结构分析和可视化以及结构参数的统计分析。生物膜生长测定允许在相关基质上生长生物膜，并产生可重复的生物膜结构。EPS、蛋白质和核酸成分的新型同时染色与 3D 生物膜结构参数的测量相结合，可产生生物膜内成分的可量化分布。生物膜结构参数的统计分析有助于在特定实验条件下（例如，用漱口水处理后）评估生物膜，如下一节所述。

Protocol

1. 培养基和试剂的制备

1. 制备 300 ml 过夜培养基（THY;根据制造商的说明制备的 3% Todd Hewitt 肉汤，补充有 0.3% 酵母提取物的超纯水溶液）并高压灭菌。在室温下储存长达 2 个月。
2. 在超纯水中制备 1 L THY 琼脂（3% Todd Hewitt 肉汤、0.3% 酵母提取物和 1.5% 琼脂），高压灭菌，冷却至 60 °C，然后倒入培养皿中。在 4 °C 下储存长达 3 个月。
3. 制备 150 ml 生物膜生长培养基（0.5X TY 补充 10 mM 蔗糖;1.5% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物和 10 mM 蔗糖的超纯水中）并过滤灭菌。在室温下储存长达 1 个月。
4. 制备 1 L 磷酸盐缓冲盐水（PBS;在超纯水中为 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄ 和 0.24 g KH₂PO₄）和高压灭菌器。在室温下储存数月。
5. 在超纯水（TC 缓冲液;pH 7.2）中制备 600 ml 10 mM Tris HCl 缓冲液，补充有 10 mM CaCl₂ 并高压灭菌。在室温下储存数月。
6. 高压灭菌器 1 L 超纯水。在室温下储存数月。

2. 试样制造

1. 在定制的不锈钢模具中以两个增量制造 Point 4 （PF） 和 TPH³ （TP） 牙科树脂复合材料的圆盘状标本。每个增量都使用 LED 光固化装置进行 40 秒的光固化。这两种产品的成分和填料水平略有不同，因此会产生不同的表面拓扑结构，生物膜将在其上生长。
   1. 可以使用其他学科的既定方案代替步骤 2.1 来制造相关底物的标本。
2. 对试样进行精加工和抛光，以达到可接受的最终表面光洁度，例如使用半自动研磨抛光机。用超纯水冲洗抛光标本，并使用压缩空气干燥。
3. 使用环氧乙烷气体或其他灭菌方法对标本进行灭菌。

3. 生物膜生长

1. 将单个变异链球菌菌落接种到 4 ml 过夜培养基中（步骤 1.1）。在 37 °C 下孵育过夜 16-18 小时。培养物的光密度 （OD₆₀₀） 应为 ≥0.9。
   1. 最好使用从原始原液中传代 2 次的平板培养物中的菌落，因为这会导致更一致的生物膜生长。
2. 在 10 ml 生物膜生长培养基（步骤 1.3）中使用过夜培养物（步骤 1.1）制备 1：100 稀释液。
3. 将无菌树脂复合样品（例如 PF、TP）转移到无菌 12 孔板中。
4. 将 2.5 ml 稀释的培养基（步骤 3.2）添加到处理组（漱口水）和对照组的孔中。将 2.5 ml 无菌未接种的生物膜生长培养基添加到无菌对照孔中。
5. 在微需氧条件下生长生物膜。将板放在摇床上，在 37 °C 的培养箱中以 100 rpm 的速度放置 24 小时。
6. 24 小时后，无菌吸出所有孔中的培养基，并用无菌 PBS 洗涤两次（步骤 1.4;2.5 ml/孔），每次洗涤后吸出 PBS。在每个孔中补充 2.5 ml 新鲜生物膜生长培养基，并在与上一步相同的条件下再孵育 24 小时，生物膜总生长时间为 48 小时。
7. 代替上述步骤，可以使用既定方案在基质上生长其他物种的生物膜。

