自由活动小鼠中穿通通路-齿状回突触的长时程增强

摘要

转基因和基因敲除神经疾病小鼠模型有助于研究基因在正常与异常神经生理功能中的作用。本文描述了可用于研究转基因和基因敲除自由活动小鼠中长时程增强作用的方法，长时程增强是一种可能构成学习与记忆基础的细胞机制。 神经病理学行为学小鼠模型

摘要

突触效能的长时程增强（long-term potentiation）是一种依赖于神经活动的突触现象，其特性使其成为学习与信息存储潜在细胞机制的有力候选。长期以来，研究人员利用该现象来阐明海马体、杏仁核及其他边缘系统和皮层结构中多种神经回路的生理特性。基于此，神经系统疾病的转基因小鼠模型为开展长时程增强研究提供了有效的实验平台 长时程增强（LTP）研究有助于深入理解基因在学习、情绪和信息处理相关神经网络中正常与异常突触传递中的作用。本文介绍了在自由活动小鼠中可靠诱导LTP的方法学，这些方法可用于转基因和基因敲除自由活动小鼠的研究。 神经退行性疾病的行为学小鼠模型

引言

基因操作技术的发展已几乎为所有神经退行性疾病和神经系统疾病建立了转基因和基因敲除小鼠模型。这促使以往用于较大啮齿类动物的电生理学研究技术必须向小鼠动物模型转化。其中一种神经生理学研究技术是利用长时程增强（LTP）来检测参与多种神经病理学障碍的神经元网络中突触连接的有效性。本方案描述了在自由活动小鼠中进行可靠电生理学LTP研究的技术。与其它方法相比，本方案的优势在于操作简单、易于实施；成本也相对较低，因其无需使用昂贵的计算机控制微驱动系统或场效应晶体管头部放大器；据我们所知，这是首个针对自由活动小鼠进行慢性电生理记录以研究LTP的视频方案。为此，本文详细介绍了在自由活动小鼠中研究长时程增强的简便方法。这些方法可直接应用于神经病理学障碍的转基因和基因敲除小鼠模型。

方案

本方案适用于年龄为3至18个月、体重大约为30-50 g的小鼠。小鼠可从杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，缅因州巴港）获得。所有手术和实验方案均经三一学院动物护理与使用委员会批准，并符合《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》。

