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使用自动化三维追踪系统记录成年斑马鱼个体及鱼群行为

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DOI：

10.3791/50681

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2013年12月5日

 ,  , 
1R&D, xyZfish

本文内容

摘要

介绍了一种可追踪单条及群体斑马鱼的三维自动视频系统。作为应用示例，我们探讨了NMDA受体拮抗剂MK-801对斑马鱼群行为的影响。

摘要

与许多水生动物一样，斑马鱼（斑马鱼）在三维空间中运动，因此最好使用三维记录系统来研究其行为。本文介绍的自动视频追踪系统通过使用镜面系统和校准程序，校正了光线从水中进入空气时产生的显著误差，从而实现了三维追踪。利用该系统，可记录单条或多条成年斑马鱼的行为。在使用前，系统需进行校准。系统由三个模块组成：记录、路径重建和数据处理。本文提供了校准及使用这三个模块的逐步操作方案。根据实验设置的不同，该系统可用于测试新奇环境恐惧（neophobia）、畏光行为、社会聚集性、运动功能障碍以及新物体探索行为 等等它作为一种初步研究工具，在评估药物或基因突变对基本行为模式影响方面具有特别广阔的前景。该系统可提供斑马鱼在垂直和水平方向上的分布信息，记录运动学参数的xyz分量（如运动、速度、加速度和转向角），并在测试鱼群时提供计算社会凝聚性相关参数所需的数据。

引言

斑马鱼已成为生物学和药理学研究的重要模型1-3. 追踪单条斑马鱼及斑马鱼群的运动轨迹与空间分布模式具有重要价值。早期研究采用基于记录图像的手动定量方法4现在，二维自动视频追踪系统已得到广泛应用5然而，由于斑马鱼以及许多其他水生和非水生动物在三维空间中运动，人们对三维系统的研究兴趣正在增加6该描述的三维系统最初于2007年发表。7有关技术细节及其他系统的比较，请参见8与其它系统相比，该系统的基本优势在于利用镜面系统获取两个（可选三个）同步且独立的视图，并采用两步校准协议。第一步校准立体系统（由相机和镜面构成）的三维几何结构；第二步校正由光折射引入的非线性误差。在研究水生动物时，若不校正光折射的影响，其造成的误差可能相当显著。其他已发表的系统（包括较新的发展）9省略两步校准程序。有关物体识别、多物体跟踪中的遮挡处理以及抖动噪声的技术细节 等等请参阅原始文献8,9该系统已通过焦虑样行为反应研究的验证10,11，群集行为8,11,12 在斑马鱼中表现出拮抗行为的初步研究13。它还被测试用于其他鱼类物种（金鱼8，剑尾鱼，虎皮鱼）以及小鼠9.

下文将描述系统的校准和使用方案，并以NMDA受体非竞争性拮抗剂MK-801对斑马鱼群集行为影响的实验结果作为代表性示例，展示该系统可获得的数据类型。

无论是在自然环境中还是在水族馆中，斑马鱼通常都会成群游动14。成群行为的偏好似乎取决于多种因素，例如饲养条件、性别以及食物可获得性14,15。有趣的是，当存在潜在危险信号（如警戒信息素16或新异刺激11）时，斑马鱼个体之间的距离会变得更小。因此，成群行为范式也被用于测试抗焦虑药物的效果17。等级支配关系18和社会学习19是斑马鱼行为中引人入胜的方面。由于其高度发达的社会行为特征，斑马鱼也已成为自闭症研究的关注对象20,21。

已有研究报道，MK-801 会改变斑马鱼的社会行为5,22,23，这与其对哺乳动物的影响相似24。然而，MK-801 还会对其他行为产生多种影响（如游泳行为、抑制性回避和位置偏好25-27）。因此，在初始实验中，通过基本观察尽可能获取更多信息至关重要，这将为设计更具针对性的实验提供基础。

