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生物膜中细胞与胞外组分的同时定量

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DOI：

10.3791/50639

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2013年12月10日

 ,  ,  , 
1Department of Dental Materials, College of Dentistry, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Biostatistics and Epidemiology, College of Public Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 3Department of Biological Sciences, School of Mathematics and Natural Sciences, The Copperbelt University

本文内容

摘要

本文介绍了一种同时定量和比较生物膜中三种细胞内及细胞外组分的实验方案。该方法涉及共聚焦激光扫描显微镜、生物膜结构分析与可视化软件以及统计分析软件的使用。

摘要

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是研究生物膜的有力工具。由于以下两个原因，极少有研究能够成功量化生物膜内两种以上组分的同时分布：1） 选择光谱重叠最小的荧光染料较为复杂；2） 多种荧光染料的定量分析涉及多因素问题。目的：报告一种用于量化和比较在相关基底上生长的生物膜中三种细胞/胞外组分同时存在的三维分布的方法。方法：该方法包括一系列明确且相互关联的步骤，涉及生物膜培养、染色、CLSM成像、生物膜结构分析与可视化，以及结构参数的统计分析。变异链球菌（Streptococcus mutans，菌株UA159）生物膜在Point 4和TPH3树脂复合材料的无菌样本上培养48小时。随后将样本浸入Biotène PBF（BIO）或Listerine Total Care（LTO）漱口水中60秒，或浸入水中（对照组；每组n=5）。在CLSM成像前，使用荧光染料对生物膜中的胞外聚合物、蛋白质和核酸进行染色。采用ISA3D图像分析软件计算的生物膜结构参数包括生物体积和平均生物膜厚度。采用混合模型统计分析方法比较漱口水组与对照组之间的结构参数（SAS软件；α=0.05）。Volocity软件用于可视化叠加的生物膜组分（荧光染料）的三维分布。结果：在两种树脂复合材料上，使用漱口水BIO形成的生物膜结构均显著不同于对照组（p<0.05），而LTO在任一材料上均未引起显著差异（p>0.05）。结论：该方法高效且成功地量化并比较了在相关基底上变异链球菌（S. mutans）生物膜中三种主要组分的同时三维分布，从而克服了同时评估生物膜组分的两大挑战。该方法还可用于评估抗菌/防污剂对多种生物膜组分的作用效果，如本研究中使用漱口水所示。此外，该方法具有广泛的应用前景，因为它有助于在多种学科中比较生物膜的三维结构/构型。

引言

生物膜是由自身产生的胞外基质包裹并附着于生物或非生物表面的结构化微生物群落1。对于许多细菌而言，生物膜是一种常见的生存方式，其形成过程经历从游离状态（浮游）细胞逐步发展为复杂的多物种群落的不同阶段。生物膜对抗菌剂具有内在耐受性，这是许多持续性和慢性细菌感染的根本原因1,2，口腔生物膜（牙菌斑）便是典型例证。致龋微生物如变形链球菌可利用蔗糖及其他碳水化合物产生胞外基质，并生成酸性物质，导致牙体组织脱矿，进而引发龋齿。大多数生物膜基质是由细胞成分和胞外成分组成的生物聚合物，包括胞外多糖（EPS）、蛋白质和核酸等3,4。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是荧光成像中最广泛使用的技术，因其能够无需固定即可采集水合生物结构的三维图像，从而彻底改变了生物学中的光学成像5,6,7。这种非破坏性技术通过采集样品感兴趣区域内薄层切片的图像，排除了离焦光的干扰。CLSM 所获取图像的质量和分辨率远超宽场荧光显微镜所能达到的水平。CLSM 的一个主要缺点是图像扫描速度较宽场显微镜技术慢，后者可同时采集整幅图像5。然而，随着荧光染料、激光器和滤光片种类的不断丰富，CLSM 已成为多光谱成像的主要技术之一5,7。

先前的研究表明，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）是一种有效的工具，可通过使用一种或两种荧光标记或染料来观察生物膜的结构或构架，从而更好地理解胞外多糖（EPS）和细胞在生物膜内、尤其是胞外基质中的分布7,8。理论上，对多个组分进行荧光染色/标记有助于深入探究生物膜内细胞及胞外组分的精细结构及其共定位情况。然而，同时分析生物膜内多种组分仍具挑战性，原因如下：1) 选择光谱重叠最小的荧光染料较为复杂；2) 多种荧光染料的定量分析涉及多因素问题。使用多种荧光染料进行共定位分析时，需采用高度特异且光谱干扰最小的染料，以避免串色效应（bleed-through effect）——当两种荧光染料的光谱峰存在显著重叠时，一种染料可能被过度激发，从而干扰另一种染料的检测9。理想情况下，激发光谱无重叠的荧光染料可获得最佳结果，但很难找到完全满足此条件的染料。因此，通常通过优化染料选择，采用发射光谱重叠最小的荧光染料，以便在有限的观测波长范围内逐一观察各染料信号9。

