我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。
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摘要
摘要
基于定位的超分辨率显微技术可用于获取样品中单个荧光标记的单分子分布的空间图（图像），空间分辨率可达数十纳米。通过使用与目标蛋白融合的光激活（PAFP）或 光可切换（PSFP）荧光蛋白，或与抗体及其他目标分子偶联的有机染料，荧光光激活定位显微技术（FPALM）能够在单个细胞内同时成像多种分子种类。采用以下方法，可在单个细胞中对大量（数千至数十万）单个分子进行成像，并以约10-30 nm的精确定位。所获得的数据可用于理解细胞内多种蛋白类型的纳米级空间分布。该技术的主要优势之一是空间分辨率的显著提高：在传统光学显微镜中，衍射极限将分辨率限制在约200-250 nm，而FPALM可成像比此小一个数量级以上的尺度。由于许多生物学假说涉及不同生物分子之间的空间关系，FPALM的更高分辨率可为细胞结构组织相关问题提供新的见解，而这些问题此前无法通过常规荧光显微技术触及。除了详细描述样品制备和数据采集的方法外，本文还介绍了FPALM的光学装置。对于希望开展超分辨率显微研究的科研人员而言，另一需考虑的因素是成本：自行搭建的系统显著低于大多数商用成像设备的价格。该技术的局限性包括需要优化细胞样品中目标分子的标记效率，以及需要后处理软件来可视化结果。本文描述了使用PAFP和PSFP表达对固定细胞中两种蛋白进行成像的方法。该技术向活细胞成像的拓展也一并进行了说明。
引言
尽管细胞结构存在于多种空间尺度上，但由于衍射极限的物理限制，传统显微镜对小于约250 nm尺度的细胞结构进行荧光成像时受到限制。随着荧光光激活定位显微技术（FPALM1）及类似技术2,3, 的发展，这一限制已被突破，这些技术能够以约10 nm的精确定位大量单分子，从而生成分辨率达数十纳米的图像。FPALM基于光学控制，选择性激活和失活部分分子（有关FPALM的完整描述及该成像系统的实施指南，请参见Gould et al.4）。该技术可绘制出大量单分子的空间分布图，从而揭示从数十纳米到数十微米尺度范围内的生物学结构。基于定位的超分辨率显微技术（本文简称为定位显微技术）现已发展用于解决一系列生物学问题，技术进步使得例如通过偏振FPALM（P-FPALM）成像单分子取向5, ，利用双焦平面FPALM6 或其他方法实现单分子三维荧光成像7-9, ，以及在活细胞中进行单分子超分辨率荧光成像成为可能10-12。 定位显微技术也已应用于固定细胞中多种分子的成像13-16。 最近，已有研究在固定和活细胞中同时实现了三种蛋白质的FPALM成像17。 定位显微技术可对多种标记方式的样品进行成像：例如表达PAFP或PSFP融合标签的蛋白质、用笼锁型有机染料标记的抗体或分子，或常规有机染料标记的样品。虽然使用常规荧光染料可在无需融合蛋白标签的情况下标记蛋白质，但超分辨率成像中使用非笼锁型有机染料通常要求样品浸入还原性缓冲液中2。 此外，抗体-染料偶联物的细胞内递送通常需要对细胞进行固定并通透化处理，或通过电穿孔等手段使活细胞膜通透。还原性缓冲条件和膜通透化的要求限制了有机染料在活细胞成像中的适用性，尽管近期发展已实现了HaloTag与FPALM的有效结合，用于膜结构的成像18。
FPALM 是首个应用于活细胞的定位显微技术10。 在活细胞中，FPALM 除了能够提供标记分子位置随时间变化的空间图谱外，还可以在多个图像帧中追踪单个分子，并在毫秒时间尺度上确定分子的运动轨迹19。 因此，FPALM 能够实现较短时间尺度 和 纳米级分辨率的观测。