1. 动物准备与手术操作

1. 配制麻醉混合液，包含氯胺酮（25 mg/ml）、赛拉嗪（2.5 mg/ml）和乙酰丙嗪（0.5 mg/ml）。按每公斤体重1 ml的剂量注射至腹部右下象限，并在之后每45分钟追加0.2 ml/kg的剂量，以通过足底回缩反射维持稳定的麻醉深度 。
2. 使用电动剃毛器剃除小鼠颅骨区域的毛发，以准备手术。剃毛范围应从两眼中间延伸至两耳中间。注意避免剃除胡须，因其属于小鼠桶状感觉系统的一部分。
3. 使用棉签将异丙醇涂抹于已剃毛的头部区域，随后再涂抹聚维酮碘。然后，同样使用棉签在眼睛上涂抹少量矿物油，以防止眼球干燥。
4. 使用幼鼠耳套替代常规耳杆，将动物头部固定在立体定位仪装置上。操作时，先将左耳固定于左侧耳套中，然后一手轻扶动物头部，另一手缓慢推进右侧耳套，将右耳轻轻置入。接着，在动物身体下方放置加热垫，并将其设定为86 °F，以维持体温。
5. 通过尝试左右移动头部来检查双侧刚性。当头部完全固定、无法左右移动但可轻松上下转动时，表明动物已正确安装在立体定位仪上。
6. 轻轻将小鼠的吻部置于鼻/齿杆组件上，确保门齿轻柔而稳固地嵌入鼻/齿杆的齿孔中。
7. 使用无菌手术刀，从两眼中间至两耳中间做一条正中切口。操作时应保持手术刀呈45°角，并施加足够压力以切开下方筋膜，但不得穿透颅骨，以免引起过度出血。
8. 使用棉签分离筋膜并暴露颅骨。颅骨标志点bregma和lambda应清晰可见（图 1A）。通过调节鼻/齿杆，使bregma与lambda处于相同的背腹（DV）位置（+ 0.1 mm），以确保动物处于颅骨水平位。
9. 在暴露区域滴加少量无菌生理盐水，并用棉签轻轻清洁颅骨。随后等待2–3分钟 ，使颅骨完全自然干燥后再继续操作。
10. 将一根针固定在左侧立体定位臂上，用于测量bregma和lambda的背腹（DV）位置。这两个标志点的DV坐标应相差不超过0.1 mm。若不符合，可通过上下调节立体定位仪的鼻杆进行校正。
11. 将针尖置于bregma处，记录其前后（AP）、左右（LAT）和背腹（DV）坐标。注意针尖仅接触颅骨表面，不得刺入。
12. 使用小鼠脑图谱（如《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates》¹），确定目标结构的坐标：相对于lambda的海马角束内侧穿通路径（mPP）和相对于bregma的齿状回（DG）（另见表1）。然后使用细尖笔或铅笔在颅骨上标记这些点。
13. 在颅骨对侧再标记两个点，分别作为接地（GND）和参考（REF）电极位置，距离中线约3 mm，并沿纵向相互对齐（图 1A，另见表1）。
14. 从左侧立体定位臂上取下针状标记物，更换为配备立体定位支架的电动牙科钻。将钻头对准每个标记点，钻出直径约0.5 mm的小孔。钻孔时采用重复的上下运动，并频繁检查是否已穿透颅骨以暴露脑表面。
15. 在对侧两个孔（GND和REF）中，牢固而轻柔地旋入螺钉电极（#0-80 1/8英寸不锈钢机械螺钉，槽型圆头），使其刚好接触皮层表面但不穿透（图 1A）。这两个螺钉电极分别作为接地和参考电极。
16. 将刺激电极和记录电极分别安装在左侧和右侧立体定位臂的电极夹持器中。
17. 将刺激电极的接线端连接至带有电流隔离功能的电生理刺激器，将记录电极的接线端连接至电生理差分放大器（增益 = 1,000，带通滤波器 = 1 Hz–3 kHz），再连接至数字示波器以目视检查诱发电位。 同时，将GND和REF电极的接线端连接至差分放大器。
18. 以0.5 mm为步长，缓慢而轻柔地下降刺激和记录电极，同时观察对600–800 µA刺激脉冲的诱发电位反应。持续下降电极，直至达到各自的目标背腹（DV）位置，并在示波器上观察到典型信号（图 1B）。
19. 随后，使用牙科丙烯酸树脂水泥制作固定帽，以固定电极接线端；任何接触皮肤的牙科水泥应立即擦除。 待牙科水泥完全固化后，将动物从立体定位仪转移至清洁的啮齿类动物笼中，并使用加热灯或加热垫维持核心体温。
20. 每小时监测动物一次，直至其恢复意识。可注射氟尼辛作为镇痛剂。

2. LTP 诱导

1. 让动物术后恢复 5-7 天。将动物放入记录环境，该环境由一个法拉第笼（122 cm × 43 cm × 43 cm）构成，笼内配有隔音材料，并通过一个 5 通道旋转换向器将电极导线连接至刺激/记录装置。
2. 在连接电极至刺激与记录仪器前（参见步骤 1.17），让动物在记录环境中适应 1-2 小时。
3. 将刺激器设置为输出 400 µA，记录约 10 次诱发电位的平均幅值，确保每次刺激之间至少间隔 10 秒 。采用图 1C所示方法对诱发电位进行量化。重复此操作，依次测试 600、800、1,000、1,200 和 1,400 µA 的刺激强度。
4. 通过绘制诱发电位平均幅值随刺激强度变化的曲线，构建输入/输出曲线。根据该曲线确定对应于最大幅值 50% 的刺激强度，并在后续实验中使用该 50% 强度。
5. 随后，使用 50% 的刺激强度，每分钟记录 5 次诱发电位的平均幅值，持续 15 分钟，以获取基线数据 。同样需确保每次刺激之间至少间隔 10 秒 。
6. 接着，向内侧穿通通路施加强直刺激，参数为：共 10 组，每组 10 个脉冲，频率为 400 Hz，组间频率为 5 Hz。密切观察动物是否出现癫痫发作迹象，包括“湿狗抖动”。若动物发生癫痫，应立即终止实验，并将该动物的所有数据从研究结果中剔除。
7. 然后，在强直刺激后继续每分钟记录 5 次诱发电位的平均幅值，持续 30 分钟 。之后，通过计算相对于步骤 2.5 所得基线幅值的百分比变化，比较该幅值与基线（图 2）。
8. 实验结束后，通过吸入异氟烷对动物实施安乐死，该方法符合美国兽医医学协会《安乐死指南》的规定。