记录设备与软件的概览

在当前配置下，用于盛放斑马鱼的观察容器（25 cm × 25 cm × 18 cm，长×宽×高）被放置于观察室（91 cm × 46 cm × 56 cm，长×宽×高）内。观察室内还包含一台相机，以及一面悬挂在约 >容器上方45°角，LED灯条 图1 显示了一个简化示意图。相机同时记录前方视角和顶部视角（镜面反射），通过确定斑马鱼的 x、y 和 z 坐标来构建其三维运动轨迹。为便于确定方向，观察容器左前角（相对于相机的位置）标有坐标矢量，该坐标系与三维视图中所示的矢量相对应例如 图15由路径重建模块（见下文）生成。采样率取决于相机和计算机性能，在我们的实验中约为 40 帧/秒 （帧/秒）。所记录画面的空间分辨率为 640 × 480 像素（该配置在空间分辨率与时间分辨率之间达到了最佳平衡，故被选用）。需要 Windows XP 或更高版本操作系统。

在首次记录之前，必须对系统进行校准，以确定容器壁和水面的位置，确定记录图像的缩放系数，并校正光线从水中进入空气时因折射而产生的显著误差。原则上，校准仅需在初次安装时进行，或在摄像头、镜子等装置部件移动或更换后进行。然而，定期检查校准是否仍然准确，并在必要时重新校准，是一种良好的实验操作规范。

该软件包含三个模块。记录模块用于记录图像帧（图2展示了两个示例帧）。轨迹模块用于重建每条斑马鱼的运动路径。数据处理模块用于计算一系列标准的运动学和空间参数。为便于进一步分析，数据可导入电子表格或统计软件中。

方案

所有实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 校准

  1. 将一个空的观察容器放入腔室中，使容器的支脚插入用于准确定位的孔内。调整容器方向，使其半透明壁面（该结构的作用是减少反射）朝向相机的远端和右侧。
  2. 打开 记录模块，选择“Camera control”并调整“gain”和“shutter”（取消选中右侧的复选框），使图像清晰。将侧镜以约45°角放置在观察容器的左侧，确保计算机显示器上容器的侧面视图完全可见。此外，需调整镜面角度，使容器的前壁在图像中呈现为一条直线（如箭头所示） 图3).
  3. 将校准面板连接至并行端口（相机卡的端口），然后按下“LED 面板开/关”按钮 记录模块 打开LED灯。
  4. 将校准面板放入空的观察容器中，使计算机显示器上的前方、顶部和侧面视图均可看到5个LED。 图3 （有时电缆会遮挡视野，此时应将其移开）。还需确保LED灯位于水位标记线以下（这些标记线刻在观察容器内壁，距容器底部内侧135 mm处），并确保面板位置稳定（以免在1.9步骤加水时发生移动）。
  5. 关闭观察室的灯光并拉上窗帘（注意不要触碰校准板的电缆或侧镜）。
  6. 点击“数据存储位置”按钮，创建或选择一个用于保存校准文件的文件夹。这些文件将在后续所有记录（或实验）中使用，直至需要重新校准为止。因此，建议将校准数据的相关信息纳入校准文件夹的名称中。
  7. 调整计算机屏幕上的三个红色方框，使每个方框恰好包含任意一个视图中的5个LED图4，左侧面板）。再次使用“Camera control”（相机控制）下的“gain”（增益）和“shutter”（快门）设置，获得LED的清晰图像，且无其他光点的成像（这些光点由噪声、容器壁上的反射或水滴引起），如 图 4，右侧面板。
  8. 关闭LED，然后点击“Collect calibration w/o water”按钮。计算机屏幕上会出现5个标有编号0-4的标签（'x'）。打开面板电源，标签的位置应与LED位置重合。若不重合，请重复步骤1.7（参见 图4 左侧面板展示标签分配错误的情况，右侧面板展示标签分配正确的情况。
  9. 将观察室注水至标记处。LED 应位于水面以下（如步骤 1.4 中所述）。若 LED 处于水位以上，请排空容器并返回步骤 1.4。向容器注水时，需注意避免 LED 面板移动；若发生移动，应排空容器并返回步骤 1.4。此操作至关重要，因为校准过程依赖于测定有水和无水条件下所记录的 LED 位置差异。
  10. 点击“Collect calibration w. water”按钮。与步骤1.8类似，屏幕上将再次出现五个标记，这些标记的位置在大多数情况下会与无水校准所得的位置略有偏移。在此步骤中，可能需要重新调整增益（gain）和快门（shutter）参数。重复操作，直至标记准确地位于LED上方（如同 图 4，右侧面板）。
  11. 打开观察室的灯光，调节增益和快门（在“相机控制”下），使图像不过度明亮。
  12. 图5 显示需依次通过鼠标右键选择的六个点。确保这些点位于指定的线上：1. 正视图中的水位线，2. 俯视图中容器左上边缘，3. 侧视图中勾勒前壁的垂直线。直线的长度并不重要。在点击第1与第2点、第3与第4点、第5与第6点之间时，将自动显示直线（屏幕上实际不会显示数字）。点击“采集容器信息”以保存该数据。
  13. 移除两侧的反光镜和LED面板，将水加至刻度线处。选择“开始录制”，新窗口将提示输入持续时间（分钟），当前目的下1分钟已足够，点击“确定”。
  14. 记录完成后，退出 记录模块，开放 轨迹模块选择校准文件夹（在步骤1.6中创建），使用“Data Location”进行加载（文件加载可能需要一些时间）。该文件夹包含校准文件以及刚刚记录的数据文件（步骤1.13）。
  15. 点击“采集背景”按钮。新窗口将打开，无需更改任何设置，直接点击“确定”。等待观察罐的（倒置的）图像出现在显示器上。然后点击“加载背景”，背景图像将被校正。随后会弹出一个要求调整框体的新窗口，直接点击“确定”即可。
  16. 依次按下第三至第七个按钮：“加载无水对应点”、“校准虚拟相机”、“加载折射对应点”、“采集容器几何形状”、“获取动物容器信息”。最后一步可能需要数分钟，当屏幕上出现三条白线（即步骤1.12中绘制的线条）时，表示该步骤完成。按下 "保存容器信息" 按钮
  17. 点击“收集体积”按钮。现在，如图所示 图6依次标记水体的8个角，该水体为一个长方体。每个点需先在前视图中单击，再在顶视图中单击。
  18. 在窗口左上角选择“3D”。此时将弹出一个新窗口，显示一个底部为白色的立方体轮廓（如 图15，但不显示轨迹）。右键单击鼠标以选择盒子视图的旋转和平移。如果未显示图像，或图像不是长方体的形状（即. 在步骤1.17中，若角点右键单击的顺序错误，则执行以下操作：离开但不关闭 轨迹模块，使用 Windows 系统时，进入校准文件夹（步骤 1.6 中创建），选择子文件夹“Animal container data”，删除名为 TankVertices 的文件，并重复步骤 1.17。
  19. 祝贺，校准已完成。理想情况下，应使用模拟鱼进行一次测试运行，以检查所有设备是否正常工作。好消息是，只有当反射镜或相机的位置发生（即使轻微）改变，或出现追踪问题时（参见第3节），才需要重新进行校准。