4. 抗菌/漱口水治疗

1. 生物膜生长完成后吸出培养基。
2. 在治疗组的孔中加入 2.5 ml Biotène PBF （BIO） 或 Listerine Total Care （LTO） 漱口水或其他治疗方式，并向对照组孔中加入 2.5 ml 无菌超纯水。按照制造商的说明，将样品浸入 60 秒，同时在轨道振荡器上以 150 rpm 的速度搅拌板。立即从井中吸出漱口水和超纯水。
3. 在轨道摇床上用无菌超纯水以 150 rpm 的速度洗涤样品 5 次，每次洗涤 15 秒，每个洗涤步骤后吸出水。
代替
4. 上述步骤，可以使用既定方案测试其他抗菌剂。

5. 染色

1. 准备用于生物膜分析的染色稀释液。
   1. 在 0.1 M 碳酸氢钠 （pH 8.3） 中制备 5 mg/ml 伴刀豆球蛋白 A、Alexa Fluor 647 偶联物 （AF） 储备液。在 -20 °C 下以一次性等分试样储存数月，因为不鼓励冻融。使用该 AF 储备液，在 TC 缓冲液中制备 250 μg/ml 稀释液。
   2. 使用制造商提供的 5 mM Syto 9 储备液 （SY） 在 TC 缓冲液中制备 10 μM 稀释液。将剩余的 SY 储备溶液在 -20 °C 下储存数月。
   3. 使用制造商提供的 5,000 x Sypro Red 储备液 （SR） 在无菌超纯水中制备 10 倍稀释液。将剩余的 SR 储备溶液在 -20 °C 下储存数月。
2. 用手旋转动作用 TC 缓冲液（2.5 ml/孔）洗涤所有生物膜 2 次，让第二次洗涤在室温下在板中保留 30 分钟。抽 吸。
3. 在每个生物膜标本上滴 50 μl AF 染色剂。在室温下避光染色 30 分钟。用 TC 缓冲液（2.5 ml/孔）洗涤 2 次，每次洗涤后吸出。
4. 然后在每个生物膜标本上滴 50 μl SY 染色剂。在室温下避光染色 30 分钟。用无菌超纯水（2.5 ml/孔）洗涤 2 次，每次洗涤后吸出
5. 最后，在每个生物膜标本上放置 50 μl SR 染色剂。在室温下避光染色 30 分钟。用无菌超纯水（2.5 ml/孔）洗涤 3 次，每次洗涤后吸出。
6. 将标本转移到 6 孔板中，每孔将一个标本放入 6 ml 无菌超纯水中，以促进共聚焦显微镜检查。

6. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行成像

1. 使用表 1 所示的共聚焦激光扫描显微镜设置获取处理组和对照组生物膜内每个成分（染色剂）的图像。本研究使用了数值孔径为 0.9 且工作距离为 2.2 mm 的 63X 浸渍透镜><。
   表 1.共聚焦激光扫描显微镜设置。

2. 将扫描尺寸设置为 250 μm x 250 μm，最小像素分辨率为 512 x 512，以足以进行定量分析的分辨率获取 CLSM 图像。
3. 使用 SY 染色设置生物膜图像堆栈的顶部和底部点，然后将 z 步长设置为足以进行定量分析（本研究为 0.6 μm）。在收集扫描之前，使用 QLUT 选项优化图像和染色参数（即 PMT 电压和偏移）。使用颜色查找表为每个染色剂分配伪彩色（SY 为绿色，SR 为红色，AF 为蓝色），以使每个生物膜成分在 3D 重建中更加可区分。
4. 在"堆栈之间"模式下使用顺序扫描以 400 Hz 收集 CLSM 图像，以优化同一生物膜内多个染色剂图像的捕获。

7. 生物膜结构分析

1. 分析使用生物膜图像分析软件收集的 CLSM 图像。以下步骤描述了使用 ISA3D 软件¹² 计算收集的生物膜图像的结构参数。
   1. 将每个生物膜的 CLSM 图像文件复制到 Images 文件夹，如软件手册中指定。确保遵循软件所需的 CLSM 文件的命名约定。该软件允许以批处理模式分析子文件夹中的文件，从而有助于在同一次运行中分析处理组和对照组的生物膜。
   2. 在主对话框的 dxy 和 dz 字段中输入 CLSM 图像的 x、y 和 z 轴尺寸。选择阈值和距离映射设置，如软件手册中所述（本研究分别使用了 Otsu 和 Quasi-Euclidean）。为结果文件输入合适的名称，然后运行程序。将在 ISA 文件夹中生成一个结果文件。
   3. 查看结果文件以获取 20 个 3D 结构参数¹² 的值，例如生物体积和平均生物膜厚度（在本研究中测量），这些参数量化了生物膜内每个成分（染色）的 3D 分布。

