使用微孔板大规模制备尺寸可控的肿瘤球体

摘要

我们介绍一种利用市售微孔板生成大量（数千至数十万个）尺寸和组分均一可控的肿瘤类球体的实验方案。

摘要

肿瘤类球体 increasingly recognized as an important 体外 三维肿瘤细胞行为模型。相较于传统的贴壁单层培养，该模型更真实地模拟了实际肿瘤中的复杂结构和细胞间相互作用。为了利用该模型更准确地评估肿瘤生物学特性或新型治疗药物的疗效，必须能够以可控的方式、可重复地大量生成球形体。

AggreWell 系统包含高密度排列的金字塔形微孔阵列，将单细胞悬液通过离心方式加入这些微孔中。每个微孔底部聚集的细胞数量，以及所涉及的不同细胞类型的数量和比例，仅取决于实验人员引入的细胞悬液特性。因此，我们能够在无需修改基础平台技术的情况下，生成任意大小和组分的肿瘤类球体。每平方厘米培养表面积上数百个微孔的设计，进一步确保可通过一种简单且劳动强度低的流程实现极高的生产效率。因此，我们预计本实验方案将对肿瘤类球体领域的研究人员具有广泛的适用性。

引言

越来越多的证据表明，肿瘤细胞在三维培养条件下的行为与其在塑料表面培养时不同，且在传统组织培养平台上筛选出的治疗药物在转入更接近生理环境的系统时可能失去疗效¹。因此，在这些条件下研究癌细胞的行为具有重要意义，不仅有助于深入了解其潜在的生物学特性，也有助于提高新治疗药物从筛选阶段向临床应用转化的成功率。一种具有长期应用历史的有用模型系统是利用癌细胞形成的三维细胞簇，称为肿瘤球（tumor spheroids）^1,2。理想的肿瘤球形成技术应能够大量生成大小和组成均受实验者控制的均一肿瘤球。尽管悬滴法和孔板法^3,4能够在一定程度上满足这些要求，但通量通常有限，且大量生成肿瘤球会成为一项劳动密集型工作。

我们最近开发了一种系统，用于解决再生医学领域中的类似挑战⁵。该方法利用一系列高密度排列的微米级孔穴中的强制聚集（见图1），能够从任意数量的细胞生成球体，包括多种细胞类型的混合物⁶，并可整合多种生物材料⁷。该技术可大规模生成球体——数量可达数千至数十万甚至更多——生成后可立即取出 ，也可在原微孔中通过更换培养基维持培养至少一⁸到两周（未发表观察结果）。因此，该系统非常适合用于生成大量均一且可重复的肿瘤球体，以评估新型抗肿瘤药物的效果 或开展基础生物学研究。

方案

注意：微孔板有多种规格，具体选择取决于预期的实验结果。表1列出了不同规格的详细参数，以及每种规格推荐使用的细胞数目的大致最小值和最大值。较小的微孔逐渐收窄至尖端，因此无明确的下限尺寸，但在更小的尺寸下，类球体之间的差异性会更加显著。常规实验中，每个类球体平均仅由20个细胞形成是可行的⁸。较大的微孔底部未完全锥化，因此若尝试用少量细胞形成类球体，可能导致每个微孔中生成多个较小的类球体。由于表面性质存在微小差异，在使用AggreWell 400Ex板时，必须使用表面活性剂溶液进行预处理（步骤1.2），此步骤不可省略。

本方案基于使用 AggreWell 400 培养板——其他规格请参考表1。每孔所需接种的细胞数量由该孔内微孔数量乘以每个类球体所需聚集的细胞数确定。例如，若要生成每个由1000个细胞组成的类球体，则每孔需接种（1,200 个类球体 × 每个1,000个细胞 =）1.2 × 10⁶ 个细胞。由于细胞将被接种于0.4 ml体积中，因此必须据此计算细胞密度。以上述每个类球体由1000个细胞组成的情况为例，1.2 × 10⁶ 个细胞置于0.4 ml中，相当于细胞密度为 3 × 10⁶ 个细胞/ml。