2. 记录

  1. 将装水至刻度线的观察容器放入观察室中，使容器的支脚插入用于准确定位的孔内。从摄像头视角观察，调整容器方向，使半透明壁（或本例中的白色壁——参见讨论部分）朝向远离摄像头的一侧及右侧。
  2. 打开隔间内的光源，将（实验用或模拟）鱼放入容器中，并关闭窗帘。注意：该系统可同时记录多条鱼（参见代表性结果部分）；但建议先通过记录单条鱼来积累对该系统的使用经验。
  3. 打开记录模块，屏幕上将显示容器的正面和顶部（镜像）视图。图像可能不够理想（例如，曝光过度，例如 图7），需进行调整（接下来的三个步骤），以获得鱼体与背景之间的良好对比度（例如 图8）。
  4. 选择“相机控制”，在弹出的“常规设置”窗口中，取消选中右侧对应的复选框（参见 图9），然后调节“快门”和“增益”参数，使图像不出现过曝，并确保鱼体与背景之间具有良好的对比度。
  5. 在“相机控制”窗口左侧选择“白平衡/颜色”，在新窗口中取消选中“自动”选项，并调节红色和蓝色数值（参见 图10），以在正面和顶部视图中均获得最佳的颜色对比度。
  6. 可能需要多次交替调整“白平衡/颜色”下的色彩设置与“常规设置”下的增益和快门参数，以获得最佳的相机配置。请注意，即使您认为无需调整也已满意，也必须取消选中“快门”、“增益”和“自动”选项（如步骤2.4和2.5所述），否则在录制过程中背景会发生波动，导致无法提取运动轨迹。请勿更改其他任何设置。完成后关闭“相机控制”窗口。
  7. 在记录模块的主菜单中选择“数据位置”，以创建或打开先前建立的文件夹。请注意，每次录制（例如 单条鱼或鱼群）都会生成独立的文件夹，理想情况下应为实验主文件夹的子文件夹。
  8. 点击“开始录制”，弹出窗口要求输入录制时长（单位为分钟，仅输入整数）。点击“确定”后，即开始实际录制。
  9. 若录制完成，请退出程序。在录制下一条鱼之前，建议重启计算机。使用Windows中的重启选项，以保留之前设置的相机参数（步骤2.4和2.5）。两次录制之间需要重启计算机，是由于相机卡存在某些技术问题。
  10. 在进入轨迹模块进行路径重建之前，需将校准文件夹（本方案第一部分创建）中的“动物容器数据”和“对应数据”两个子文件夹复制并粘贴至每个录制过程中生成的文件夹中。这些文件夹内还包含另外两个子文件夹：“原始数据”和“时间戳”。“原始数据”包含所有以JPEG格式存储的录制帧图像；“时间戳”则记录了总帧数及帧间间隔（单位为毫秒）。

3. 路径重建

  1. 打开 轨迹模块，按“数据位置”以选择使用创建的文件夹 记录模块 然后按下“System Setup”按钮以打开“Parameters”（参见 图11).
  2. 选择顶部和底部的视图颜色阈值。一个合适的起始值为 1,000。如果该值过低，软件更有可能记录噪声；但如果该值过高，鱼类可能低于检测范围。后续步骤（3.11 和 3.12）中可能需要重新调整颜色阈值。还需注意，顶部和底部的颜色阈值不必相同。
  3. 选择顶部和底部视图的大小阈值。对于中等体型的斑马鱼，合适的起始值为10；体型较大的可设为20，体型非常小的则设为5。大小阈值越高，越不容易捕获到噪声信号。然而，若阈值过高，软件也可能无法检测到鱼类。在步骤3.11和3.12中，可能需要重新调整大小阈值。还需注意，顶部和底部的大小阈值不必相同。
  4. “上尺寸阈值”通常设置为3,000较为合适，“特定长度”保持默认值220即可。“鱼的数量”指观察箱中鱼的数量。“最大点数”指总帧数。请记住（或记录下）此数值或略低一些的数值例如 45,703 可以记作 45,000。点击确定。
  5. 依次按下“加载无水校准数据”、“校准虚拟相机”和“加载动物容器信息”按钮。如果未将校准子文件夹“动物容器数据”和“对应数据”复制到当前实验文件夹中（见步骤2.10），系统将生成错误提示。若出现此情况，请立即复制并粘贴这两个子文件夹，然后重新点击上述按钮。
  6. 按下“采集背景”按钮。新窗口将提示输入“起始”和“终止”值，默认分别为0和100。将100更改为最大帧数（如步骤3.4中的示例，此处可简化为45,000）。点击“确定”。
  7. 等待（扭曲的）图像出现，然后点击“加载背景”，以生成正确的背景图像。在此背景图像中，鱼不应可见。如果鱼仍然可见，请尝试从其他录制片段中获取更合适的背景图像。例如 尝试 0-1,000、1,000-2,000 等等。 在步骤 3.6 中）。
  8. 如果在记录期间鱼完全未移动，则获取背景图像的唯一方法是将鱼移除，然后在不放置鱼的情况下，使用相同的“Camera Controls”设置（这一点很重要）进行一次新的短暂记录。获取背景图像后，将“Background data”子文件夹复制到当前实验文件夹中。然后点击“Load background”，不要点击“Acquire background”。请注意，打开和关闭遮光帘通常会导致背景发生一定程度的变化，因此可能需要调整步骤3.2和3.3中的阈值以减少噪声。步骤3.11展示了如何检查噪声。
  9. 加载背景后，使用鼠标调整三个红色方框，如图所示 图12。方框标示了软件用于检测鱼的区域。关闭左侧的方框（即 将其简化为一条线或一个点，因为侧视图仅用于校准（如步骤1.7所述）。
  10. 点击“开始生成轨迹”按钮。此时会弹出一个窗口，要求输入起始帧编号。使用默认值“0”即可。按下“确定”后，将打开“标签分配”窗口（参见 图13）。按下“逐步前进”，直到屏幕上出现标记（“X0”）。如果标记未放置在鱼的图像上，持续按下“否”，直至标记被正确放置。然后按下“开始”。如果标记始终未被正确分配（或完全未分配），仍请按下“开始”，并查找问题所在（下一步）。
  11. 路径重建开始。理想情况下，标记应始终（或至少大多数情况下）位于鱼的图像上。如果标记经常出现错误，请打开视频屏幕上方第二个选项“信息”窗口。 图14A 显示理想情况，仅可见鱼的轮廓。 图14B 显示了一个噪声过强的案例，这种噪声会妨碍正确的标签分配。如果你看到的是没有噪声的清晰鱼体图像（如 图14A），但如果标签从未或极少被正确分配，则最可能的原因是校准不准确。此时应重新校准并重新进行路径重建。在校准过程中，若未移动镜面和相机，则新的校准数据可用于此前已完成的记录。
  12. 若噪声过大（如 图14B)，在主菜单中点击“停止”，然后选择新的颜色和大小阈值（步骤 3.2 和 3.3）。同时检查红色框体（步骤 3.9）是否可略微缩小（例如以排除水面波动产生的噪声）。注意，有时程序会“卡住”（即完全无法分配标签）：此时应重新启动程序。
  13. 在屏幕上方的第三个选项中观察3D屏幕上的轨迹。 图15. 代表一条轨迹示例。通过鼠标右键点击，可在三维构型的旋转与平移之间进行选择。
  14. 当轨迹绘制完成后，依次点击“保存”按钮（而非“停止”，否则将删除轨迹！）、“轨迹清理”和“轨迹平滑”。此时将弹出一个新窗口，显示用于平滑处理的滤波参数图16）。在未积累更多系统使用经验前，请勿更改默认设置。点击“OK”。
  15. 此时应已明确，为何在录制前选择合适的相机设置（确保鱼与背景之间具有良好的对比度）如此重要（参见步骤 2.4–2.6）。继续进行下一步 数据处理.

