高分辨率整体成像 原位 斑马鱼胚胎杂交技术用于研究基因表达与功能

摘要

斑马鱼是一种小型热带鱼，已成为研究脊椎动物发育和疾病过程中基因功能的常用模型。通过以下方法可确定目标基因的时间和空间表达模式： 原位 杂交。我们改进的方案能够检测丰度较低的转录本，同时降低非特异性背景信号。

摘要

本文重点介绍整体装片 原位 斑马鱼胚胎的原位杂交（WISH）。WISH技术有助于评估基因表达在组织分布和发育阶段两个方面的特征。本文描述了使用地高辛标记的反义RNA探针进行斑马鱼胚胎WISH的实验方案。探针通过将地高辛标记的核苷酸掺入到转录过程中而生成 体外 对已克隆并线性化的基因模板进行转录。在特定发育阶段收集的胚胎，需先去除卵膜，再与特异性探针孵育。经洗涤步骤去除多余探针后，将胚胎与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体孵育。通过使用碱性磷酸酶的显色底物，可检测特定基因的表达情况。根据基因表达水平的不同，整个实验过程可在2至3天内完成。

引言

斑马鱼（Danio rerio）已成为研究脊椎动物发育、疾病、行为以及药物筛选的强有力动物模型^1-3。单次交配即可获得大量斑马鱼胚胎。其受精和发育过程在体外（ex utero）进行，胚胎具有良好的光学通透性且发育迅速。关键的发育事件发生在受精后的前48小时（hpf）内，包括器官原基的出现和细胞分化的启动。通过在单细胞或双细胞期（0.75 hpf）向胚胎显微注射反义吗啉代寡核苷酸（MO）或mRNA，可分别实现蛋白质的表达敲低或过表达。

斑马鱼胚胎的原位杂交（WISH）有助于研究特定目的基因的时空表达模式。在对胚胎进行mRNA或吗啉代寡核苷酸（MO）显微注射以过表达或敲低特定蛋白水平后，应用WISH技术可揭示其他基因的差异性调控情况。

基因表达模式的变化可与表型变化相关联，并揭示早期器官发生过程中靶基因的功能。由于探针可预先制备并储存，利用六孔板和自制的篮子，原位杂交（ISH）技术可同时检测至少20个基因的表达模式。

....

方案

1. 整体装片 原位 斑马鱼胚胎杂交

1.1 胚胎的制备

1. 在所需发育阶段收集胚胎。请参见 Kimmel 等.5 用于描述胚胎发育阶段。
2. 使用镊子（Dumont 钟表匠镊子 5 号）手动去除卵膜。
3. 在4 °C下，用PBS（磷酸盐缓冲盐水）配制的4%多聚甲醛（PFA）溶液固定胚胎，过夜。
4. 用 PBS 在室温下清洗胚胎，每次 5 分钟，至少重复 3 次。
5. 将胚胎保存在 -20 °C 的 100% 甲醇（MeOH）中，直至后续用于整装标本等实验技术 原位 杂交。
6. 将处于不同阶段的胚胎在液氮中冷冻，用于RNA提取，并于-80 °C保存。
7. 从不同发育阶段的胚胎中提取RNA，并合成cDNA用于PCR扩增及后续克隆。

1.2 地高辛标记RNA探针的合成

1. 探针模板的PCR扩增与基因克隆。按照表1所示配制总体积为50 μl的PCR反应体系。在PCR反应中用作模板时，基因组DNA的用量应较多，cDNA的用量应较少。最后一个循环结束后，在72 °C延伸10分钟，以确保PCR产物全长且3'端带有腺苷酸化修饰，从而有利于TOPO克隆。

结果

采用每篮50个胚胎（每个基因/每种实验条件）的方案，可在一次实验中获得该基因的表达模式。对于特定基因，几乎所有胚胎均显示出相似的表达模式。原位杂交染色的代表性结果如图3-6所示。

正义与反义核糖探针均从对应于 PC5.1 和 PC5.2 的 cDNA 合成⁶SCL/tal-1⁷, gata-1^8,9，flk/kdrl¹⁰，shh¹¹，dlx2¹²，fkd7/foxa1¹³胰岛素^14,15和胰蛋白酶¹⁶ 通过使用Taq DNA聚合酶扩增全长mRNA的一段序列，构建了克隆并插入pCRII-TOPO载体（Invitrogen）。各个扩增产物的真实性通过测序确认。在验证克隆方向后，按照相应方案合成对应的反义RNA探针¹⁷ 经修改^18,19 如文中所述，使用 Sp6 或 T7 RNA 聚合酶。整体染色标.......