荧光图像叠加可能是评估荧光染料共分布的最常用方法。通过被检测荧光染料产生的多通道信号，不同组分的共定位表现为多种颜色的重叠10。大多数共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）软件和生物图像分析软件均提供将多通道荧光图像显示为合并彩色图像的工具。尽管图像叠加有助于对共定位进行空间评估，但仅能通过视觉分析进行定性观察。这种方法提供的信息有限，因为此类图像通常难以在不同实验条件下对共定位进行量化，也无法判断共定位是否超出随机重合的范围11。迄今为止，极少有研究采用定量方法分析生物膜及其组分的三维结构，更少有研究对抑菌处理或防污措施对生物膜组分的影响进行量化。

本研究的目的是报告一种用于定量和比较生物膜中三种细胞及细胞外组分同时存在的三维分布的方法。该方法包括一系列独立但相互关联的步骤，涉及生物膜培养、染色、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像、生物膜结构分析与可视化，以及结构参数的统计分析。生物膜培养实验可在相关基质上促进生物膜生长，并形成可重复的生物膜结构。通过新型的胞外聚合物（EPS）、蛋白质和核酸组分的同步染色，结合三维生物膜结构参数的测量，可获得生物膜内各组分的可量化分布。对生物膜结构参数进行统计分析，有助于在特定实验条件下评估生物膜的特性。例如 （在下一节中将描述使用漱口水治疗后的效果）。

方案

1. 培养基与试剂的准备

  1. 制备300 ml过夜培养基（THY；按说明书配制3% Todd Hewitt肉汤，加入0.3%酵母提取物，溶于超纯水中），高压灭菌。室温保存，最长可保存2个月。
  2. 制备1 L THY琼脂培养基（3% Todd Hewitt肉汤、0.3%酵母提取物和1.5%琼脂溶于超纯水中），高压灭菌后冷却至60 °C，然后倒入培养皿中。4 °C保存，最长可保存3个月。
  3. 制备150 ml生物膜生长培养基（0.5X TY补充10 mM蔗糖；即1.5%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和10 mM蔗糖溶于超纯水中），过滤除菌。室温保存，最长可保存1个月。
  4. 制备1 L磷酸盐缓冲盐水（PBS；8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4溶于超纯水中），高压灭菌。室温保存，可保存数月。
  5. 制备600 ml含10 mM CaCl2的10 mM Tris HCl缓冲液（TC缓冲液；pH 7.2，溶于超纯水中），高压灭菌。室温保存，可保存数月。
  6. 高压灭菌1 L超纯水。室温保存，可保存数月。

2. 样品制备

  1. 制备点4（PF）和TPH的圆盘状样品3 在定制的不锈钢模具中分两层制备（TP）牙科树脂复合材料。每层使用LED光固化仪光照固化40秒。这两种产品成分和填料含量略有不同，因而形成不同的表面形貌，用于后续生物膜的培养。
    1. 可使用其他学科已建立的方案替代步骤2.1来制备相关基底的样品。
  2. 完成并抛光样品，使其达到可接受的最终表面光洁度， 例如 使用半自动研磨抛光机进行处理。用超纯水冲洗抛光后的样品，并用压缩空气吹干。
  3. 使用环氧乙烷气体或替代的灭菌方法对样本进行灭菌。

3. 生物膜生长

  1. 接种单个菌落 S. mutans 加入4 ml过夜培养基（步骤1.1）中，37℃过夜培养 37 °C 孵育16-18小时。测光密度（OD600培养物的光密度值（OD）应≥0.9。
    1. 最好使用从原始菌种传代两次后的平板培养物中的菌落，因为这能使生物膜生长更加一致。
  2. 使用过夜培养物（步骤1.1）在10 ml生物膜生长培养基（步骤1.3）中制备1:100的稀释液。
  3. 转移无菌树脂复合材料试样（例如 PF、TP）加入无菌的12孔板中。
  4. 向处理组（漱口水）和对照组的孔中加入2.5 ml稀释的培养基（步骤3.2）；向无菌对照孔中加入2.5 ml无菌未接种的生物膜生长培养基。
  5. 在微需氧条件下培养生物膜。将培养皿置于摇床中，于培养箱内以100 rpm转速振荡培养。 37 °C 24 小时。
  6. 24 小时后，无菌条件下吸除所有孔中的培养基，用无菌 PBS 洗涤两次（步骤 1.4；每孔 2.5 ml），每次洗涤后吸除 PBS。每孔补充 2.5 ml 新鲜的生物膜生长培养基，在与前一步相同的条件下继续孵育 24 小时，使生物膜总生长时间达到 48 小时。
  7. 作为上述步骤的替代方案，可使用既定方案在基质上培养其他物种的生物膜。