多色FPALM可用于多种不同的探针，包括光激活蛋白以及有机笼锁或非笼锁染料。本文详细介绍了同时成像两种荧光蛋白——Dendra2和PAmCherry的实验方案与系统设置。我们报道了在NIH-3T3成纤维细胞中对PAmCherry标记的β-肌动蛋白（PAmCherry-actin）和Dendra2标记的流感病毒血凝素（Dendra2-HA）进行成像的结果。系统设置中所描述的组件可根据其他探针的需求替换为更合适的硬件；若涉及此类替换，文中均已明确说明。
多色FPALM技术非常适合报告活细胞或固定细胞中多种蛋白质的空间分布。该技术特别适用于研究纳米尺度范围内的空间和/或动态关系，尽管成像结果可反映从数十纳米到数十微米范围内不同尺度的定位信息。多色FPALM的一个主要优势在于系统构建成本相对较低，并且在使用多种探针组合时具有很高的灵活性。通过组件自行搭建和校准系统的过程，还能深入理解可能影响数据质量和可解释性的各种因素，从而提升研究结果的可靠性。本文详细描述了利用FPALM技术，结合PSFP和PAFP融合蛋白构建体，对多种蛋白质进行光学系统搭建、样品制备及数据采集的方法。尽管本方案以固定细胞的分析为例，但这些操作流程同样可直接适用于活细胞成像。
此处描述的光学装置非常适合同时对光转换荧光蛋白 Dendra2 和光活化荧光蛋白 PAmCherry 进行成像。许多其他探针也可用于多色成像；然而，所需的具体组件可能因所选探针的激发和发射光谱不同而有所差异。应根据这些因素来选择合适的二向色镜、滤光片和激光波长。
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方案
请注意：本实验方案中提及的光学元件的示意图可参见图1。
1. 细胞样品制备
- 以优化的密度接种细胞（对于NIH-3T3细胞，约为2-5 × 104 细胞/厘米²2在8孔板的各孔中接种细胞。细胞应接种于适合该细胞类型的完全培养基中，但培养基中不应含有抗生素和酚红，因为酚红会增加背景荧光。需注意，不同细胞系的实验条件（如最佳传代次数范围）可能有所不同。
- 在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下培养细胞 24 小时2 （或根据细胞类型的适宜条件）孵育，使细胞贴附在盖玻片上。使用无内毒素的DNA分别转染两种蛋白表达质粒（本实验中为PAmCherry-actin和Dendra2-HA的DNA）。用避光材料（如铝箔）包裹样品。转染应包括同时转染两种质粒的孔以及仅转染其中一种质粒的孔。
- 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 4–6 小时2 （或在适合细胞类型的条件下）孵育，然后更换为完全培养基（含抗生素，不含酚红），继续培养16–48小时 以使细胞表达目标蛋白。
- 细胞可用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，然后在PBS中与4%多聚甲醛（PFA）（注意：有毒）孵育15分钟以进行固定 在室温下孵育，然后用 PBS 再洗涤 3 次。然而，根据目标蛋白的不同，这种固定方法可能导致大量带标签的分子仍保持运动性。为进一步降低分子流动性，可选用其他固定方法，包括使用预冷的 100% 甲醇，或含 0.2% 戊二醛和 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液 >30 分钟 在 25 °C20. 无论采用哪种方法，细胞均应如上所述用 PBS 洗涤。需要注意的是，在某些成像条件下，使用戊二醛可能会增加背景荧光或自发荧光，可能需要在固定后用硼氢化钠进行处理。21.