1. 准备受细胞的微孔

1. 微孔板出厂时为无菌状态，应在无菌环境（如层流式生物安全柜）中拆封。整个实验过程中应保持无菌状态。若无菌状态受到破坏，可通过以下可选步骤使用70%乙醇水溶液对微孔进行重新灭菌：
   1. 向每个未使用的微孔中加入0.5 ml的70%乙醇。某些微孔可能会困住气泡，可通过从一侧缓慢加液并让液体自然铺展至整个表面（而非垂直滴加）来减少气泡产生。盖上盖子。
   2. 乙醇蒸气通常能迅速渗透气泡，但如果气泡较多，建议将其去除。在2,000 × g条件下离心2分钟。请注意，在此转速下必须确保转子已正确平衡。
   3. 使用低倍倒置显微镜确认微孔中的气泡已被清除。
   4. 盖上盖子，在室温下孵育5分钟。
   5. 吸除乙醇。此时可用无菌水或PBS洗涤微孔板以立即使用，或将其风干后储存备用。
2. 为确保细胞不与微孔表面发生相互作用，可使用表面活性剂对微孔板进行预处理。通常建议先执行此步骤，并随后比较在经表面活性剂包被与未经包被的微孔中生成的类球体。
   1. 向每个微孔中加入0.5 ml冲洗液。某些微孔可能会困住气泡，可通过从一侧缓慢加液并让液体自然铺展至表面（而非垂直滴加）来减少气泡产生。盖上盖子。
   2. 在2,000 × g条件下离心2分钟以去除气泡。请注意，在此转速下必须确保转子已正确平衡。
   3. 使用低倍倒置显微镜确认微孔中的气泡已被清除。
   4. 盖上盖子，在室温下孵育至少30分钟，或在4 °C下过夜。若密封得当以防止干燥，含表面活性剂溶液的微孔板可在4 °C条件下储存至使用前。
   5. 使用前立即用无菌水或PBS洗涤微孔板。包被后切勿让微孔板干燥。

2. 细胞准备

注意：细胞制备的具体步骤会因所研究的特定细胞类型而略有不同。然而，我们发现这些条件对多种细胞均有效，包括本文讨论的细胞系，以及人和小鼠胚胎干细胞（ESC）、人诱导性多能干细胞（iPSC）、成纤维细胞、假定的原始内胚层细胞和间质细胞。其他研究团队已成功将该系统应用于多种实验，包括间充质干细胞的软骨形成⁹、多能干细胞标准化生成神经前体细胞¹⁰、肝细胞中的毒理学分析¹¹以及蝾螈脊髓再生的评估¹²。本文展示的是使用 HT29 细胞的具体实验方案。

1. 从一培养瓶 HT29 细胞（T75 培养瓶）开始，细胞培养于 DMEM + 10% FBS 中
2. 吸弃培养瓶中的培养基，加入 3 ml 胰蛋白酶。
3. 在37 °C下孵育细胞5分钟。
4. 通过加入3 ml培养基终止胰蛋白酶消化。取一部分用于细胞计数，将剩余部分转移至15 ml离心管中。
5. 200 × g 离心 5 分钟。
6. 在离心进行的同时，对细胞进行计数。
7. 吸弃胰蛋白酶/培养基混合液，加入新鲜培养基，体积根据上述计算所需的细胞密度确定。
8. （可选）将细胞悬液通过滤网过滤，以去除任何团块。注意：不同细胞系的收获条件会略有差异。如果已有一种解离方案适用于该细胞系 例如 传代培养目标细胞时，应以此作为起始步骤。对于敏感细胞系，使用胰蛋白酶可能导致过度的细胞死亡。在这些情况下，我们观察到使用TrypLE作为替代解离试剂可获得良好效果。⁸如果细胞在解离过程中发生聚团并导致活力下降，可在酶解液中添加DNA酶以解决此问题。缩短解离时间并采用吹打步骤分散细胞团块，也可提高细胞活力。

3. 类球体形成

注意：类球体可在多种培养基配方中生成，但初始试验应使用细胞原本培养所用的培养基，以区分由转为三维培养系统引起的效应与由改变培养基成分引起的效应。

1. 向每个孔中加入 0.4 ml 培养基。
2. 在 2,000 × g 条件下离心 2 分钟以去除气泡。请注意，在此转速下离心前，必须确保转子已正确平衡。
3. 使用低倍倒置显微镜，确认微孔中的气泡已被完全去除。
4. 加入 0.4 ml 所需密度的细胞悬液（按上述计算）。通过上下轻柔吹打混匀，避免将气泡引入微孔中。为获得一致的球形细胞聚集体，必须确保细胞在孔内均匀分布。
5. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟。如果培养板在离心过程中不能自动平衡，则可能产生对流，导致细胞在微孔间分布不均。因此，应确保培养板内部以及与其他板之间均保持平衡，使重量在板架两侧均匀分布。