4. 抗菌/漱口水处理

  1. 生物膜生长完成后，吸除培养基。
  2. 在处理组孔中加入 2.5 ml Biotène PBF (BIO) 或 Listerine Total Care (LTO) 漱口水，或其他处理方式；对照组孔中加入 2.5 ml 无菌超纯水。按照生产商说明，将样本浸入液体中 60 秒，同时在 150 rpm 条件下使用旋转摇床振荡。立即从各孔中吸除漱口水和超纯水。
  3. 使用无菌超纯水在 150 rpm 的旋转摇床上对样本进行 5 次洗涤，每次洗涤 15 秒，每次洗涤后吸除水分。
  4. 除上述步骤外，也可根据既定方案测试其他抗菌剂。

5. 染色

  1. 准备用于生物膜分析的染色液稀释液。
    1. 用 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液（pH 8.3）配制 5 mg/ml 的刀豆蛋白 A-Alexa Fluor 647 偶联物（AF）储备液。将储备液分装成单次使用量，于 -20 °C 保存数月；避免反复冻融。使用该 AF 储备液，在 TC 缓冲液中稀释至 250 μg/ml。
    2. 按照生产商提供的 5 mM Syto 9 储备液（SY），用 TC 缓冲液稀释成 10 μM 工作液。剩余的 SY 储备液于 -20 °C 保存数月。
    3. 按照生产商提供的 5,000 倍浓缩的 Sypro Red 储备液（SR），用无菌超纯水稀释 10 倍。剩余的 SR 储备液于 -20 °C 保存数月。
  2. 用 TC 缓冲液（每孔 2.5 ml）对所有生物膜样本进行两次洗涤，手动轻轻旋转混匀，第二次洗涤液在板中室温静置 30 分钟，随后吸除液体。
  3. 在每个生物膜样本上加入 50 μl AF 染色液，室温避光染色 30 分钟。用 TC 缓冲液（每孔 2.5 ml）洗涤两次，每次洗涤后吸除液体。
  4. 随后在每个生物膜样本上加入 50 μl SY 染色液，室温避光染色 30 分钟。用无菌超纯水（每孔 2.5 ml）洗涤两次，每次洗涤后吸除液体。
  5. 最后在每个生物膜样本上加入 50 μl SR 染色液，室温避光染色 30 分钟。用无菌超纯水（每孔 2.5 ml）洗涤三次，每次洗涤后吸除液体。
  6. 将样本转移至 6 孔板中，每孔放置一个样本，并加入 6 ml 无菌超纯水，以便进行共聚焦显微镜观察。

6. 使用共聚焦激光扫描显微镜进行成像

  1. 使用共聚焦激光扫描显微镜对处理组和对照组生物膜中各组分（染色）进行成像，显微镜设置参数见表1。本研究采用63倍水浸物镜，数值孔径为0.9，工作距离为2.2 mm。
    生物膜染色图表；EPS、核酸、蛋白质的激光波长（nm）和发射波段（nm）
    表1. 共聚焦激光扫描显微镜设置参数。

  1. 将扫描尺寸设置为 250 μm x 250 μm 最小像素分辨率为 512 × 512，以获取适用于定量分析的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像。
  2. 使用SY染料确定生物膜图像堆栈的顶部和底部位置，然后将z轴步长设置为适合定量分析的数值（0.6 μm 本研究）。在采集扫描图像前，优化图像和染色参数（即 使用QLUT选项调整PMT电压和偏移量。采用颜色查找表为每种染料分配伪彩色（SY为绿色，SR为红色，AF为蓝色），以便在三维重建中更清晰地区分各生物膜组分。
  3. 以400 Hz的速率，采用“堆栈之间”模式进行连续扫描，采集CLSM图像，以优化同一生物膜内多种染色的成像效果。

