用于细胞-材料相互作用研究的纳米多孔金图案微加工

摘要

我们报道了通过掩模版印刷和光刻技术对纳米多孔金薄膜进行微图形化的方法，以及在微加工图案上培养细胞的技术。此外，我们还描述了利用扫描电子显微镜和荧光显微镜技术对材料及培养细胞的形态进行表征的图像分析方法。

摘要

特征尺寸在几十纳米范围内的纳米结构材料已显著提升了多种技术的性能，包括燃料电池、生物传感器、生物医学器件涂层和药物递送工具。通过纳米尺度自组装过程制备的纳米多孔金（np-Au）是一种相对较新的材料，具有较大的有效比表面积、高电导率和催化活性。这些特性使np-Au成为科学界广泛关注的材料。目前大多数关于np-Au的研究采用宏观尺度样品，主要聚焦于该材料的基本科学性质及其在催化和传感领域的应用。然而，宏观样品限制了np-Au在微型化系统（如生物医学器件）中的潜在应用。为解决这一问题，我们首先介绍了两种在刚性基底上对np-Au薄膜进行微图形化的方法。第一种方法采用手工制作的掩模版来生成毫米尺度的np-Au图案，第二种方法则利用剥离式光刻技术实现亚毫米尺度的图案化。由于np-Au薄膜通过溅射沉积工艺获得，因此与传统的微加工技术兼容，易于集成至微系统中。这些微系统包括可电寻址的生物传感器平台，可充分利用其高有效比表面积、良好电导性以及基于金-硫醇化学的表面生物偶联特性。我们还描述了细胞培养、免疫荧光染色和图像处理技术，用于量化np-Au与哺乳动物细胞之间的相互作用，这是某些生物传感器的重要性能参数。我们预期，本文所展示的技术将有助于np-Au在不同尺度平台中的集成，并推动其在生物传感器、储能系统和催化剂等众多领域的广泛应用。

引言

具有纳米尺度特征的材料在提升多种应用方面展现出巨大潜力，包括燃料电池¹、传感器^2,3和生物医学器件^4,5。一种相对较新的材料是纳米多孔金（np-Au），它通过纳米尺度的自组装过程制备而成。np-Au的前驱体是一种金合金，其中最常见的是含银量为60%至80%（原子百分比）。简而言之，其特有的开孔纳米结构是在强酸（例如 70%硝酸）或电化学电位作用下溶解银的过程中，金原子在团簇内重新排列所形成的^6-8。np-Au具备多种理想特性，包括高比表面积、优异的导电性、成熟的表面功能化技术以及良好的生物相容性⁹。尽管近年来关于np-Au的研究迅速增长，但大多数研究集中在其力学性能^10,11、催化活性¹²以及生物分子传感性能^13-15。虽然这些理想特性对多种生物医学工具极具价值^16,17，但该材料在此领域的应用仍较为有限。其中一个可能的原因是，大多数研究主要使用宏观尺度的样品（例如 薄片、箔片和铸锭），而将np-Au集成到微型系统中的技术仍不完善。事实上，采用np-Au薄膜的常规微加工技术实例极少^16-20。随着微型化技术的发展以及对新型生物医学工具的需求日益增长，能够将新材料整合进器件中变得至关重要。这通常要求材料可通过常规微加工技术进行沉积和图形化。此外，通常还需要快速量化细胞-材料相互作....

方案

1. 纳米多孔金的制备

1. 使用 Piranha 溶液清洗基底
   1. 在结晶皿中将 25 ml 过氧化氢（30%）加入 100 ml 硫酸（96%）中，并在加热板上将混合物加热至 65 °C。注意：液体具有极强腐蚀性，必须小心操作。使用后的溶液不得储存在密封容器中，否则可能发生爆炸。
   2. 使用耐酸镊子将 1 英寸 × 3 英寸的显微镜载玻片放入混合液中，清洗 10 分钟。批量清洗小尺寸盖玻片时使用陶瓷免疫染色槽。在浸入溶液前，先用 10 W 空气等离子体处理小尺寸盖玻片 30 秒。
   3. 在流动的去离子水（DI 水）下，于结晶皿中冲洗清洗后的样品 3 分钟。在无尘纸巾上方用氮气枪吹干样品。
2. 制备模板掩膜（方法 1：用于创建毫米级图案）
   1. 在半硬塑料表面上，使用活检打孔器对 250 μm 厚的硅橡胶片进行打孔，和/或使用手术刀切割出所需区域。在 70% 异丙醇中清洗处理后的橡胶片，并用氮气枪吹干。
   2. 将打孔后的橡胶片放置在无尘洁净室纸巾上，将经 Piranha 溶液清洗的盖玻片对准模板放置，样品面朝向模板。
3. 图案化剥离型光刻胶（方法 2：用于创建亚毫米级图案）
   1. 将经 Piranha 溶液清洗的显微镜载玻片放置在旋转卡盘上，并用氮气枪吹去表面颗粒物。使用塑料移液管将 1.5 ml 偶联剂（六甲基二硅氮烷）....

结果

图1概述了主要的实验步骤，包括制备纳米多孔金（np-Au）图案、细胞培养、纳米结构的量化以及细胞形态的表征。图2a（顶部）所示的弹性体掩模用于制备其下方图像中的np-Au图案。图2b为用于批量处理样品的瓷舟的实物照片。图2c展示了金属沉积图案在去合金化处理前后的颜色变化。去合金化前的银白色外观源于富银合金成分；去合金化后，薄膜呈现出明显的橙棕色色调。图2d展示了通过光刻技术对金属进行图案化所获得的更精细结构。通过热处理np-Au薄膜可获得不同的孔隙形态⁹，如图3所示。横截面图像（图3）可揭示薄膜在厚度方向上是否均匀去合金化。扫描电镜（SEM）图像可通过分割（阈值处理）转化为二值图像（图3底行），以确定孔隙的尺寸及孔隙所占面积百分比（代码1）。图4展示了一张典型的荧光图像，显示在np.......

讨论

我们展示了两种不同的技术来对纳米多孔金（np-Au）薄膜进行微图形化，以拓展这些薄膜在微系统和生物研究中的应用。溅射镀金和银是一种制备np-Au图案的通用方法，因为溅射工艺与传统的微加工流程相兼容，且通过分别调节金和银靶材的溅射枪功率以及沉积时间，可方便地控制合金成分和膜层厚度。典型的np-Au薄膜厚度范围为200 nm至2 μm。模板法（方法1， 图 2a) 使用活检打孔器和手术刀可制作毫米级图案，从而避免了光刻的需要。更复杂的图案可通过可编程激光切割机制备。这种柔性的硅胶弹性体掩模可自行粘附于玻璃表面，从而防止金属沉积在掩模下方，提高图案分辨率。然而，更小的特征（<1 mm）通常难以通过此方法制备，因为掩模的厚度会阻碍金属在开口区域的均匀沉积。对于需要更高特征分辨率的应用，可采用光刻图案化方法（方法2， 图 2d）。用于通过光刻技术转移图案的透明掩模可从多家公司获得（例如 输出城市：班顿，俄勒冈州）在所需最小特征尺寸大于约20 μm时，是相较于铬玻璃掩模经济的替代方案。金属沉积到柔性模板上时，有时会因应力分布不均而导致模板从基底上脱落。我们通.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
金靶材	Lesker	EJTAUXX403A2	用于制备纳米多孔金（np-Au）合金的前驱体
铬靶材	Lesker	EJTCRXX353A2	作为粘附层
银靶材	Lesker	EJTAGXX403A2	用于制备纳米多孔金（np-Au）合金的前驱体
瓷舟	Thomas Scientific	8542E40	用于处理小样品
硝酸	Sigma-Aldrich	43873	以70%浓度用于去合金化
硫酸	J.T Baker	7664-93-9	以96%浓度用于piranha清洗
过氧化氢	J.T Baker	7722-84-1	以30%浓度用于piranha清洗
活检打孔器	Ted Pella	150xx	提供多种尺寸
硅橡胶片	Rogers Corporation	HT 6240	提供多种厚度
六甲基二硅氮烷	Sigma-Aldrich	440191-100ML	用作正性光刻胶的附着促进剂
Microposit MF CD26	Shipley	38490	正性光刻胶显影液
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	正性光刻胶剥离剂
圆形玻璃盖玻片（12 mm）	Ted Pella	26023	用作金属图案和细胞培养的基底
载玻片（1 x 3 英寸）	Ted Pella	26007	用作金属图案的基底
聚酰亚胺 Kapton 胶带	VWR	82030-950	用于固定弹性体
透明光刻掩模	Output City		用于光刻工艺 http://www.outputcity.com/
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-32G	用于活化玻璃表面
溅射仪	Kurt J. Lesker	LAB18	用于金属沉积