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方法文章

定量 体外 测定中性粒细胞在静息条件下对活化的人原代微血管内皮细胞黏附的实验方法

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DOI：

10.3791/50677

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2013年8月23日

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

本文内容

摘要

中性粒细胞在感染部位与活化的血管内皮细胞黏附是宿主炎症反应的重要组成部分。本报告所述为一种中性粒细胞结合实验，可用于 体外 炎症介质激活的内皮细胞在静态条件下与人原代中性粒细胞黏附的定量分析

摘要

血管内皮在炎症反应中起着至关重要的作用。在炎症的急性期，内皮细胞（ECs）可被宿主介质激活，或直接被保守的微生物组分或宿主来源的危险分子激活。活化的内皮细胞表达细胞因子、趋化因子和黏附分子，从而动员、激活并滞留白细胞于感染或损伤部位。中性粒细胞是最早到达的白细胞，通过细胞表面多种黏附分子与内皮细胞黏附。中性粒细胞的主要功能包括直接清除微生物威胁、通过释放其他因子促进更多白细胞的募集，以及启动伤口修复。因此，中性粒细胞向内皮的募集和黏附是启动炎症反应的关键步骤。在本报告中，我们描述了一种 体外 使用钙黄绿素AM标记的原代人中性粒细胞进行中性粒细胞黏附实验，以在静态条件下定量评估微血管内皮细胞的活化程度。该方法的另一优势在于，经荧光分光光度法定量的同一批样品，还可直接通过荧光显微镜观察，从而对中性粒细胞的结合情况进行更定性的评估。

引言

由于血管内皮直接与循环血液接触，因此在感染或损伤时处于启动快速炎症反应的独特位置。内皮细胞（ECs）表达模式识别受体，可识别多种保守的细菌成分和危险分子，同时也表达宿主炎症介质（如TNFα）的受体。这些受体的激活可诱导ECs分泌细胞因子（例如 IL-6、IL-8、CXCL1和CCL2），并在细胞表面上调黏附分子（例如 E/P-选择素、VCAM-1和ICAM-1）的表达1,2。这些分子均有助于白细胞定向募集至感染或损伤部位，从而清除病原体并启动组织修复过程3,4。中性粒细胞对感染的反应涉及血管内皮与响应性中性粒细胞之间高度协调的相互作用。内皮细胞被激活后，会分泌IL-8，并在内皮表面形成血管内浓度梯度，引导中性粒细胞定向迁移至感染或损伤部位5,6。E/P-选择素通过与中性粒细胞表面糖分子形成较弱的相互作用，介导中性粒细胞的捕获和滚动。这些相互作用连同IL-8与其同源受体的结合，促进中性粒细胞通过整合素介导的牢固黏附，最终在内皮细胞表面停滞7-10。停滞之后，中性粒细胞可迁移出血管，到达特定感染部位，直接清除病原体，形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以阻止病原体扩散，促进伤口愈合，并释放其他因子招募单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等更多白细胞11-17。

本报告中描述的是一个 体外 一种用于定量检测宿主炎症介质TNFα激活后中性粒细胞对微血管内皮细胞（ECs）黏附的方法。该实验旨在评估内皮细胞的活化状态，而非中性粒细胞的活化。首先通过密度梯度离心法分离纯化人外周血中的原代中性粒细胞，随后用钙黄绿素乙酰甲氧基酯（calcein acetoxymethyl, AM）进行标记。活细胞内的酯酶可将calcein AM水解为高荧光性的钙黄绿素分子，其激发波长为492–495 nm，发射波长为513–516 nm。 18将荧光标记的中性粒细胞与内皮细胞（EC）单层共孵育，随后洗去未黏附的中性粒细胞。利用荧光分光光度计测定剩余已结合中性粒细胞的荧光强度，并以每孔中性粒细胞总输入荧光强度的百分比进行计算。该方法的另一优势在于，用于分光光度测定的钙黄绿素（calcein）标记中性粒细胞可直接通过荧光显微镜观察，从而对内皮细胞活化提供更直观的定性评估。由于该实验在静态条件下进行，仅能评估中性粒细胞黏附级联反应中最初期的事件。本报告中通过使用E-选择素阻断抗体证实了这一点，结果显示：当E-选择素相互作用被阻断时，中性粒细胞对经TNFα处理的人肺微血管内皮细胞（HMVEC-Lung）单层的黏附显著减少。

除了TNFα外，我们已成功应用该检测方法来确定Toll样受体1/2激动剂——肽聚糖相关脂蛋白（PAL）、胞壁脂蛋白（MLP）和Pam3Cys对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的激活程度，以及Pam3Cys对肺部微血管内皮细胞（HMVEC-Lung）的激活作用。 19,20此外，我们成功地将该检测方法应用于激酶抑制剂处理以及通过RNAi介导的HMVEC-肺细胞表面和胞质蛋白敲降实验，表明该方法可与多种生物化学和筛选检测相兼容。 20总之，该检测方法提供了一种易于使用、可重复且更具功能性的手段，用于评估炎症介质对内皮细胞活化的影响程度。 体外.

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方案

1. 微血管内皮细胞的接种与培养

  1. 根据制造商提供的说明解冻并培养微血管内皮细胞。本方案中，细胞在 EGM-2 MV 培养基（Lonza）中培养，建议所有实验在解冻后两周内完成，以尽量减少因传代次数不同引起的变异。我们对 HMVEC-Lung 的实验在第 4 至第 9 代之间进行。
  2. 第1天：当细胞达到80–90%融合度时，用胰蛋白酶消化并重悬为每毫升120,000个细胞。每孔接种36,000个细胞（0.3 ml）至48孔聚苯乙烯组织培养板中。包括将用于HMVEC的孔 不 与中性粒细胞共同孵育，以获得背景荧光读数。除非使用专为荧光检测设计的48孔板，否则应交替设置行或列，以尽量减少邻近孔之间的光污染。注：孔板可预先包被多聚赖氨酸、胶原或纤连蛋白。
  3. 第2天：加入新鲜培养基。
  4. 第3天：通过相差显微镜观察，确认细胞状态良好（即 "鹅卵石" 外观良好且细胞碎片极少），并且达到 100% 汇合（图1如果细胞未达到100%汇合，每天更换培养基，直至细胞长满。
  5. 当HMVEC单层细胞准备好进行处理后，用Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞一次，并向相应孔中加入0.3 ml新鲜EGM-2 MV培养基或含炎症激动剂的培养基。在本方案中，HMVEC-肺细胞用TNFα（100 ng/ml）（PeproTech，新泽西）处理3小时，因为TNFα是内皮细胞（ECs）的一种已被充分描述的激活剂。 21注意：建议合理安排实验时间，使活化的HMVEC细胞（步骤4.1）与钙黄绿素AM标记的中性粒细胞（步骤3.5）能够同时准备就绪。我们通常需要约2.5小时完成中性粒细胞的分离与标记。

2. 使用 Polymorphprep 分离中性粒细胞

  1. 按照先前所述方法分离中性粒细胞 22，或使用现成的密度梯度溶液从全血中分离多形核粒细胞。按照 Nuzzi 提供的方案使用 Polymorphprep 等 2007年的结果产量约为2-3 x 106 每毫升全血中的中性粒细胞数 23注意：为避免红细胞过度裂解，可在密度梯度离心前进行右旋糖酐沉降以去除红细胞 24.
  2. 将 Polymorphprep 密度梯度溶液置于室温。
  3. 从健康人类志愿者体内采集30 ml全血，采血时加入抗凝剂（如肝素、柠檬酸盐或EDTA）。血液应在2小时内使用，并保持在18–22 °C。
  4. 在15 ml锥形管中，将5 ml全血缓慢铺在5 ml密度梯度液上方（图2A）。避免改变血液和密度梯度溶液的体积，因为这可能影响后续离心条件。
  5. 在18–22 °C下以450 × g离心30分钟。确保缓慢升降离心机转速。即 关闭离心机刹车，并充分平衡离心管以防止振动，从而减少中性粒细胞的激活并避免各层混合。较长的离心时间或较高的离心力会导致含有中性粒细胞的下层白细胞进一步向沉淀的红细胞方向迁移。
  6. 吸弃含有 PBMCs 的血浆和上层白细胞层，以避免中性粒细胞所在层的污染（图2B).
  7. 使用1-2 ml移液管吸取含有中性粒细胞的下层白细胞层。将中性粒细胞层合并至30 ml PBS（不含Ca2+ 和 Mg2+) 置于 50 ml 锥形管中。
  8. 用 PBS（不含 Ca）定容至 50 ml2+ 和 Mg2+) 在18–22 °C下以450 × g离心10分钟。