7. 生物膜结构分析

  1. 使用图像分析软件对采集的共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）生物膜图像进行分析。以下步骤描述了如何使用 ISA3D 软件12计算所采集生物膜图像的结构参数。
    1. 按照软件手册中的说明，将每个生物膜的 CLSM 图像文件复制到“Images”文件夹中。确保遵循软件要求的 CLSM 文件命名规范。该软件支持以批处理模式分析子文件夹中的文件，从而便于在同一运行中同时分析处理组和对照组的生物膜。
    2. 在主对话框的 dxy 和 dz 字段中输入 CLSM 图像的 x、y 和 z 轴尺寸。根据软件手册中的说明选择阈值和距离映射设置（本研究分别采用 Otsu 和准欧几里得方法）。为结果文件输入合适的名称，然后运行程序。结果文件将生成在 ISA 文件夹中。
    3. 查看结果文件，获取二十个三维结构参数12的数值，例如生物体积和平均生物膜厚度（本研究中测量的参数），这些参数用于量化生物膜内各组分（染色剂）的三维分布情况。

8. 生物膜结构的可视化

  1. 使用图像分析软件创建生物膜内各叠加组分（染色）的重建图像。以下步骤描述了如何使用 Volocity 软件生成三维重建图像。
    1. 按照操作手册中的说明，将共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像文件导入软件，为每个生物膜创建图像库。
    2. 使用“3D Renderer”菜单选项，基于每个生物膜的 CLSM 图像生成三维重建图像（本研究采用 HR 不透明度格式）。
    3. 旋转三维图像，使所有生物膜在 x、y 和 z 坐标轴方向上保持一致的取向。获取正确取向的生物膜重建图像快照，并以 TIFF、JPEG 或其他合适格式导出该图像。
  2. 在重建图像上对生物膜内胞外聚合物（EPS）、蛋白质和核酸组分的共分布情况进行目视分析。
  3. 采用 Pearson 相关系数和 Manders 重叠系数对多个生物膜组分进行共定位分析（本研究未进行共定位测量）。

9. 统计分析

  1. 采用独立的混合模型统计分析方法比较漱口水组与对照组之间结构参数的平均值（α=0.05）。本研究使用 SAS 软件进行统计分析。

结果

不同处理（漱口水）组与未处理对照组的代表性结果见表2以及图1和图2。表2列出了使用ISA3D软件计算得到的生物膜结构参数——生物膜体积（μm3）和平均生物膜厚度（μm）的平均值及标准差。经漱口水处理后的生物膜，若其结构参数与对照组相比存在显著差异（p<0.05），则其平均值与标准差以红色标出。混合模型统计分析结果显示，在两种树脂复合材料上，BIO漱口水处理组的生物膜结构均与对照组存在显著差异（p<0.05），而LTO漱口水处理组在任一种树脂复合材料上均未产生显著差异（p>0.05）。结果明确表明，两种漱口水处理后残留的细胞及胞外生物膜组分存在差异。此外还应注意，尽管在相似条件下培养且两种基底材料（PF和TP）均使用相似磨料进行抛光，S. mutans在两种基底上形成的生物膜在三维结构上仍存在差异。

通过使用 Volocity 软件生成的三维重建图像，可以直观展示生物膜中胞外多糖（EPS）、蛋白质和核酸的共分布情况。图1和图2分别为在PF和TP树脂复合材料上生长的对照组生物膜的代表性三维重建图像。蓝色荧光标记代表S. mutans生物膜中的胞外多糖，绿色荧光标记显示核酸，红色荧光标记显示蛋白质。未被标记的区域可能被水或其他未进行荧光标记的生物膜组分占据。

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图 1. 对照组中（未经漱口水处理）在PF树脂复合材料表面生长的S. mutans生物膜的代表性三维重建图像。 在单个生物膜中同时叠加三种染色信号，可实现对S. mutans生物膜中胞外多糖（蓝色染色）、核酸（绿色染色）和蛋白质（红色染色）组分的同步可视化观察。（1单位 = 24 μm）。 点击此处查看高清大图。

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图2. 对照组中（未使用漱口水处理）TP树脂复合材料表面生长的S. mutans生物膜的代表性3D重建图像。 在单个生物膜中同时叠加三种染色信号，可实现对S. mutans生物膜中胞外多糖（蓝色染色）、核酸（绿色染色）和蛋白质（红色染色）组分的同步可视化。（1单位 = 24 μm）。 点击此处查看高分辨率图像。

树脂复合材料Point 4TPH3
漱口水组分BV (μm3)MT (μm)BV (μm3)MT (μm)
Biotène PBF核酸279,517±53,2919.32±2.80195,033±42,0147.45±3.70
EPS344,902±56,38635.22±17.19197,840±62,3519.83±7.26
蛋白质298,796±62,86854.21±21.65216,033±66,65424.33±39.64
Listerine Total Care核酸355,707±110,44426.45±14.21273,296±47,32313.43±2.89
EPS494,099±180,59264.90± 26.68329,150±47,14534.35±30.32
蛋白质348,416±161,31658.68±47.28303,150±54,70534.18±41.46
对照（未经处理）核酸388,375±42,15251.15±40.66327,809±39,40017.08±1.65
EPS660,448±173,19791.37±74.84363,850±67,61228.33± 15.07
蛋白质517,274±119,475127.96±73.84353,161±56,51821.17±4.41

