一种用于制备天然去细胞肠道基质的脱细胞方法

摘要

本文描述了一种从大鼠肠道制备无细胞基质的方法。肠道支架的构建对于组织工程、干细胞生物学以及药物测试等未来应用具有重要意义。

摘要

成功的组织工程涉及将支架与合适的细胞相结合 体外 或 体内支架可以是合成的、天然来源的，或来源于组织/器官。后者通过一种称为脱细胞化的方法获得。脱细胞化可能涉及物理、化学和酶法处理的组合。该技术的目标是在保留原始组织宏观和微观结构的同时，彻底去除所有细胞残留。

迄今为止，肠道组织工程所使用的支架相对简单，无法复制天然器官的复杂结构。本文旨在介绍一种高效的大鼠小肠脱细胞技术。文中描述了小肠的分离方法，以确保维持血管连接的完整性。同时阐述了采用化学与酶解溶液相结合的方法，在保留支架腔面绒毛-隐窝轴结构的同时去除细胞成分。最后，讨论了对所制备支架是否具备适宜特性的评估方法。

引言

组织工程（TE）为器官移植提供了一种替代治疗方案，可避免免疫抑制和器官短缺等问题。近年来，组织工程已在临床中取得成功应用，实现了膀胱¹、尿道²以及气管等器官的替代，这些应用既包括成人^3,4，也包括儿童⁵。

构建组织工程器官需要将支架与适当的细胞相结合。支架可通过天然来源（例如 胶原蛋白）和合成材料（例如 聚-L-乙醇酸；PLGA）制备，也可通过脱细胞化天然器官和组织获得。迄今为止用于肠道组织工程的支架主要为脱细胞化材料（小肠黏膜下层）或合成材料（聚-L-乙醇酸和聚乳酸）^6-13。这些生物材料在宏观和微观结构上均较为简单，可能不利于组织工程肠道的临床转化。理想的肠道生物材料应具备可与宿主血液供应相连接的固有血管网络、具有不同特性的分层管状壁以模拟肠道壁的各层结构，以及管腔侧具有绒毛-隐窝轴，以促进上皮干细胞的再定植。

脱细胞化是一种新兴方法，通过去除完整器官中的细胞而保留其原有结构，从而制备支架¹⁴。这种方法优于现有的支架，因为它不仅复制了器官的结构，还保留了细胞外基质（ECM）中嵌入的化学信号，这些信号有助于细胞增殖和分化。2008年，一条来自尸体的气管被脱细胞化处理¹⁴，接种患者自体细胞后，成功移植用于替代一名年轻男子的左主支气管³。自那时起，多个研究团队已在小型和大型动物中报道了用于心脏¹⁵、肝脏^16,17和肺脏^18-20的脱细胞化支架的制备。

我们还采用相同的方法制备了小肠脱细胞支架²¹。本文所述方法的目标是制备能够维持原始组织宏观特征（如血液供应）以及肠腔内绒毛-隐窝轴微观结构的脱细胞肠道基质。我们认为，该方法最终可被应用于其他器官，以提高脱细胞效率。

方案

1. 大鼠肠道的分离

1. 配制1 L含1%抗生素/抗真菌剂（Sigma，英国）的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，Sigma，英国）（PBS/AA）。将蠕动泵（Masterflex L/S 可调速）连接两根管路，先以最大转速将70%乙醇（EtOH）泵入管路中运行15分钟，随后再以PBS/AA运行15分钟。
2. 根据当地动物实验指南和批准文件（在英国，遵循1986年《动物（科学程序）法》下内政部指南），通过吸入CO₂并实施颈椎脱位法处死体重约为250–350 g的成年Sprague-Dawley大鼠。
3. 使用前对所有手术器械进行高压灭菌。用70%乙醇喷洒并擦拭动物腹部。
4. 在腹部行剑突至耻骨联合的剖腹切口，以确保清晰的手术视野。
5. 将动物右侧的小肠取出并置于喷有70%乙醇的纸巾上。注意持续用PBS/AA润湿肠道，以防止组织脱水及细胞外基质（ECM）变性。
6. 定位从主动脉以90°角发出并通向肠道的肠系膜上动脉（SMA）。使用27 G套管从主动脉插入SMA，迅速撤出针芯以避免血管壁撕裂。将套管的塑料导管部分推进SMA内，并用缝线（Vicryl 5/0）固定。
7. 通过注入1 ml PBS/AA确认插管成功。使用弹簧剪在SMA近端和远端剪开主动脉，以释放套管。
8. 为防止在分离大肠时粪便泄漏，于回盲部近端和乙状结肠远端各结扎一道缝线（Silk 5/0）。在两结扎线之间切断回肠末端和结肠，并移除大肠。
9. 在空肠-十二指肠交界处切断肠道，并分离肠道与腹壁之间可能存在的所有结缔组织连接。
10. 将小肠转移至含有PBS/AA的培养皿中。使用塑料巴斯德吸管（LSL Laboratory Consumables）对肠道近端进行插管，并用缝线固定。剪裁吸管使其可适配60 ml注射器（BD Plastipak）的鲁尔锁接头。用60 ml PBS/AA冲洗肠腔2次，以清除粪便和碎屑。

2. 脱细胞方法

1. 将血管套管连接至三通旋塞阀。这将便于操作，减少对血管网络的张力，并有助于排除管路中的气泡。
2. 启动Masterflex L/S可调速滚轴泵，以0.6 ml/hr的速度泵入去离子水（电阻率18.2 MΩ/cm）。在将管路连接至肠腔旋塞阀之前，确保管路内无气泡。步骤1.9中可能在肠腔内残留少量气泡，这可能影响脱细胞过程。调节泵速并小心使用镊子操作组织，确保气泡从远端排出。在完成此过程前不得连接血管套管，因为高速可能导致血管网络受损。
3. 将装置转移至冷室，因为后续脱细胞步骤需在4 °C下进行。低温有助于去除细胞，同时最大限度减少组织降解。将培养皿置于可收集溢出液体的容器中，在0.6 ml/hr流速下，用去离子水（电阻率18.2 MΩ/cm）对肠腔和血管网络持续灌注24小时。在最初一小时内应定期检查装置，确保所有连接牢固、无明显泄漏，且肠内无气泡存在。
4. 经过去离子水处理24小时后，将脱细胞装置移出冷室，因为后续步骤在室温（RT）下进行。
5. 称取脱氧胆酸钠（Sigma，UK），用去离子水配制300 ml的4%溶液。应在抽吸罩下操作称量，因为脱氧胆酸钠对口腔和眼睛具有刺激性。使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。该溶液可在4 °C保存最多1个月。
6. 将去离子水更换为脱氧胆酸钠溶液，检查连接部位，排除任何气泡，并以0.6 ml/hr流速灌注4小时。
7. 脱氧胆酸钠处理后，用PBS/AA洗涤30分钟，以避免脱氧胆酸钠与DNase-I发生相互作用。
8. 称取脱氧核糖核酸酶-I（DNase-I，Sigma），用1 M氯化钠溶液（pH 7.4）配制250 ml的2,000 kU溶液。使用涡旋振荡器混合至溶液澄清。该溶液必须在使用前即刻配制，不可储存。
9. 在室温下以0.6 ml/hr流速灌注DNase-I溶液3小时。
10. 完成DNase-I处理后，将支架转移至组织培养超净台，并更换培养皿和器械。建议采用无菌操作技术。
11. 用PBS/AA洗涤30分钟，确保彻底清除所有脱细胞试剂残留。将支架置于新的培养皿中，并转移至紫外交联仪（Spectroline，US），运行两次灭菌循环。将支架储存于5% PBS/AA溶液中，并每3天更换一次溶液。

结果

脱细胞成功后（图1），支架在宏观上应与天然小肠相似，但管壁呈半透明状（图2A）。大体结构的保留还应通过血管树的通畅性得以体现。当通过肠系膜上动脉（SMA）插管注入染料时，染料应均匀分布于整个支架，并到达毛细血管网（图2B）。支架应无细胞核和细胞质残留，可通过DNA定量试剂盒和简单的组织学分析进行评估。苏木精-伊红染色（H&E）应显示细胞核和细胞质成分缺失，同时保留小肠各层结构（图3A）。特别是经扫描电镜观察，应能清晰看到腔面侧绒毛和隐窝结构的保留（图4）。此外，应预期保留细胞外基质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖。例如，Masson三色染色可显示支架中完整的结缔组织（图3B）。

图 1. 实验方案。 脱细胞处理的时间线；PBS/AA：含抗生素-抗真菌剂的磷酸盐缓冲液，NaDeoxy：脱氧胆酸钠，RT：室温，DNAse-I：脱氧核糖核酸酶-I。点击此处查看高清大图。

