用于细胞-材料相互作用研究的纳米多孔金图案微加工

摘要

我们报道了通过掩模版印刷和光刻技术对纳米多孔金薄膜进行微图形化的方法，以及在微加工图案上培养细胞的技术。此外，我们还描述了利用扫描电子显微镜和荧光显微镜技术对材料及培养细胞的形态进行表征的图像分析方法。

摘要

特征尺寸在几十纳米范围内的纳米结构材料已显著提升了多种技术的性能，包括燃料电池、生物传感器、生物医学器件涂层和药物递送工具。通过纳米尺度自组装过程制备的纳米多孔金（np-Au）是一种相对较新的材料，具有较大的有效比表面积、高电导率和催化活性。这些特性使np-Au成为科学界广泛关注的材料。目前大多数关于np-Au的研究采用宏观尺度样品，主要聚焦于该材料的基本科学性质及其在催化和传感领域的应用。然而，宏观样品限制了np-Au在微型化系统（如生物医学器件）中的潜在应用。为解决这一问题，我们首先介绍了两种在刚性基底上对np-Au薄膜进行微图形化的方法。第一种方法采用手工制作的掩模版来生成毫米尺度的np-Au图案，第二种方法则利用剥离式光刻技术实现亚毫米尺度的图案化。由于np-Au薄膜通过溅射沉积工艺获得，因此与传统的微加工技术兼容，易于集成至微系统中。这些微系统包括可电寻址的生物传感器平台，可充分利用其高有效比表面积、良好电导性以及基于金-硫醇化学的表面生物偶联特性。我们还描述了细胞培养、免疫荧光染色和图像处理技术，用于量化np-Au与哺乳动物细胞之间的相互作用，这是某些生物传感器的重要性能参数。我们预期，本文所展示的技术将有助于np-Au在不同尺度平台中的集成，并推动其在生物传感器、储能系统和催化剂等众多领域的广泛应用。

引言

具有纳米尺度特征的材料在提升多种应用方面展现出巨大潜力，包括燃料电池¹、传感器^2,3和生物医学器件^4,5。一种相对较新的材料是纳米多孔金（np-Au），它通过纳米尺度的自组装过程制备而成。np-Au的前驱体是一种金合金，其中最常见的是含银量为60%至80%（原子百分比）。简而言之，其特有的开孔纳米结构是在强酸（例如 70%硝酸）或电化学电位作用下溶解银的过程中，金原子在团簇内重新排列所形成的^6-8。np-Au具备多种理想特性，包括高比表面积、优异的导电性、成熟的表面功能化技术以及良好的生物相容性⁹。尽管近年来关于np-Au的研究迅速增长，但大多数研究集中在其力学性能^10,11、催化活性¹²以及生物分子传感性能^13-15。虽然这些理想特性对多种生物医学工具极具价值^16,17，但该材料在此领域的应用仍较为有限。其中一个可能的原因是，大多数研究主要使用宏观尺度的样品（例如 薄片、箔片和铸锭），而将np-Au集成到微型系统中的技术仍不完善。事实上，采用np-Au薄膜的常规微加工技术实例极少^16-20。随着微型化技术的发展以及对新型生物医学工具的需求日益增长，能够将新材料整合进器件中变得至关重要。这通常要求材料可通过常规微加工技术进行沉积和图形化。此外，通常还需要快速量化细胞-材料相互作用，以评估新材料的生物相容性。本文的目标是展示对np-Au薄膜进行微图形化的基本技术，并通过数字图像处理手段定量分析其纳米结构及细胞-材料相互作用。

方案

1. 纳米多孔金的制备

1. 使用 Piranha 溶液清洗基底
   1. 在结晶皿中将 25 ml 过氧化氢（30%）加入 100 ml 硫酸（96%）中，并在加热板上将混合物加热至 65 °C。注意：液体具有极强腐蚀性，必须小心操作。使用后的溶液不得储存在密封容器中，否则可能发生爆炸。
   2. 使用耐酸镊子将 1 英寸 × 3 英寸的显微镜载玻片放入混合液中，清洗 10 分钟。批量清洗小尺寸盖玻片时使用陶瓷免疫染色槽。在浸入溶液前，先用 10 W 空气等离子体处理小尺寸盖玻片 30 秒。
   3. 在流动的去离子水（DI 水）下，于结晶皿中冲洗清洗后的样品 3 分钟。在无尘纸巾上方用氮气枪吹干样品。
2. 制备模板掩膜（方法 1：用于创建毫米级图案）
   1. 在半硬塑料表面上，使用活检打孔器对 250 μm 厚的硅橡胶片进行打孔，和/或使用手术刀切割出所需区域。在 70% 异丙醇中清洗处理后的橡胶片，并用氮气枪吹干。
   2. 将打孔后的橡胶片放置在无尘洁净室纸巾上，将经 Piranha 溶液清洗的盖玻片对准模板放置，样品面朝向模板。
3. 图案化剥离型光刻胶（方法 2：用于创建亚毫米级图案）
   1. 将经 Piranha 溶液清洗的显微镜载玻片放置在旋转卡盘上，并用氮气枪吹去表面颗粒物。使用塑料移液管将 1.5 ml 偶联剂（六甲基二硅氮烷）滴加到玻璃载玻片上。通过依次以 500 rpm 旋转 5 秒和 1,500 rpm 旋转 30 秒的方式均匀涂布偶联剂。在加热板上 115 °C 烘烤 7 分钟，随后冷却 5 分钟。
   2. 将 4 ml 光刻胶滴加到玻璃载玻片（3 英寸 × 1 英寸）上。使用与偶联剂相同的旋转程序涂布光刻胶。在加热板上 115 °C 烘烤 1.5 分钟，随后冷却 10 分钟。
   3. 通过透明掩膜，用紫外光（强度：22 mW/cm²）照射涂有光刻胶的载玻片 15 秒。在加热板上 115 °C 烘烤 1.5 分钟，静置 45 分钟。在显影液中溶解曝光区域的光刻胶至少 3.5 分钟。用去离子水彻底冲洗。在光学显微镜下检查显影后的图案。
4. 沉积前驱金属以制备 np-Au 薄膜
   1. 将样品装入可独立沉积金、银和铬的溅射设备中。在开始金属沉积前，在 25 mTorr 氩气气氛下以 50 W 功率对样品进行 90 秒的溅射清洗。
   2. 在 10 mTorr 氩气下以 300 W 功率溅射铬 10 分钟。在 10 mTorr 氩气下以 400 W 功率溅射金 90 秒。以银 200 W、金 100 W 的功率共溅射金和银 10 分钟。关闭溅射源时，金源应比银源提前约 10 秒关闭。
5. 获得前驱金属微图案
   1. 将涂有光刻胶的样品在约 180 ml 光刻胶剥离液中进行超声处理，共 10 个循环，每个循环包括 20 秒超声和 2 分钟暂停。用去离子水冲洗样品，并用氮气枪吹干。在显微镜下检查金属图案。
   2. 使用两把镊子从未涂光刻胶的样品上剥离橡胶模板，以露出沉积的金属。
6. 去合金前驱金属并通过热处理调控纳米结构
   1. 在 200 ml 玻璃烧杯中加入 170 ml 硝酸（70%），并在加热板上将溶液温度维持在 55 °C。注意：硝酸具有极强腐蚀性，操作时应佩戴适当的防护装备。
   2. 在浸入硝酸前，先用 10 W 空气等离子体处理小尺寸盖玻片 30 秒。使用耐酸镊子将 1 英寸 × 3 英寸的显微镜载玻片放入烧杯中，去合金处理 15 分钟。批量去合金小尺寸盖玻片时使用陶瓷免疫染色槽。
   3. 将去合金后的样品依次在两个盛有新鲜去离子水的烧杯中各浸洗三次。将样品保存在去离子水中，并至少持续一周每天更换新鲜去离子水。使用前在无尘纸巾上方用氮气枪吹干样品。
   4. 将样品装载到快速热处理设备中的洁净硅片上。将温度设定在 200 °C 至 450 °C 之间，升温速率为 10 °C/秒。在氮气氛围下使样品在设定温度下保持 10 分钟。待腔体冷却（<100 °C）后取出样品。或者，也可将样品缓慢放置在加热板上进行热处理。

2. 细胞培养

1. 为细胞培养准备np-Au样品
   1. 将np-Au样品放入聚苯乙烯培养皿中，以10 W空气等离子体处理30秒，随后将样品转移至24孔组织培养板中。
   2. 每孔加入500 μl完全培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基）。置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中保存，直至接种细胞（<1小时）。
2. 细胞的培养、传代与接种
   1. 将目标细胞（本实验中为3T3-NIH成纤维细胞或小鼠星形胶质细胞）在T75培养瓶中用培养基进行培养，当细胞融合度达到70%时进行传代。
   2. 传代时，吸除培养瓶中的培养基，用10 ml磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，加入2 ml 1×胰蛋白酶/EDTA溶液，孵育至细胞脱落（约5分钟）。加入3 ml新鲜培养基终止消化，以1,200 rpm离心3分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml培养基中。
   3. 吸除孔中旧培养基，将细胞以25,000个细胞/cm²的密度接种到玻璃盖玻片上，终体积为1 ml。前后左右轻轻摇动培养板，确保细胞在样品表面均匀分布。接种后继续培养，并每日观察细胞状态，直至进行分析。

