使用荧光光活化定位显微镜对生物结构进行同步多色成像

Summary

我们展示了使用荧光光激活定位显微镜 （FPALM） 同时对细胞内多种类型的荧光标记分子进行成像。所描述的技术可定位数千到数十万个单独的荧光标记蛋白，在单个细胞内的精度达到数十纳米。

Abstract

基于定位的超分辨率显微镜可用于获得样品中单个荧光标记的单个分子分布的空间图（图像），空间分辨率为数十纳米。荧光光激活定位显微镜 （FPALM） 使用与目标蛋白质融合的光激活 （PAFP） 或光开关 （PSFP） 荧光蛋白，或与抗体或其他目标分子偶联的有机染料，可以同时对单个细胞内的多种分子进行成像。通过使用以下方法，在单个细胞中对大量（数千到数十万）单个分子的群体进行成像，并以 ~10-30 nm 的精度定位。获得的数据可用于了解细胞内多种蛋白质类型的纳米级空间分布。该技术的一个主要优点是空间分辨率的显著提高：虽然在传统光学显微镜中衍射将分辨率限制在 ~200-250 nm，但 FPALM 可以将图像长度尺度缩小一个数量级以上。由于许多生物学假说涉及不同生物分子之间的空间关系，因此 FPALM 的分辨率提高可以深入了解以前传统荧光显微镜无法解决的细胞组织问题。除了详细介绍样品制备和数据采集的方法外，我们还在这里描述了 FPALM 的光学设置。对于希望进行超分辨率显微镜的研究人员来说，另一个考虑因素是成本：内部设置比大多数市售成像机便宜得多。该技术的局限性包括需要优化细胞样品中目标分子的标记，以及需要后处理软件来可视化结果。我们在这里描述了使用 PAFP 和 PSFP 表达对固定细胞中的两种蛋白质进行成像。还描述了该技术到活细胞的扩展。

Introduction

虽然细胞结构存在于广泛的空间尺度上，但由于衍射极限的物理限制，在小于 ~250 nm 的长度尺度上对细胞组织的荧光成像在传统显微镜中受到限制。荧光光活化定位显微镜 （FPALM¹） 和类似技术的出现克服了这一限制^2,3，这些技术可以以 ~10 nm 的精度定位大量单个分子，以生成分辨率为几十纳米的图像。FPALM 基于使用光学控制来激活和灭活分子子集（有关 FPALM 的完整描述以及如何实施此成像系统的说明，请参阅 Gould 等人。⁴）. 该技术允许绘制单个分子的整个群体的空间分布，从而阐明从几十纳米到几十微米的长度尺度上的生物结构。基于定位的超分辨率显微镜（以下简称定位显微镜）现已适用于解决一系列生物学问题，技术发展允许使用偏振 FPALM 或 P-FPALM⁵ 对单个分子方向进行成像，使用双平面 FPALM⁶ 或其他技术对单个分子进行三维荧光成像^7-9，以及活细胞中单个分子的超分辨率荧光成像^10-12。定位显微镜也已应用于固定细胞中多种物种的成像^13-16。最近，在固定细胞和活细胞中，使用 FPALM 同时对三种蛋白质进行了成像¹⁷。定位显微镜可以对以多种方式标记的样品进行成像： 示例包括用 PAFP 或 PSFP 融合标签表达的蛋白质、用笼状有机染料标记的抗体或分子，或常规有机染料。虽然使用常规荧光染料可以在没....

Protocol

请注意：图 1 中引用了本协议中引用的光学元件的图示表示。

1. 细胞样品制备

1. 在 8 孔室的孔中以最佳密度（对于 NIH-3T3 细胞，大约为 2-5 x 10⁴ 个细胞/cm²）接种细胞。细胞应接种在适合细胞类型的完全培养基中，但培养基应不含抗生素和酚红，因为酚红会导致背景荧光。请注意，细胞实验的条件（例如最佳传代次数范围）可能因单个细胞系而异。
2. 将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下（或在适合细胞类型的条件下）孵育 24 小时，以使细胞粘附在盖玻片上。用两种蛋白质种类构建体（在本例中为 PAmCherry-actin 和 Dendra2-HA 的 DNA）中的每一种用无内毒素 DNA 转染细胞。用铝箔等不透光材料覆盖样品。转染应包括两种 DNA 构建体的孔，以及仅每种构建体中一种的孔。
在
3. 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 4-6 小时（或在适合细胞类型的条件下），然后更换成完全培养基（含抗生素，不含酚红），并进一步孵育 16-48 小时，以使细胞表达所需的蛋白质。
   1. 可以通过用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤 3 次，然后在室温下与 4% 多聚甲醛 （PFA）（注意：有毒）的 PBS 溶液孵育 15 分钟，然后用 PBS 再洗涤 3 次来固定细胞。然而，根....

Results

流感血凝素 （HA） 形成数十纳米到微米量级的簇，这些簇与肌动蛋白可变地共定位（图 5）。这些空间分布证实了这两种蛋白质的粗尺度成像²⁸，以及 HA 空间分布对肌动蛋白¹⁹ 的依赖性。多色 FPALM 图像可以进一步用于描述这些簇的密度、面积和周长，以及两种物种在纳米和微米尺度上的共定位程度。获得的图像分辨率约为数十纳米^1,17;在此处呈现的渲染图像中，图像上的每个单独点都代表单个标记蛋白质分子的定位，精度为 20 nm。通过使用透射光源进一步获取总 FOV 的图像（图 6），可以在整个单元及其周围环境的上下文中查看 FPALM 图像。

如上所述，

由两种颜色设置记录的图像（另见图 1）看起来应该类似于图 5 中所示的图像。分析的目标是将原始图像时间序列（图 3 和 4）处理成粒子位置的最终渲染图像，颜色代表不同的荧光.......

Discussion

基于定位的超分辨率成像为生物成像提供了许多强大的功能。从放置在桌子上的单个光学元件到能够同时对生物样品中的多种荧光物质进行成像的功能性超分辨率显微镜的路线提出了许多挑战。对齐的某些方面比其他方面更重要;我们努力在下面为处理路线中最困难方面的潜在用户提供指导。

关键步骤

FPALM 和类似技术提供的增强图像分辨率需要更加关注显微镜的稳定性。虽然传统的显微镜图像通常不会因 ~20-50 nm 尺度的样品漂移或振荡运动（振动）而明显失真，但超分辨率显微镜图像会因这种运动而退化。例如，不需要的运动源包括：显微镜和样品内的热梯度、连接到空气台的设备中的冷却风扇、物体与显微镜台或空气台的无意接触，以及建筑物内的振动（例如可能由空气处理设备和其他机械引起）。

为了减少这些负面影响，隔振空气阻尼工作台在缓和或消除局部振动方面非常有效。需要风扇冷却或包含其他移动部件的设备应放置在单独的桌子上，只有（所需的）电线/电缆连接两个桌子。在成像前，应让储存在 4 °C 的固定样品达到室温。对于活细胞成像.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek II 腔室	Nunc
荧光微珠	Invitrogen	F-8801	用于校准的微珠
Tetraspeck 微珠	Invitrogen	T-7279	用于校准的四种颜色微珠
物镜浸油	Zeiss	518F	用于高数值孔径物镜的浸油（取决于物镜的选择）
HPLC 水	Fisher科学	W5-4
培养基	ATCC	30-2003	或 Cellgro 10-090
抗生素	GIBCO	15070-063
血清	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
胰蛋白酶	MPBiomedicals
多聚甲醛	Fisher Scientific	AA433689M	注意：有毒