图 2. 支架的宏观特征。 大鼠小肠成功脱细胞后呈现的宏观外观 (A)。通过肠系膜上动脉（SMA）注入罗素朋斯红染料，显示完整的血管网络 (B)；SMA：肠系膜上动脉 点击此处查看高分辨率图像。

图3. 组织学。 H&E (A) 和 MT (B) 染色显示细胞成分缺失，而结缔组织结构得以保留；H&E：苏木精-伊红染色，MT：马松三色染色。比例尺：100 μm。 点击此处查看高分辨率图像。

图4. 电子显微镜观察。 扫描电子显微镜显示支架管腔内保留了绒毛-隐窝结构；比例尺：100 μm。点击此处查看高分辨率图像。

讨论

建立该实验过程中最困难的步骤包括肠系膜上动脉（SMA）的插管以及无菌状态的建立与维持。由于血管尺寸较小且位置较深，在啮齿类动物中进行SMA插管而不损伤血管壁具有较大难度。作为替代方案，可在SMA起始部近端的主动脉周围预先放置缝线，随后在远端插管主动脉，并将塑料导管引导进入SMA。在脱细胞过程中，导管位置不佳与高流速的联合作用可能导致血管通路丧失。由于小肠内存在大量细菌菌群，无菌控制是一个关键问题。收获后使用含抗生素/抗真菌剂的磷酸盐缓冲液（PBS/AA）进行冲洗至关重要，必须清除管腔内任何粪便残留或碎屑。在完成紫外线（UV）灭菌后，可将部分支架材料置于含DMEM培养基的Falcon管中并在培养箱内孵育，以此判断是否达到无菌状态。若出现细菌定植，培养基的pH值将发生变化，颜色由红色变为黄色。针对此情况，建议增加UV照射周期，并使用含有高浓度抗生素/抗真菌剂的PBS进行进一步冲洗。

若要获得同时具有动脉和静脉通路的支架，一种可能的改进方法是同时插管下腔静脉（IVC）和肠系膜上动脉（SMA）。对于所有三种溶液，应交替尝试从静脉侧和动脉侧进行脱细胞处理。持续进行脱细胞处理可能导致两侧均产生正压，从而破坏毛细血管。

多年来，人们在肠道组织工程领域尝试了多种不同的细胞-支架组合 体外 和 体内^6,9,12大部分工作采用的是涂覆了I型胶原的管状无纺95% PGA-5% PLGA支架^6,7,13,22在将肠上皮类器官单位（OUs）接种并植入小鼠网膜一段时间后，这些结构会形成外部为肌肉、内部为上皮的囊状物，随后可将其改造为管状结构。然而，由于这些支架结构的孔隙率和设计过于简单，无法支持生成较大尺寸的人工肠道 体外 例如生物反应器中的环境。此外，由于缺乏可与受体连接的固有血管网络，进一步限制了该支架在临床转化中的应用。除了PGA-PLGA支架的实验外，其他研究团队还使用了胶原蛋白或小肠黏膜下层（SIS）支架，但两者均未能复制肠道结构的复杂性。其中，SIS是此前唯一已发表的肠道组织工程技术方法，已在150多个医疗场景中得到应用，证明脱细胞支架能够提供机械稳定性并促进细胞生长，同时不会引发免疫反应。然而，由于缺乏适当的宏观与微观结构，其在肠道组织工程中的应用效果较差。^9-11,23.

我们所描述的脱细胞化方法的优点包括保留了微观结构特征，例如管腔内的隐窝-绒毛结构，这些结构为肠干细胞微环境的重新定植提供了适宜的环境。在宏观层面，分层的血管网络的存在将有助于与受体进行连接，从而为组织工程肠（TE-肠）的所有层次提供营养和氧气²¹。此外，细胞外基质（ECM）成分（如胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖）的保留不仅对维持机械性能具有重要作用，还能引导细胞的增殖与分化。最重要的是，该脱细胞化方法能够在保持相同特性的同时扩展至更大尺寸的组织，这一特性对于组织工程（TE）的临床转化具有重要意义。

开发具有血管网络的天然肠道基质，可实现更大段人工肠道的构建，并能将其与宿主连接。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70% 乙醇溶液，溶于 H2O	Sigma	02877
磷酸盐缓冲液片剂	Sigma	79382
抗生素-抗真菌溶液（100 倍浓缩）	Sigma	A5955
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750	口腔和眼刺激物；需使用防护措施
氯化钠
牛胰脱氧核糖核酸酶 I	Sigma	D5025