3. 细胞与材料分析

1. 染色细胞以观察细胞骨架和细胞核
   1. 从孔板中移除用过的培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞 15 分钟。
   2. 在含 1% 牛血清白蛋白的 PBS 中配制 300 nM Alexa Fluor 488 标记鬼笔环肽的染色液。
   3. 用 PBS 洗涤细胞两次，然后在含 0.1% Triton X-100 的 PBS 中加入 500 μl 进行透化处理，持续 5 分钟。
   4. 用 PBS 洗涤细胞两次，并转移至洁净的孔中。将 50–200 μl 染色液滴加到样品上，避光孵育 20 分钟。
   5. 用 PBS 洗涤细胞，然后用含 3 nM DAPI 的 PBS 进行复染，孵育 5 分钟。
   6. 用 PBS 洗涤细胞，再用去离子水短暂浸泡，随后将样品置于载玻片上，加入封片剂，盖上盖玻片，并用透明指甲油封边。
2. 获取 np-Au 样品及 np-Au 表面细胞培养物的图像
   1. 使用扫描电子显微镜（SEM），在 10 kV 电子束能量下，采用二次电子探测器，以 50,000 倍放大倍数对 np-Au 表面进行成像。
   2. 使用倒置荧光显微镜，配合合适的滤光片组，在 10 倍放大倍数下，对样品不同区域采集细胞复合图像。
3. 处理图像以确定孔隙和细胞形态
   1. 在 ImageJ 中打开图像，如有需要将其拆分为独立通道。将图像转换为 8 位，减去背景，并通过中值滤波进行平滑处理。手动或使用内置阈值算法调整阈值，以突出显示孔隙（空腔）和细胞体/细胞核。
   2. 使用分水岭命令分离重叠的孔隙或细胞。设置颗粒分析参数并执行命令，以提取颗粒数量、平均面积以及颗粒所占百分比。使用 DAPI 染色的细胞图像进行细胞计数，使用鬼笔环肽染色的细胞图像量化细胞覆盖百分比。
   3. 修改提供的宏文件，以实现多幅图像的批量分析。

结果

图1概述了主要的实验步骤，包括制备纳米多孔金（np-Au）图案、细胞培养、纳米结构的量化以及细胞形态的表征。图2a（顶部）所示的弹性体掩模用于制备其下方图像中的np-Au图案。图2b为用于批量处理样品的瓷舟的实物照片。图2c展示了金属沉积图案在去合金化处理前后的颜色变化。去合金化前的银白色外观源于富银合金成分；经去合金化后，薄膜呈现出明显的橙棕色色调。图2d展示了通过光刻技术对金属进行图案化所获得的更精细结构。通过热处理np-Au薄膜可获得不同的孔结构形貌⁹，如图3所示。横截面图像（图3）可用于判断薄膜在厚度方向上是否实现了均匀的去合金化。扫描电镜（SEM）图像可通过分割（阈值处理）转化为二值图像（图3底行），以确定孔隙的尺寸及孔隙所占面积百分比（代码1）。图4展示了一张典型的在n...

讨论

我们展示了两种不同的技术来对纳米多孔金（np-Au）薄膜进行微图形化，以拓展这些薄膜在微系统和生物研究中的应用。溅射镀金和银是一种制备np-Au图案的通用方法，因为溅射工艺与传统的微加工流程相兼容，且通过分别调节金和银靶材的溅射枪功率以及沉积时间，可方便地控制合金成分和膜层厚度。典型的np-Au薄膜厚度范围为200 nm至2 μm。模板法（方法1， 图 2a) 使用活检打孔器和手术刀可制作毫米级图案，从而避免了光刻的需要。更复杂的图案可通过可编程激光切割机制备。这种柔性的硅胶弹性体掩模可自行粘附于玻璃表面，从而防止金属沉积在掩模下方，提高图案分辨率。然而，更小的特征（<1 mm）通常难以通过此方法制备，因为掩模的厚度会阻碍金属在开口区域的均匀沉积。对于需要更高特征分辨率的应用，可采用光刻图案化方法（方法2， 图 2d）。用于通过光刻技术转移图案的透明掩模可从多家公司获得（例如 输出城市：班顿，俄勒冈州）在所需最小特征尺寸大于约20 μm时，是相较于铬玻璃掩模经济的替代方案。金属沉积到柔性模板上时，有时会因应力分布不均而导致模板从基底上脱落。我们通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金靶材	Lesker	EJTAUXX403A2	用于制备纳米多孔金（np-Au）合金的前驱体
铬靶材	Lesker	EJTCRXX353A2	作为粘附层
银靶材	Lesker	EJTAGXX403A2	用于制备纳米多孔金（np-Au）合金的前驱体
瓷舟	Thomas Scientific	8542E40	用于处理小样品
硝酸	Sigma-Aldrich	43873	以70%浓度用于去合金化
硫酸	J.T Baker	7664-93-9	以96%浓度用于piranha清洗
过氧化氢	J.T Baker	7722-84-1	以30%浓度用于piranha清洗
活检打孔器	Ted Pella	150xx	提供多种尺寸
硅橡胶片	Rogers Corporation	HT 6240	提供多种厚度
六甲基二硅氮烷	Sigma-Aldrich	440191-100ML	用作正性光刻胶的附着促进剂
Microposit MF CD26	Shipley	38490	正性光刻胶显影液
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	正性光刻胶剥离剂
圆形玻璃盖玻片（12 mm）	Ted Pella	26023	用作金属图案和细胞培养的基底
载玻片（1 x 3 英寸）	Ted Pella	26007	用作金属图案的基底
聚酰亚胺 Kapton 胶带	VWR	82030-950	用于固定弹性体
透明光刻掩模	Output City		用于光刻工艺 http://www.outputcity.com/
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-32G	用于活化玻璃表面
溅射仪	Kurt J. Lesker	LAB18	用于金属沉积