注意： 步骤 2.9 和 2.10 为可选步骤，但强烈推荐执行。

  1. 吸去上清液。将中性粒细胞重悬于 8 ml 无菌水中，孵育 30 秒以裂解红细胞，立即向细胞悬液中加入 2 ml 5x PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+），并轻轻混匀。切勿将细胞在水中孵育超过 30 秒，否则可能导致中性粒细胞大量死亡。
  2. 在 18–22 °C 条件下，以 250 × g 离心 5 分钟。
  3. 用 10 ml PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）洗涤细胞一次，并在 18–22 °C 条件下再次以 250 × g 离心 5 分钟。
  4. 将中性粒细胞重悬于 10 ml RPMI-1640 培养基（不含酚红）中，使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。避免细胞密度长时间超过每毫升 5 × 106，因为这可能导致中性粒细胞活化。

3. 使用Calcein AM标记中性粒细胞

  1. 每孔使用 6 × 105 个中性粒细胞，接种于 48 孔板中。
  2. 计数后，将重悬的细胞转移至 50 ml 圆底离心管中，用不含酚红的 RPMI-1640 培养基将中性粒细胞稀释至每毫升 2–4 × 106 个细胞。
  3. 向培养基中加入钙黄素 AM 储存液至终浓度为 3 μM（即 每毫升培养基加入 2.98 μl 钙黄素 AM 储存液（1 mg/ml）），轻轻弹击离心管充分混匀。钙黄素 AM 浓度超过 5 μM 时会导致其从中性粒细胞中泄漏。注意： 非荧光性的钙黄素 AM 可被细胞内的内源性酯酶水解，生成高荧光性的钙黄素分子（即 死细胞不会产生荧光）。
  4. 用铝箔纸包裹离心管，于 37 °C 避光孵育 30 分钟。注意： 孵育时间过长可能导致在黏附实验过程中从中性粒细胞释放出更多的钙黄素。
  5. 在 18–22 °C 条件下，以 450 × g 离心 5 分钟，用 10 ml 不含酚红的 RPMI-1640 培养基（预热至 37 °C）洗涤中性粒细胞两次。第二次重悬细胞后，先将中性粒细胞通过 40 μm 无菌滤器以去除细胞团块，然后再次在 18–22 °C 以 450 × g 离心 5 分钟。
  6. 用不含酚红且预热至 37 °C 的 RPMI 1640 培养基将中性粒细胞重悬至每毫升含 2 × 106 个中性粒细胞。

4. 中性粒细胞结合实验

  1. 用每孔 0.5 ml 含 3% BSA 的滤膜灭菌（0.22 μm）RPMI 1640 培养基（不含酚红）清洗 HMVEC 单层细胞 3 次。
  2. 吸去培养基，向 48 孔板的相应孔中加入 6 × 105 个钙黄绿素标记的中性粒细胞（0.3 ml 细胞悬液），或仅加入不含中性粒细胞的 0.3 ml RPMI 1640 培养基（不含酚红）。注意：这相当于每 cm2 加入 8 × 105 个中性粒细胞。
  3. 在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 20 分钟。
  4. 中性粒细胞总荧光强度（洗脱前）：使用 FLUOstar 或同等功能的分光光度计，以 485 nm 激发波长和 520 nm 发射波长（荧光素滤光片组）测定每孔的荧光强度。此步骤应在孵育结束前立即进行。注意：在本实验方案中，钙黄绿素的激发和发射光检测均从敞口孔的上方进行；但也可从孔底部进行检测。
  5. 用每孔 0.5 ml PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）对含有 HMVEC 单层细胞和中性粒细胞的孔进行 5 次洗涤。通过将板倒置并轻轻拍打在纸巾上以去除残留液体，从而移除培养基和洗涤液。
  6. 每孔重新加入 0.3 ml RPMI 1640 培养基（不含酚红）。
  7. 黏附中性粒细胞荧光强度（洗脱后）：参照步骤 4.4 测定每孔的荧光强度。
  8. 计算每孔的黏附百分比和相对黏附量：