- 样品可在成像前置于4 °C、浸没于PBS中，并用自封膜密封，最多保存7天。
2. 显微镜校准
- 将校准标尺（分划板）放置在显微镜载物台上。使用10X 物镜和透射光光源，将分划板置于视野（FOV）中央。
- 科勒照明。 将显微镜调节至科勒照明状态22。 首先，关闭视场光阑，并通过目镜观察分划板，调节其至视野中央。如果视场光阑边缘模糊，调节聚光镜高度，直至视场光阑和分划板均清晰聚焦。
- 调节视场光阑的横向位置，使其与视野中心对齐。关闭视场光阑，直至仅分划板中心网格被照亮。
- 对于相机位置的粗略对准（即 首次搭建系统时），在相机快门关闭的情况下使用高亮度光源，在到达步骤2.5之前，不要将任何组件放入光学路径中的B盒内（图 1）。初次对准相机时，不要将L2和L3放入检测光路中。通过调节相机的垂直和水平位置，大致将分划板图像居中于相机快门处（图 2B）。关闭EM增益，关闭室内灯光，并打开相机快门。
- 将光源强度降低至不会损坏相机传感器的水平后，将分划板图像的光线直接投射到相机传感器上（图 2A）。在采集软件的实时视频模式下观察图像，同时调节显微镜调焦旋钮，使分划板图像清晰对焦。通过调节相机的垂直和水平位置，将分划板图像精确居中于相机传感器上（图 2B）。
- 将L2和L3插入光阑与相机之间的检测光路中（图 2C）。对准L2和L3，使L2距离显微镜出射端口的焦点为一个焦距，L3距离相机传感器也为一个焦距。L2与L3之间的距离理论上应等于L2和L3焦距之和，但可根据空间限制进行适当调整。相机和透镜的高度应与出射端口保持一致。
- 注意，从显微镜出射的光线应居中于L2和L3。调节L2与显微镜之间的距离，确保分划板图像在相机和目镜中均清晰对焦。
- 如有必要，可通过微小平移（例如 <1 mm）调节L2和L3的位置，以使分划板图像精确居中于相机传感器上。
- 双色模块。 在相机位置优化完成后，将B盒中所示组件（图 1）安装到检测光路中。这些组件可固定在一个可拆卸的支架上，以便在进行多色FPALM实验时插入整个模块，或在无需该模块的其他FPALM应用中将其移除。
- 首次组装这些组件时，应调节各通道的光路长度使其相等。将分划板图像投射到相机芯片上，调节M7和M9，和/或关闭检测光阑（AP），以防止两个通道之间的空间重叠。对反射光通道中的分划板图像进行对焦。
- 如果透射光通道中的图像未对焦，平移M9（必要时旋转），直至两个通道中的分划板图像同时清晰对焦。注意两个通道应彼此横向错开（图 2D）。这种错开方向无论是水平还是垂直，都可能影响采集速度。更多详细信息，请参阅相机用户手册。
- 记录分划板标尺的静态图像（用于后续计算整体放大倍率）。使用相机软件选择所需的感兴趣区域。通常，感兴趣区域越小，帧率越高。
3. 激光准直
- 打开读出和激活激光器。（警告：操作人员必须接受过激光安全培训后方可使用激光器。）激光对准时，实验室所有门应保持关闭，仅允许经过培训的必要人员进入实验室。不使用时，应使用快门 SH1 和 SH2 分别遮挡读出和激活光束，并使用中性密度（ND）滤光片将激光功率衰减至安全水平（<1 mW）。对准时建议尽量降低室内照明，仅保留必要的安全照明。
- 遮挡激活光束和读出光束。从激光光路中移除透镜 L1。
- 将一张白卡紧贴于反射镜 M4。大多数商用复合显微镜内置有遮挡入射照明的快门。如有此功能，请打开显微镜快门，并调节焦距，直至分划板图像投射到 M4 上。若显微镜无内置快门，则应在合适位置使用外部快门，以完全阻断进入显微镜的所有激光束。
- 将读出激光在视场（FOV）中居中。 解除读出光束的遮挡。通过调节反射镜 M1，使读出光束对准 M4 上分划板图像的十字线中心。
- 将分划板图像投射到反射镜 M5 上，并调节反射镜 M4，使光束在 M5 上的分划板十字线中心对准，从而确保读出光束在 M4 和 M5 处均与分划板十字线中心对齐。随后遮挡读出光束。
- 将激活激光在视场（FOV）中居中。 将分划板图像投射到反射镜 M3 上，并从激光光路中移除扩束镜（BE）。
- 调节反射镜 M2，使激活光束对准 M3 上分划板图像的十字线中心。对准后，将扩束镜（BE）重新安装于 M2 与 M3 之间，并调节其位置，直至光束在 M3 上的分划板十字线中心对准。
- 使用 10X 物镜，将分划板图像投射到 M5 上，必要时调节显微镜的调焦旋钮以获得清晰图像。调节二向色镜 DM1 的角度，使激活光束在 M5 处的分划板图像中心对准。随后遮挡两束光。
- 在无物镜安装且显微镜快门打开的情况下，将读出激光通过显微镜的后光阑射出。（警告：此步骤会产生激光安全风险，因平行激光束将沿未遮挡的垂直路径传播。）调节 M5，使光束垂直射出显微镜，投射至正上方天花板，或对准安装在物镜转盘上的卡片中心。
- 可选：可通过在样品台上放置染料溶液样品（本例中为水中或甲醇中约 100 µM 的罗丹明 B，深度 >0.5 cm，以便肉眼观察），并使用 60X 物镜，辅助判断对准是否正确。若光束对准正确，物镜将投射出一个与物镜及显微镜轴线对齐的荧光锥。若激光束在物镜后光阑中的位置有微小偏差，该荧光锥将偏离完全垂直的方向。
- 遮挡两束光。将透镜 L1 安装在激光光路中，距离物镜后光阑适当距离（即 一个焦距）。安装 60X 物镜后，使读出光束投射至天花板。调节 L1 的水平和垂直位置（垂直于激光传播方向），直至光束位于显微镜正上方中心。注意：此步骤中光斑将比前一步更大。
- L1 的轴向位置及其焦距将影响样品处照明区域的大小。严格来说，计算样品处的照明光强分布需考虑衍射效应23。 但粗略而言，若将 L1 置于与物镜后焦平面距离 不等于 一个焦距的位置，通常会导致比恰好位于一个焦距时更小但更集中的激光照明光斑。较小的照明区域可用于产生更高的激光强度，适用于高速成像等特定应用。
- 读出光束轮廓的测量。 安装 L1 后，在载物台上放置适当浓度的染料溶液样品（本例中为水中约 100 µM 的罗丹明 B）。
- 遮挡激活激光，将读出激光（调节 ND1 使所有暴露光束的功率 <<1 mW）通过 60X 物镜照射至染料中，并（关闭 EM 增益）将图像传送到相机。
- 将物镜聚焦至样品中。此步骤需足够大的孔径，以实现对整个光束轮廓的成像。
- 横向移动活化平面（AP），使光束轮廓中心与 AP 中心重合。使用相机软件选择感兴趣区域，使相机读出区域尽可能小并覆盖两个通道。记录这些坐标。拍摄单张图像（即为读出光束轮廓）。
- 当染料溶液样品尽可能薄时，所获得的图像能更准确地反映焦平面处的激光轮廓。可通过在载玻片与盖玻片之间滴加约 5 µL 染料溶液来制备此类薄样品。
- 激活光束轮廓的测量。 遮挡读出激光。将激活激光投射至样品，并将该图像传送到相机。
- 如有必要，使用 EM 增益 <100，并调节 DM1，使光束在每个视场（FOV）中居中。拍摄激活光束轮廓的单张图像。
- 测量每束光的功率。 移除染料溶液，将功率计传感器置于 60X 物镜上方（无浸没介质）。分别测量每束光（激活和读出）的功率。注意，必须仔细调节功率计位置，以确保所有发射的激光功率均照射到功率计传感器上。
- 对每束激光，使用中性密度滤光片（ND1 和 ND2）调节功率，使样品处的光强适合实验需求。
- 图像采集时读出激光的强度。 读出激光强度应足够高，以便在数帧时间内激发并光漂白单个分子。典型值为 103-104 W/cm2（另见 Gould 等4）。样品处的光强取决于成像区域的大小，因此不同系统达到所需光强所需的功率各不相同。
- 激活激光的强度。 激活激光强度应选择为使每个采集帧中激活的分子数量较少（例如 1–100 个）。粗略而言，当激活分子间的最短距离略大于衍射极限分辨率时，即达到所需密度（另见第 6 节，成像）。随着未激活单分子数量的减少，需要更高的激活激光强度。典型强度为 10-1-102 W/cm2。