注意：如果发现细胞分布不均的迹象，可能需要在板架的枢轴点处涂抹少量润滑剂——请咨询离心机制造商以获取具体操作说明。

注意：细胞经离心进入微孔后，对因培养板轻微移动而导致的冲洗具有较强的耐受性。应避免导致培养基晃动的剧烈动作，但将培养板从离心机转移至显微镜或培养箱时，通常不会引起明显的细胞位移。

6. 使用倒置显微镜确认细胞已聚集于微孔中，并且在孔内分布均匀。
7. 37 °C 过夜孵育。
8. 使用倒置显微镜观察类球体形成过程。某些细胞系可在24小时内形成致密的类球体，而其他细胞系可能需要更长时间。HT29细胞从细胞簇发展为聚集体的过程如图所示。 图2.
9. 从微孔中回收球状体，并用移液管轻轻吹打将其转移至悬浮培养中。或者，可维持球状体 原位 更换培养基⁸ - 持续时间取决于其初始大小和生长速率，这两者决定了它们在形成后长出微孔所需的时间。
   1. 更换培养基时若要避免丢失类球体，应使用巴斯德吸管在孔板边缘处吸取培养基。将吸管尖端缓慢下移至液面弯月面处开始吸取液体，并随着液面下降而同步下移。随后在同一位置沿孔壁加入新鲜培养基。尽管可能会有少量类球体丢失，但若始终在同一位置进行吸出和更换操作，则丢失数量相较于孔内大量的类球体而言将保持较少。

结果

来自不同解剖来源的多种肿瘤细胞系的球状体可轻松生成并转移至悬浮培养中。图3展示了该方法可实现一致的尺寸控制，在每种条件下均获得高度均一的球状体群体。不同细胞系之间的行为差异也清晰可见：HT29结肠癌细胞和TE6食管癌细胞形成结构紧密、边界清晰的球状体，而LNCaP前列腺癌细胞则形成结构松散、边界不规则的球状体（可能原因见讨论部分）。结构更紧密的聚集体内部作用力更强，即使仍在其形成的微孔中，也会塌陷为更对称的形态；相比之下，LNCaP聚集体尤其是较大尺寸者，仍明显保留了微孔的方形锥体几何形状。接种细胞数量与所形成球状体物理尺寸之间的关系取决于多个变量。理论上，球状体体积应为单个细胞体积与接种细胞数量的乘积，但实际体积可能因细胞损失而减小，损失可能发生在单细胞悬液阶段，也可能由于聚集体过小导致细胞邻接不足，或由于聚集体过大引起核心区域物质传输受限和坏死。此外，聚集过程中若发生细胞增殖，也会影响最终尺寸。由于这些参数在不同细胞系间存在差异，若需获得特定物理尺寸的球状体，必须通过实验确定应接种的细胞数量。作为初步估算，球状体直径预期随所含细胞数量的立方根增加——例如，细胞数量增加8倍，球状体直径应增加至原来的2倍。

图1. 类球体生产的示意图。 微孔系统由紧密排列的方形锥形微孔阵列组成（每平方厘米625个）² 400 µm大小）中，通过离心使细胞沉降。细胞在倾斜的侧壁引导下聚集，所形成球状体的大小可通过调节所用细胞悬液的密度来控制。

图 2. 细胞簇组装形成球状体。 球状体由每簇七百个 HT29 细胞形成。离心后立即观察（A），细胞在每个微孔底部松散聚集。请注意，本例中细胞簇均匀地偏移至右下侧。只要整个阵列中的细胞簇大小保持一致，此现象可接受。若阵列一侧与另一侧之间出现明显的簇大小差异，请参见步骤 3.5 中的说明。培养 24 小时后（B），细胞间黏附力促使细胞簇进一步聚集并形成结构完整的球状体，随后可将其取出（C）。

图3. 在微孔板中生成的类球体。 类球体由七百个（A, C, E）或一千五百个（B, D, F）HT29结肠癌细胞（A, B）、LNCaP前列腺癌细胞（C, D）或TE6食管癌细胞（E, F）形成。注意同一制备条件下类球体的一致性，以及不同细胞系之间的差异——特别是LNCaP细胞形成的松散聚集体，与结构更致密的HT29和TE6细胞相比。比例尺表示200 μm。