结果

表1列出了本方案中使用的齿状回（DG）和内侧内嗅皮层（mPP）的坐标。图1A显示了颅骨上目标结构的定位标记，同时展示了接地电极和参考电极的位置。图1B展示了同一动物在强直刺激前和强直刺激后的代表性诱发电位轨迹。请注意，强直刺激后的诱发电位幅度大于刺激前，表明长时程增强（LTP）已被成功诱导²。图1C说明了用于量化反应幅度的方法。实际上，图2展示了在强直刺激前后时间段内反应幅度随时间变化的百分比。值得注意的是，LTP峰值超过100%。强直刺激后反应幅度增强的结果表明，该方案在自由活动的小鼠模型中研究LTP是成功的，因而具有可靠性。

讨论

在本实验方案中，我们展示了一种可靠且简便的方法，用于在自由活动的小鼠中研究齿状回（DG）的长时程增强（LTP）。尽管已有大量关于清醒大鼠LTP的研究^3,4，但在清醒小鼠中开展的研究却极为有限，主要原因是小鼠颅骨可用空间较小，且电极头端装置的重量相对于小鼠的平均体重带来了较大的技术挑战⁵。少数在自由活动小鼠中成功展示DG区LTP的研究，均采用了微型驱动电极系统或在头端集成结型场效应晶体管（jFET）前置放大器的方法，而这必然会增加动物所承受的电极负载负担^6-10。本方案的重要意义在于，相较于现有方法，它在诱导自由活动小鼠DG区LTP方面实现了改进，避免了使用微型驱动电极系统或头端jFET装置。

需要重点强调本实验方案中的关键步骤，包括：1）将小鼠头部固定于立体定位仪框架中，确保其双侧稳固（此步骤可能是最具挑战性的，因其需要操作者具备熟练的技巧和对该技术的熟悉）；2）为最大化反应幅度，应优化电极的放置位置，可通过调整立体定位仪的门齿杆，使前囟（bregma）与后囟（lambda）处于同一水平面，通常要求两者在背腹方向上的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮（100 mg/ml）	Henry Schein	10177
赛拉嗪（20 mg/ml）	Henry Schein	33197
乙酰丙嗪（10 mg/ml）	Henry Schein	2177
牙科丙烯酸粉末	Lang Dental Manufacturing Co.	1330CLR
牙科丙烯酸液体	Lang Dental Manufacturing Co.	1306CLR
钨丝（0.127 mm）	World Precision Instruments	TGW0515
不锈钢皮下注射管（0.286 mm）	World Precision Instruments	832400
氟尼辛（50 mg/ml）	Henry Schein	14165
Epoxilyte	Superior Essex	EP 6001-M
不锈钢导丝插件（0.2 mm）	World Precision Instruments	792900
立体定位仪装置	Kopf Instruments	Model 902
耳杆（耳杯）	Kopf Instruments	Model 921
电生理刺激器	Astro-Med, Inc.	S88
数字示波器	B K Precision Corp.	2542
电流隔离单元	Astro-Med, Inc.	PSIU-6
差分放大器	World Precision Instruments, Inc.	DAM-50
换向器	Plastics One	SLC6
牙科钻	Stoelting	58650