- 优化四分之一波片。 四分之一波片（QWP）为可选元件，但使用 QWP 提高读出和激活激光的圆偏振度可增加最终图像中的分子密度。为优化 QWP，将偏振片置于 QWP 与 M5 之间。遮挡激活激光，将读出激光通过干燥的 60X 物镜上方的功率计。
- 记录 QWP 的角度。调节偏振片，分别达到最大和最小功率。记录这两个值，并计算最小值与最大值的比值。调节 QWP 的角度并重复上述测量。虽然理想情况下该比值应接近 1.0，但比值大于>0.8 即可满足成像要求。
4. 创建用于通道对齐的持久性微珠样本
- 将荧光微球样品（直径 40-100 nm）用 HPLC 级水按 1:70 的比例稀释。再将该储备液用 HPLC 级水进一步稀释 1:15，最终获得 200 µl 的微球悬浮液。
- 用液态多聚-L-赖氨酸包被盖玻片，在室温下孵育 30 分钟。吸除溶液后，用 HPLC 级水清洗盖玻片三次。彻底吸除盖玻片上残留的水分，并在室温下晾干。
- 将 200 µl 微球悬浮液滴加至盖玻片上，在室温下静置 20 分钟 ，然后用 HPLC 级水洗涤三次。或者，也可将盖玻片在室温下过夜放置，使悬浮液自然干燥。
- 使用约 20 µl HPLC 级水或封片剂，将盖玻片封固于载玻片上。用透明指甲油密封盖玻片边缘。待指甲油完全干燥后，将盖玻片（连同相应的物镜浸没介质，水或油）置于 60X 物镜下进行观察。
5. 图像采集：对检测通道进行成像微珠样本的校准
- 用读出激光束照射珠子样品，激光强度约为10倍 低于成像时所用的强度。将EM增益设为100，将图像投射至相机，并调节焦距，直至在两个通道中均可观察到微珠。
- 如果微珠信号较弱，可增加激光功率或EM增益。通过检测大量光子来最小化微珠图像中的噪声， 即 每个微珠至少采集5,000个光子）对于准确的通道配准至关重要。将相机设置为记录100帧，曝光时间与后续FPALM成像所用时间相同。
- 寻找微珠分布在通道中央和边缘区域均有分布，且微珠密度足够低、能够使单个微珠彼此分离并可被单独识别的区域。
- 在这些微珠密度下，获取10至20组不同区域的图像。有关使用微珠图像进行通道校准的详细信息，请参见结果部分。
6. 图像采集：多色荧光光激活定位显微镜（FPALM）
- 对仅转染了每种构建体之一的细胞以及转染了全部构建体的细胞均进行成像非常重要。这些数据有助于建立所用每种探针的alpha直方图，并且是解读多色数据所必需的。
- 寻找正在表达光可切换探针的细胞（若使用此类探针）。 消除所有室内光源。通过翻转镜架（FM）将汞灯投射到样品（含转染细胞）上。将物镜转换器上的滤光片组更换为包含适当二向色镜/滤光片组合的滤光片组，以实现对标记物预光转换状态的激发。例如，对于成像预光转换的Dendra2或具有绿色预转换发射的探针，DM4的一种选择是反射蓝光的二向色镜（<488 nm）以及F5为滤光片，允许约500-570 nm波长的光通过，同时阻隔此范围以外的光。
- 使用目镜寻找表达预光转换探针的细胞。例如，表达 Dendra2 的细胞会呈现绿色。注意，并非所有探针都具有光转换特性，且根据其预转换后的发射光谱，具有光转换能力的探针可能需要使用与本处所列不同的DM4/F5滤光片组合。
- 选定细胞后，将荧光显微镜（FM）下调，使激光能够进入显微镜（同时阻断汞灯光源） 从光路中移除滤光轮。将滤光轮更换为适用于成像的合适二向色镜（本例中，DM2 应反射读出光和激活激光，同时透射更长波长的光，而 F1 应透射激光波长以上的红光，并在激光波长处具有理想的高抑制性能）。
- 如果细胞未表达光可切换探针，则通过将图像投射到相机并使用读出激光照射样品来寻找细胞。单个分子可能可见（参见 图3在许多细胞中。
- 为区分转染细胞与背景荧光（背景荧光可能仍表现为单个闪烁的分子）并确认分子具有光激活特性，需使用低功率的激活激光（通常为微瓦量级）短暂照射样品。在读出激光下可见的光激活分子数量应显著增加，并在激活光照停止后仍短暂维持较高水平。需注意，不同探针在亮度、光转化效率以及激活所需激光功率方面可能存在显著差异。24-27.