	微孔板格式
	AggreWell 400	AggreWell 40EX	AggreWell 800
微孔宽度 (µm)	400	400	800
每平方厘米微孔数（个/cm2）	625	625	156.25
每孔微孔数（个/孔）	1,200	4,700	300
每个微孔最低细胞数*	N/A	N/A	2000
每个微孔最高细胞数*	2,000	2,000	10,000
每孔最低细胞数*	N/A	N/A	6 x 105
每孔最高细胞数*	2.4 x 106	9.4 x 106	3 x 106
1.1.1 - 70% 乙醇体积（ml）	0.5	2.0	0.5
1.2.1 - 洗涤液体积（ml）	0.5	2.0	0.5
3.2 - 预加培养基体积（ml）	0.4	1.6	0.4
3.5 - 细胞加样体积（ml）	0.4	1.6	0.4
*每个微孔的细胞数量仅为近似值，实际数值会因所用细胞的具体大小而异，需通过实验确定

表1. AggreWell 选项及实验方案修改。

讨论

我们已建立一种系统，可从不同来源的多种细胞系中生成大量均一的球状体。迄今为止，我们尚未遇到在此条件下无法形成球状体的贴壁细胞系。我们此前观察到易于发生失巢凋亡的细胞群体中存在细胞丢失现象^5,8，但截至目前，肿瘤细胞系中尚未出现此问题。该系统可根据表面积任意扩展，在24孔板和6孔板格式的微孔阵列中，以及目前正在开发的每批包含50,000个微孔的原型生物反应器中，其行为表现一致。

如果类球体不对称性成为问题，步骤 4.8 中的孵育时间可延长至两到三天。类球体在从微孔中取出后也可继续孵育一段时间以提高对称性，但在此情况下必须注意保持足够低的培养密度，因为相互接触的类球体会经常融合成更大的结构。因此，我们此前一直将培养物保留在形成聚集体的微孔中，主要限制因素是类球体的尺寸。而该尺寸取决于生长速率和初始大小⁸，若计划在微孔板中进行长期培养，则应提前考虑此因素。若出现过度生长，可采取的预防措施包括：起始时使用较小的类球体，或采用 AggreWell 800 板中尺寸更大的微孔。

如果类球体随时间推移未能增强其结构完整性，可能的原因之一是细胞死亡。特别是在代谢活性较高的细胞形成的大尺寸聚集体中，氧气和必需营养物质在传质上的限制可能导致出现坏死核心²，因此类球体缺乏凝聚力可能仅仅是过度细胞死亡的结果。此外，已有研究通过测量类球体的机械内聚力来评估细胞间结合力，并将其与特定细胞系的转移潜能相关联¹³。进一步探讨类球体形态与转移潜能之间的关系将具有重要意义，或可采用诸如圆度、周长与面积比等形态计量参数进行分析。

除了研究类球体的力学和形态计量学特性外，在微孔系统中进行组装还可大规模生产由多种细胞类型和/或生物材料组合而成的混合成分类球体^6,7。肿瘤细胞与其他细胞类型的相互作用对于更真实地模拟体内肿瘤行为具有重要意义in vivo¹⁴，因此，将肿瘤细胞与成纤维细胞和内皮细胞等共同培养生成类球体可能具有研究价值。此外，还可将多种生物材料的微粒掺入类球体中，这些微粒不仅可通过与细胞的直接相互作用影响类球体的特性^7,15，还可作为储库向类球体内部可控释放生长因子和细胞因子¹⁶。

如果对无菌性存在任何疑虑，例如在使用多孔板时，某些孔之前已被使用过，并且可能作为先前实验的一部分在培养箱中放置了一段时间，则可用70%的乙醇水溶液对这些孔重新进行消毒。

一旦形成类球体，可通过将悬液过滤过细胞筛网来将其与残留的未结合细胞分离。单个细胞会通过筛网，而类球体会被截留。如果怀疑类球体在培养过程中会脱落潜在的转移性细胞，则可多次执行此操作——最初用于去除未结合的细胞，随后用于分离类球体释放出的纯化细胞群体。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AggreWell 400 培养板	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
冲洗液	StemCell Technologies Inc.	07010
细胞筛（37 µm）	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
胰蛋白酶-Versene（EDTA）	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
胎牛血清（FBS）	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
倒置显微镜	VWR / Motic	CA19000-610
配备标准培养板转子的 Allegra X15R 离心机	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
层流式生物安全柜	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP