同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

摘要

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。

摘要

基于定位的超分辨率显微技术可用于获取样品中单个荧光标记的单分子分布的空间图（图像），空间分辨率可达数十纳米。通过使用与目标蛋白融合的光激活（PAFP）或 光可切换（PSFP）荧光蛋白，或与抗体及其他目标分子偶联的有机染料，荧光光激活定位显微技术（FPALM）能够在单个细胞内同时成像多种分子种类。采用以下方法，可在单个细胞中对大量（数千至数十万）单个分子进行成像，并以约10-30 nm的精确定位。所获得的数据可用于理解细胞内多种蛋白类型的纳米级空间分布。该技术的主要优势之一是空间分辨率的显著提高：在传统光学显微镜中，衍射极限将分辨率限制在约200-250 nm，而FPALM可成像比此小一个数量级以上的尺度。由于许多生物学假说涉及不同生物分子之间的空间关系，FPALM的更高分辨率可为细胞结构组织相关问题提供新的见解，而这些问题此前无法通过常规荧光显微技术触及。除了详细描述样品制备和数据采集的方法外，本文还介绍了FPALM的光学装置。对于希望开展超分辨率显微研究的科研人员而言，另一需考虑的因素是成本：自行搭建的系统显著低于大多数商用成像设备的价格。该技术的局限性包括需要优化细胞样品中目标分子的标记效率，以及需要后处理软件来可视化结果。本文描述了使用PAFP和PSFP表达对固定细胞中两种蛋白进行成像的方法。该技术向活细胞成像的拓展也一并进行了说明。

引言

尽管细胞结构存在于多种空间尺度上，但由于衍射极限的物理限制，传统显微镜对小于约250 nm尺度的细胞结构进行荧光成像时受到限制。随着荧光光激活定位显微技术（FPALM¹）及类似技术^2,3, 的发展，这一限制已被突破，这些技术能够以约10 nm的精确定位大量单分子，从而生成分辨率达数十纳米的图像。FPALM基于光学控制，选择性激活和失活部分分子（有关FPALM的完整描述及该成像系统的实施指南，请参见Gould et al.⁴）。该技术可绘制出大量单分子的空间分布图，从而揭示从数十纳米到数十微米尺度范围内的生物学结构。基于定位的超分辨率显微技术（本文简称为定位显微技术）现已发展用于解决一系列生物学问题，技术进步使得例如通过偏振FPALM（P-FPALM）成像单分子取向⁵, ，利用双焦平面FPALM⁶ 或其他方法实现单分子三维荧光成像^7-9, ，以及在活细胞中进行单分子超分辨率荧光成像成为可能^10-12。 定位显微技术也已应用于固定细胞中多种分子的成像^13-16。 最近，已有研究在固定和活细胞中同时实现了三种蛋白质的FPALM成像¹⁷。 定位显微技术可对多种标记方式的样品进行成像：例如表达PAFP或PSFP融合标签的蛋白质、用笼锁型有机染料标记的抗体或分子....

方案

请注意：本实验方案中提及的光学元件的示意图可参见图1。

1. 细胞样品制备

1. 以优化的密度接种细胞（对于NIH-3T3细胞，约为2-5 × 10⁴ 细胞/厘米²²在8孔板的各孔中接种细胞。细胞应接种于适合该细胞类型的完全培养基中，但培养基中不应含有抗生素和酚红，因为酚红会增加背景荧光。需注意，不同细胞系的实验条件（如最佳传代次数范围）可能有所不同。
2. 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞 24 小时₂ （或根据细胞类型的适宜条件）孵育，使细胞贴附在盖玻片上。使用无内毒素的DNA分别转染两种蛋白表达质粒（本实验中为PAmCherry-actin和Dendra2-HA的DNA）。用避光材料（如铝箔）包裹样品。转染应包括同时转染两种质粒的孔以及仅转染其中一种质粒的孔。
3. 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 4–6 小时₂ （或在适合细胞类型的条件下）孵育，然后更换为完全培养基（含抗生素，不含酚红），继续培养16–48小时 以使细胞表达目标蛋白。
   1. 细胞可用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，然后在PBS中与4%多聚甲醛（PFA）（注意：有毒）孵育15分钟以进行固定 在室温下孵育，然后用 PBS 再洗涤 3 次。然而，根据目标蛋白的不同，这种固定....

结果

流感病毒血凝素（HA）会形成尺度在数十纳米至微米范围的簇状结构，这些簇与肌动蛋白的共定位情况各异（图5）。这些空间分布特征支持了此前对这两种蛋白进行的大尺度成像结果²⁸，以及HA空间分布对肌动蛋白的依赖性¹⁹。多色FPALM图像可进一步用于描述这些簇的密度、面积和周长，以及两种分子在纳米和微米尺度上的共定位程度。所获得图像的分辨率在数十纳米量级^1,17；在本处呈现的渲染图像中，图像上的每一个点代表一个单标记蛋白分子的定位，定位精度为20 nm。通过进一步使用透射光源采集整个视场（FOV）的图像（图6），FPALM图像可置于完整细胞及其周围环境的背景下进行观察。

按照上述双色设置记录的图像（另见图1）应与图5所示图像相似。分析的目标是将原始图像时间序列（图3和图4）处理为最终呈现的颗粒位置图像，其中不同颜色代表不同的荧.......

讨论

基于定位的超分辨率成像为生物成像提供了多种强大功能。从将单个光学元件放置于实验台开始，到构建一台能够同时对生物样本中多种荧光物种进行成像的功能性超分辨率显微镜，这一过程面临诸多挑战。在光路调整过程中，某些环节比其他环节更为关键；下文旨在为正在应对这些关键难点的用户提供指导。

关键步骤

FPALM 及类似技术提供的增强图像分辨率需要更加关注显微镜的稳定性。虽然传统显微镜成像通常不会因样品漂移或振荡运动（振动）在约 20-50 nm 尺度上的影响而出现明显畸变，但超分辨率显微镜成像会因此类运动而质量下降。例如，引起非预期运动的来源包括：显微镜和样品内部的温度梯度、安装在气浮台上的设备中的散热风扇、物体意外接触显微镜载物台或气浮台，以及建筑物内部的振动（例如由空气调节设备和其他机械引起的振动）。

为减少这些负面影响，采用减振空气阻尼台可有效抑制或消除局部振动。需要风扇散热或含有其他运动部件的设备应放置在独立的台面上，仅通过（必要的）电线/电缆与另一台面连接。在4 °C下保存的固定样品.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LabTek II 培养小室	Nunc
荧光微球	Invitrogen	F-8801	用于校准的微球
Tetraspeck 微球	Invitrogen	T-7279	四色荧光微球，用于校准
物镜浸油	Zeiss	518F	高数值孔径物镜用浸油（取决于物镜选择）
HPLC 级水	Fisher Scientific	W5-4
培养基	ATCC	30-2003	或 Cellgro 10-090
抗生素	GIBCO	15070-063
血清	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
OptiMEM I	GIBCO	11058-021
胰蛋白酶	MPBiomedicals	1689149
多聚甲醛	Fisher Scientific	AA433689M	注意：有毒