- 通过将EM增益设为200，并选择所需的帧数（通常为5,000–10,000帧）和曝光时间（通常10–30毫秒较为合适），为动力学序列采集准备相机软件。尽管EM增益可设置为高于200，但超过一定限度后，继续提高EM增益可能会增加噪声。
- 遮蔽激活光束。打开读出光束，并将被照亮细胞的图像投射到相机上。
- 确认细胞已转染（步骤6.6）。在观察细胞时，调节焦距直至目标焦平面清晰可见，且分子处于清晰对焦状态。
- 选择靠近细胞底部膜的焦平面时，先将焦距向下调节，直至单个分子不再可见。然后逐渐向上调节焦距，直至分子首次可见。
- 为了对靠近顶部细胞膜的区域进行成像，继续通过显微镜调焦旋钮或自动调焦系统向上调节焦点至所需距离，并记录移动距离。选择这两个极限位置之间的焦平面区域进行成像，将获得细胞中部区域的图像。
- 解除激活光束的阻断，并用低强度光照照射样品（使用ND2滤光片将光束衰减至非常低的强度，大约 <1 W/cm2 在样品处）。
- 开始数据采集。需要较高的活性分子密度；然而，分析步骤的关键在于这些分子在空间上不能相互重叠。
- 尽量保持可见的光激活分子密度为 ~0.1–1 µm-2 通过调节ND2。通常，对于直径约10-20 µm的成像区域，可同时观察到约10-100个分子（参见 图示 3 和 4 作为参考）。随着采集过程中剩余的非活性分子数量逐渐减少，可能需要逐步增加激活激光功率以维持密度。
- 如果需要进行TIRF成像*，M5和L1应同时安装在同一个平移台（TS， 图 1）向侧向移动（即 在显微镜入口后方紧邻处，沿垂直于激光的方向进行调整。当M5和L1平移时，通过物镜向上穿过样品射出的激光将逐渐向一侧倾斜（注意：存在激光安全风险）。
- 当激光束与垂直方向的夹角达到90°时，出射激光本身将消失，入射的读出激光将被背向反射，形成一束从物镜后孔径射出的光束，该光束与入射光束反平行且侧向偏移。
- 同时，背景荧光将几乎完全衰减，含有可分辨的、聚焦单分子的样本区域厚度将显著降低。
TIRF 可实现对样品中盖玻片上方约 100–500 nm 薄层区域的成像。若需对样品更深层的焦平面进行成像，可轻松采用宽场照明（第 3 节），但该方法不适用于 TIRF。 - 采集完成后，立即关闭显微镜快门，并阻断两束光路。关闭电子倍增增益，将相机设置为记录单帧图像，并将相机读出区域设为最大尺寸。
- 通过将卡片放置在 F3 或 F4 上来阻断一个通道。使用长通滤光片（>安装在显微镜光源上的580 nm滤光片用于照射样品，并将图像投射到相机上。记录细胞的单张图像。
- 可选：保持一个通道仍处于阻断状态，打开光圈，使样品的较大区域在透射光照明下可见。拍摄一张快照。这些透射光图像对于观察相应FPALM图像的背景非常有帮助。
- 活细胞成像 对活细胞进行成像时，按照步骤1.1–1.3转染细胞，但不要固定这些样品。相反，按上述方法完整安装设备，但在成像前将样品从37 °C和5% CO₂环境中取出。2，用PBS洗涤3次，将样本浸入成像介质中（例如 含20 mM葡萄糖的PBS）。去除培养基并进行洗涤可降低大多数细胞培养基相关的背景干扰。
- 样品可根据需要在室温下成像，如同固定细胞一样，或在37 °C和5% CO₂条件下成像2 使用安装在显微镜载物台上的孵育装置。NIH 3T3细胞单一样本在成像培养基中的浸没时间不应超过约1小时。在开展此类实验前，可先观察细胞对成像培养基浸没的反应，以优化浸没时间及成像培养基的组成，从而减少对细胞的干扰。
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结果
流感病毒血凝素（HA）会形成尺度在数十纳米至微米范围的簇状结构，这些簇与肌动蛋白的共定位情况各异（图5）。这些空间分布特征支持了此前对这两种蛋白进行的大尺度成像结果28，以及HA空间分布对肌动蛋白的依赖性19。多色FPALM图像可进一步用于描述这些簇的密度、面积和周长，以及两种分子在纳米和微米尺度上的共定位程度。所获得图像的分辨率在数十纳米量级1,17；在本处呈现的渲染图像中，图像上的每一个点代表一个单标记蛋白分子的定位，定位精度为20 nm。通过进一步使用透射光源采集整个视场（FOV）的图像（图6），FPALM图像可置于完整细胞及其周围环境的背景下进行观察。