表2. 经BIO或LTO处理或未处理（对照组）生物膜的生物体积（BV）和平均生物膜厚度（MT）的平均值与标准差。 与对照组生物膜相比，经漱口水处理后生物膜结构参数差异具有统计学意义（p<0.05），其平均值与标准差以红色标出。

讨论

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像的获取必须以适合生物膜定量和共定位分析的方式和格式进行，以确保每幅图像中信号强度的分布能够可靠地反映生物膜堆栈中各荧光染料的分布情况。信号强度应可与噪声和背景相区分10,11，不受基底自发荧光的影响，并且所用荧光染料之间的光谱干扰应尽可能减少，以避免串色（bleed-through）11。噪声是荧光显微镜不可避免的局限性11，图像质量有时会因技术或操作上的原因而受限。选择光谱重叠最小的荧光染料对该方法的成功至关重要，但这一过程可能较为复杂。此外，多种荧光染料的定量分析本身是一个多因素问题。因此，很少有研究能够成功实现对生物膜结构中两种以上组分同时分布的定量分析，这一点并不令人意外。

本研究的目的是报告一种由不同但相互关联的步骤组成的方法学，用于量化和比较生物膜内三种细胞及细胞外组分的同步三维分布。所述生物膜生长实验可在相关基质上促进生物膜生长，并产生可重复的生物膜结构，这一点已由所报道的结果证实。 表1结合新型的EPS、蛋白质和核酸组分同步染色技术与三维生物膜结构参数的测量，可获得生物膜内各组分的可量化分布。通过重建各生物膜内叠加染色图像，可对EPS、蛋白质和核酸在生物膜中的共定位分布进行定性可视化分析。ISA3D软件12 包含多个独特的结构参数，如分形维数、均质性和生物膜粗糙度系数，以及传统的测量参数，如孔隙率和生物膜厚度，以增强对生物膜三维结构的量化分析。对生物膜结构参数进行统计学分析，有助于在特定实验条件下对生物膜进行相关比较，例如抗菌/抗污效能评估。例如 使用漱口水后（时间效应）或随时间变化（时间效应）。

该方法高效且成功地定量并比较了在相关基质上生长的S. mutans生物膜中三种主要组分的同步三维分布，从而克服了同时评估生物膜组分的两大挑战。该方法还可用于确定抗菌处理或防污措施对多种生物膜组分的效果，本研究中以漱口水的应用为例进行了展示。此外，上述大部分实验方案均可替换为相关基质制备及相应微生物生物膜生长检测的方案。因此，该方法具有广泛的应用前景，可促进医学、牙科、地质学和海洋科学等多个领域中体外（in vitro）和体内（in vivo）生物膜三维结构/构架的比较研究。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。本文的制作与免费访问由徕卡显微系统公司赞助。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院/国家牙科与颅面研究所资助，项目编号为1R15DE019566-01A1。感谢吉姆·亨索恩博士（俄克拉荷马大学健康科学中心流式与成像细胞术实验室）在共聚焦激光扫描显微镜技术方面提供的技术支持。感谢费尔南多·埃斯特班·弗洛雷斯博士（牙科材料学系）在本视频拍摄过程中提供的技术协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Bacto 琼脂Becton, Dickinson and Company214010
Bacto Todd Hewitt 肉汤Becton, Dickinson and Company249240
酵母提取物，颗粒状EMD Millipore1.03753.0500
Bacto 胰蛋白胨Becton, Dickinson and Company211705
OmniPur 蔗糖EMD Millipore8510
氯化钾，ACS级试剂，99.0-100.5%Sigma-AldrichP3911-500G
磷酸二氢钾 ≥99.0%，ACS 试剂Sigma-AldrichP0662-500G
氯化钠Sigma-AldrichS9888-500G
磷酸二氢钠一水合物EMD MilliporeSX0710-1
三(羟甲基)氨基甲烷，99.8+%，ACS 级试剂Sigma-Aldrich252859-500G
刀豆球蛋白A，Alexa Fluor 647偶联物InvitrogenC21421
Syto 9InvitrogenS34854
Sypro RedInvitrogenS12012 或 S6653
Biotèneène PBF 口腔漱液GlaxoSmithKlineN/A
李施德林全效护理McNeil-PPC, Inc.N/A

参考文献

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