8. 生物膜结构的可视化

1. 使用图像分析软件在每个生物膜内创建叠加成分（染色剂）的重建。以下步骤描述了如何使用 Volocity 软件创建 3D 重建。
   1. 通过将 CLSM 图像文件复制到软件中来为每个生物膜创建一个库，如手册中所述。
   2. 使用 3D 渲染器菜单选项从每个生物膜的 CLSM 图像生成重建的 3D 图像（本研究使用 HR 不透明度格式）。
   3. 旋转 3D 图像以类似的方式相对于 x、y 和 z 坐标轴定向所有生物膜。捕获正确方向的生物膜重建的快照，然后以 TIFF、JPEG 或其他合适的格式导出快照。
2. 在重建图像上对生物膜内 EPS、蛋白质和核酸成分的并发分布进行视觉分析。
3. 使用 Pearson 的相关系数和 Manders 的重叠系数对多个生物膜成分进行共定位分析（本研究未测量共定位）。

9. 统计分析

1. 使用单独的混合模型统计分析来比较漱口水和对照组之间结构参数的平均值 （α=0.05）。在本研究中，使用 SAS 软件进行统计分析。

Results

治疗组（漱口水）和未处理对照组的代表性结果如表 2 以及图 1 和图 2 所示。表 2 显示了使用 ISA3D 软件计算的生物膜结构参数生物体积 （μm³） 和平均生物膜厚度 （μm） 的平均值和标准差值。用漱口水处理的生物膜的结构参数与对照组 （p<0.05） 中的生物膜的结构参数显着不同，平均值和标准差值以红色突出显示。混合模型统计分析的结果表明，漱口水 BIO 在两种树脂复合材料上产生的生物膜结构与对照 （p<0.05） 显着不同，而漱口水 LTO 在两种树脂复合材料上均未产生显着差异 （p>0.05）。结果清楚地表明，两种漱口水处理后剩余的细胞和细胞外生物膜成分不同。还应该注意的是，在两种基材（PF 和 TP）上生长的变形链球菌生物膜在 3D 结构上有所不同，即使它们是在相似的条件下生长的，并且两种基材都用相似的磨料抛光。

通过使用 Volocity 软件生成的 3D 重建，可以可视化生物膜内 EPS、蛋白质和核酸的并发分布。图 1 和图 2 分别展示了在 PF 和 TP 树脂复合材料上生长的对照组生物膜的代表性重建。蓝色染色剂代表变形链球菌生物膜内的 EPS，绿色染色剂显示核酸，红色染色剂显示蛋白质。中间空间可能被水或其他非荧光标记的生物膜成分占据。

图 1. 对照组（未用漱口水处理）在 PF 树脂复合材料上生长的变形链球菌生物膜的代表性 3D 重建。在单个生物膜中同时叠加三种染色剂，可以同时观察变形链球菌生物膜内的 EPS（蓝色染色）、核酸（绿色染色）和蛋白质（红色染色）成分。（1 单位 = 24 μm）。 单击此处查看大图。

图 2. 对照组（未用漱口水处理）在 TP 树脂复合材料上生长的变形链球菌生物膜的代表性 3D 重建。在单个生物膜中同时叠加三种染色剂，可以同时观察变形链球菌生物膜内的 EPS（蓝色染色）、核酸（绿色染色）和蛋白质（红色染色）成分。（1 单位 = 24 μm）。 单击此处查看大图。