按照上述双色设置记录的图像（另见图1）应与图5所示图像相似。分析的目标是将原始图像时间序列（图3和图4）处理为最终呈现的颗粒位置图像，其中不同颜色代表不同的荧...
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讨论
基于定位的超分辨率成像为生物成像提供了多种强大功能。从将单个光学元件放置于实验台开始，到构建一台能够同时对生物样本中多种荧光物种进行成像的功能性超分辨率显微镜，这一过程面临诸多挑战。在光路调整过程中，某些环节比其他环节更为关键；下文旨在为正在应对这些关键难点的用户提供指导。
关键步骤
FPALM 及类似技术提供的增强图像分辨率需要更加关注显微镜的稳定性。虽然传统显微镜成像通常不会因样品漂移或振荡运动（振动）在约 20-50 nm 尺度上的影响而出现明显畸变，但超分辨率显微镜成像会因此类运动而质量下降。例如，引起非预期运动的来源包括：显微镜和样品内部的温度梯度、安装在气浮台上的设备中的散热风扇、物体意外接触显微镜载物台或气浮台，以及建筑物内部的振动（例如由空气调节设备和其他机械引起的振动）。
为减少这些负面影响，采用减振空气阻尼台可有效抑制或消除局部振动。需要风扇散热或含有其他运动部件的设备应放置在独立的台面上，仅通过（必要的）电线/电缆与另一台面连接。在4 °C下保存的固定样品...
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披露
S.T.H. 和 M.J.M. 拥有超分辨率显微镜领域的专利。S.T.H. 担任 Vutara 公司科学咨询委员会成员。
致谢
作者谨此感谢 Philip Andresen、Matthew Parent 和 Sean Carter 在计算机编程、技术支持以及有益讨论方面提供的帮助，感谢 Pat Byard 在行政事务上的协助。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）职业奖 K25-AI65459、NIH R15 GM094713、美国国家科学基金会（NSF）MRI CHE-0722759、缅因州技术研究所 MTAF 1106 和 2061 以及缅因州经济改善基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LabTek II 培养小室 | Nunc | ||
| 荧光微球 | Invitrogen | F-8801 | 用于校准的微球 |
| Tetraspeck 微球 | Invitrogen | T-7279 | 四色荧光微球，用于校准 |
| 物镜浸油 | Zeiss | 518F | 高数值孔径物镜用浸油（取决于物镜选择） |
| HPLC 级水 | Fisher Scientific | W5-4 | |
| 培养基 | ATCC | 30-2003 | 或 Cellgro 10-090 |
| 抗生素 | GIBCO | 15070-063 | |
| 血清 | Thermo Scientific | SH30087.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 52887 | |
| OptiMEM I | GIBCO | 11058-021 | |
| 胰蛋白酶 | MPBiomedicals | 1689149 | |
| 多聚甲醛 | Fisher Scientific | AA433689M | 注意：有毒 |
参考文献
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
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