注意：在此阶段，可使用配备标准荧光素滤光片的荧光显微镜获取钙黄绿素标记的中性粒细胞图像。图4中的图像采用配备Retiga 2000R相机（Q Imaging）的Olympus IX51倒置显微镜，并使用Q-Capture Pro7软件（Q Imaging）获得。

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结果

为了在中性粒细胞结合实验中获得可靠且可重复的结果，实验当天微血管内皮细胞的健康状态和汇合度必须处于最佳水平，如图1中HMVEC-肺细胞所示。此外，必须使用低代次的微血管内皮细胞（即传代次数少于9次），因此我们建议在细胞解冻后两周内完成所有实验。中性粒细胞的健康状态也极为重要，尤其是如果细胞在某种程度上受损，则钙黄素AM将无法代谢为荧光性的钙黄素分子。我们采用台盼蓝排斥法检测细胞活力，若发现有相当比例的细胞死亡（即被染色），则不继续进行实验。

分离中性粒细胞的方法有多种，包括密度梯度法和基于抗原的柱层析分离法，这些方法中的任何一种均适用于本实验。我们选择使用 Axis-Shield 公司提供的预制密度梯度溶液 Polymorphprep。如图2所示，离心后外周血单个核细胞（PBMCs）位于上层，而中性粒细胞位于下层。需吸除 PBMC 层，以避免在收集粒细胞时受到污染。需要注意的是，步骤 2.9 中加入水以裂解残留红细胞的操作是可选的。然而，尽管彻底去除污染的红细胞是理想的，但必须注...

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讨论

成功进行中性粒细胞与微血管内皮细胞黏附实验最关键的步骤是：1）使用低传代次数（<9）、状态良好的内皮细胞；2）将分离得到的中性粒细胞维持在低密度（即 <5 × 106 个细胞 / ml），并在分离后两小时内使用；3）仔细洗涤经钙黄绿素AM标记的中性粒细胞，并及时使用这些标记细胞，以分别尽量减少内皮细胞污染以及中性粒细胞中钙黄绿素的丢失。

我们加入 8 x 105 每厘米的中性粒细胞数2 组织培养孔的表面积（即 每孔600,000个中性粒细胞（48孔板）。我们发现，600,000个中性粒细胞的上样量处于分光光度计的线性检测范围内，并且在测量相对黏附率时数据可重复性良好。然而，在p38-MAPK抑制实验中，也观察到中性粒细胞结合率出现非常相似的下降图3C当每孔加入 40,000、200,000 或 1,000,000 个中性粒细胞时，结果表明可使用少于 600,000 个中性粒细胞。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加州大学旧金山分校麻醉学与围手术期护理系资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
肺部微血管内皮细胞（HMVEC-Lung）LonzaCC-2527
EGM-2 MV 培养基LonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095可使用任意供应商产品替代
48 孔组织培养板BD Falcon353078
PBS（不含酚红）UCSF 细胞培养中心CCFAL001可使用任意供应商产品替代
D-PBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+ 及酚红）UCSF 细胞培养中心CCFAL003可使用任意供应商产品替代
RPMI-1640（不含酚红）Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
钙黄绿素 AM（calcein AM）Life TechnologiesC3099（0.995 mM）储备液
台盼蓝溶液（Trypan Blue Solution）Sigma-AldrichT8154
40 μM 滤器VWR21008-949可使用任意供应商产品替代
FLUOstar OPTIMA 分光光度计BMG LABTECH-

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内皮细胞激活Calcein AM 标记荧光分光光度法荧光显微镜中性粒细胞分离多形核细胞分离试剂盒TNF Alpha 处理P38 MAPK 抑制
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