<表 border="1"> 树脂复合材料 点 4 TPH3 漱口 水 元件 BV （μm³） 公吨 （μm） BV （μm³） 公吨 （μm） Biotène PBF 核酸 279,517±53,291 元 9月32±2月80日 195,033±42,014 7.45±3.70 每股收益 344,902±56,386 19 年 35 月 22 ±17 日 197,840±62,351 元 9.83±7.26 蛋白质 298,796±62,868 54.21±21.65 216,033±66,654 24.33±39.64 李斯特林全面护理 核酸 355,707±110,444 21 年 45 月 26 ±14 日 273,296±47,323 元 89 ± 13.43 2 月 每股收益 494,099±180,592 64.90± 26.68 329,150±47,145 元 34.35±30.32 蛋白质 348,416±161,316 元 58.68±47.28 303,150±54,705 元 34.18±41.46 对照（未处理） 核酸 388,375±42,152 元 51.15±40.66 327,809±39,400 元 17.08±1.65 每股收益 660,448±173,197 元 91.37±74.84 元 363,850±67,612 28.33± 15.07 蛋白质 517,274±119,475 元 价格：127.96±73.84 353,161±56,518 41 月 21 日± 4 月 41 日

表 2.用 BIO 或 LTO 处理或未处理（对照组）的生物膜的生物体积 （BV） 和平均生物膜厚度 （MT） 的平均值和标准差值。用漱口水处理的生物膜的结构参数与对照组 （p<0.05） 中的生物膜的结构参数显着不同，平均值和标准差值以红色突出显示。

Discussion

CLSM 图像的采集必须以生物膜量化和共定位分析所需的方式和格式进行，以便每个图像中信号强度的分布是生物膜堆栈中每种荧光染料分布的可靠表示。信号强度应与噪声和背景^10,11区分开来，不受底物自发荧光的影响，并且由于所用荧光染料之间的光谱干扰而导致的渗漏最小¹¹。噪声是荧光显微镜¹¹不可避免的限制，图像质量有时会因技术或后勤原因而受到限制。鉴定光谱重叠最小的荧光染料对于该方法的成功至关重要，但可能很复杂。此外，多种荧光染料的定量带来了多因素问题。因此，很少有研究成功量化生物膜结构中两种以上组分的并发分布也就不足为奇了。

本研究的目的是报告一种方法，该方法由不同但相互关联的步骤组成，用于量化和比较生物膜内三种细胞和细胞外成分的并发 3 维分布。所描述的生物膜生长测定允许生物膜在相关底物上生长并产生可重复的生物膜结构，如 表1中报告的结果所示。EPS、蛋白质和核酸成分的新型同时染色与 3D 生物膜结构参数的测量相结合，导致生物膜内成分的可量化分布。通过重建每个生物膜内的覆盖染色剂，可以对生物膜内EPS，蛋白质和核酸的同时分布进行定性视觉分析。ISA3D软件¹² 除了孔隙率和生物膜厚度等传统测量参数外，还包含几个独特的结构参数，如分形维数、均匀性和生物膜粗糙度系数，以增强生物膜3D结构的量化。生物膜结构参数的统计分析有助于在特定实验条件下对生物膜进行相关比较，例如抗菌/防污功效（例如用漱口水处理后）或随时间推移（时间效应）。

该方法有效、成功地量化和比较了在相关基质上生长的变 形链球菌 生物膜中三种主要成分的并发 3D 分布，从而克服了同时评估生物膜成分的两个挑战。该方法还可用于确定抗菌处理或防污措施对多种生物膜成分的功效，如本研究中使用漱口水所示。此外，上述大多数方案可以替换为用于制造相关底物和相关微生物的生物膜生长测定的方案。因此，该方法具有广泛的应用，因为它有助于比较医学、牙科、地质和海洋科学等多个学科中体 外 和 体内 生物膜的 3D 结构/结构。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto 琼脂	Becton， Dickinson and Company	214010
Bacto Todd Hewitt	Becton， Dickinson and Company	249240
酵母提取物，颗粒状	EMD Millipore	1.03753.0500
Bacto 胰蛋白胨	Becton， Dickinson and Company	211705
OmniPur 蔗糖	EMD Millipore	8510
氯化钾，ACS 试剂，99.0-100.5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
磷酸钾，一元和 ge;99.0%，ACS 试剂	Sigma-Aldrich	P0662-500G
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888-500G
磷酸钠，一元，一水合	物 EMD Millipore	SX0710-1
三（羟甲基）氨基甲烷，99.8+%，ACS 试剂	Sigma-Aldrich	252859-500G
伴刀豆球蛋白 A，Alexa Fluor 647 偶联物	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 或 S6653
Biotène PBF 漱口水	葛兰素史克	N/A
李斯特林全面护理	McNeil-PPC， Inc.		不适用