讨论

我们已开发出可高分辨率可视化 RNA 的改进方法。原位杂交实验采用底部带孔的自制篮子进行（图 1）。胚胎在无RNA酶溶液中处理，于室温下在6孔板中无菌操作。

为了区分胚胎，使用不同颜色的Eppendorf管制作篮子。使用有边缘或无边缘的篮子便于定位，并识别篮子内的胚胎所对应的特定探针。

在65 °C下预杂交和在70 °C下杂交，同时使用50%去离子甲酰胺，对于获得高分辨率信号尤为关键。此外，在与抗DIG抗体孵育后，经PBST洗涤，再用碱性Tris缓冲液孵育胚胎两次，每次15分钟。 和 在含有BCIP和NBT的条件下孵育之前进行适当的处理，有助于获得高质量且清晰的信号。在我们的实验中发现，胚胎的透化和固定时间的精确控制，以及在70 °C下进行杂交，对于获得清晰信号至关重要。透化不足会导致背景信号升高；透化时间过长或固定不充分会引起胚胎降解，而固定时间过长则会抑制信号的检测。在55–60 °C之间进行杂交同样会产生较高的背景信号。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Taq DNA聚合酶	Invitrogen	10342053
TopoTA 克隆试剂盒- 双启动子 pCRII-TOPO	Invitrogen	K4650-01
HQ Mini 质粒提取试剂盒	Invitrogen	K2100-01
琼脂糖	罗氏	11 685 660 001
Not1 和 HindIII 限制性内切酶	Invitrogen	15441-025, 15207-012
超纯缓冲饱和酚	Invitrogen	15513039	4°C 保存 °C. 对眼睛、皮肤和呼吸道有刺激性，且可能具有致癌性。操作时应小心谨慎。
氯仿	Fisher	C607-1	有毒且疑似致癌物。请在通风橱中操作。
无RNase的DNA酶I	罗氏	4716728001	分装成小份并置于 -20 保存°C.
DIG-RNA标记混合物（含Sp6、T7和T3 RNA聚合酶）	罗氏	11277073910
RNase 抑制剂	罗氏	10777-019
3.0 M 醋酸钠 (pH 5.5)	Fisher	50-751-7355
100% 乙醇	商用酒精
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma	40718-25ML	DEPC 对眼睛、皮肤和呼吸道具有刺激性。避免与皮肤和眼睛接触。使用安全眼镜、手套和口罩。
NaOH	Fisher	SS255-1
EDTA 0.5 M（pH 8.0）	Fisher	50-751-7404
Instant Ocean Salt	Aquarium Systems	N/A
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher	FL-03-0900
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148-1KG	在 -20 ℃ 下准备并保存°分装为40 ml等份，以备后续使用。PFA具有毒性，操作时需佩戴护目镜、手套和防尘口罩。
苯硫脲（Phenylthiocarbomide, PTC）	Sigma	P7629-25G	PTC 具有高毒性。使用时需佩戴护目镜、手套和防尘口罩。
甲醇	Fisher	A947-4
杜蒙（钟表匠）’s) 镊子型号5号	Fine Science Tools
六孔细胞培养板	Sarstedt	83.1839
篮子由尼龙网和Eppendorf管制成	自行制备		制作篮子时，将Eppendorf管（1.5 ml）剪去锥形末端，可保留或不保留管口边缘。将尼龙网剪成与管口大小相应的小片 Eppendorf管被剪开的末端。将尼龙网覆盖在剪开末端的试管放置于电热板上 加热板加热至试管和尼龙网粘合在一起（在通风橱中操作）。剪去篮子上多余的网膜，并将其保存在100%甲醇中备用。
聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）	Sigma	P1379-500ML
蛋白酶K	Fermentas	EO0491
乙酸酐	Sigma	242845
三乙醇胺	Sigma	90279-100ML
甲酰胺，高纯度级	Sigma	F9037
AG501-X8 树脂	Bio Rad	142-6424
柠檬酸一水合物	Sigma	C0706-500G
肝素钠盐	Sigma	H3393-25KU
盐水-柠檬酸钠缓冲液（SSC）	Sigma	S6639
酿酒酵母tRNA，X型	Sigma	R5636-1ML
NaCl	Fisher	S640-500
Tris-HCl	Fisher	BP153-1
MgCl₂2	Fisher	S25403
盐酸左旋咪唑	Sigma	31742
N,N-二甲基甲酰胺 无水（DMF）	Sigma	227056	刺激性、有毒、易燃，且疑似致畸物。操作时应穿戴适当的防护装备，包括手套和护目镜。
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）	Sigma	N6639	避光保存此溶液。
硝基蓝四唑（NBT）	Sigma	840W	避光保存此溶液。
牛血清白蛋白，纯化组分V（BSA）	Sigma	A8806
羊抗地高辛-碱性磷酸酶 Fab 片段	罗氏	1093274910
甘油	Sigma	G5516-500ML
96孔细胞培养板	Sarstedt	83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2	ZIRC	Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean	Aquarium Systems	N/A