4. 数据处理

  1. 首先，查看用于记录鱼类行为的文件夹（图17）。该文件夹包含从校准文件夹复制而来的“Animal container data”和“Correspondence data”子文件夹，记录过程中生成的“Time stamps”和“Raw data”子文件夹，以及路径重建过程中生成的“Background data”和“Trajectories”子文件夹。
  2. 图17还显示，“Trajectories”子文件夹中包含三个文件。其中 point.smoothed 文件将用于后续的数据处理。在多条鱼同时记录的情况下（例如群游实验），每条鱼都会生成一个独立的 point.smoothed 文件。
  3. 图18展示了一个示例 point.smoothed 文件的开头部分。第一行为样本总数或帧数，第二行为记录时长（以分钟为单位），第三行为相对于摄像机的水体中心坐标（顺序为：x, z, y）。其后每一行对应一帧，列出鱼在该帧的 x、y、z 坐标（单位为 mm）以及该样本的持续时间（单位为秒）。
  4. 处理 point.smoothed 文件中数据的方法有两种：使用数据处理模块，或使用其他软件（如 Excel 或 MATLAB ）进行数据处理模块中尚未（或暂未）集成的计算。
  5. 打开数据处理模块，在工具栏中选择“Project”，然后从下拉菜单中选择“New”，并填写实验名称。再次在工具栏中选择“Edit Project”，从下拉菜单中选择“Add to Project”，然后选择“New group”，并填写组名（例如“Controls”）。注意，目前项目名称和组名称尚未实际使用，但仍需填写。所创建的文件夹可用于存储输出文件（见步骤 4.10）。
  6. 在右侧窗口中选择一个组（例如“Controls”）（见图19），工具栏将发生变化。选择“Edit group”，然后从下拉菜单中选择“Add to group”，再选择“New measurements”，此时将打开文件浏览器。打开记录过程中生成的文件夹（步骤 2.7），选择“trajectories”子文件夹，然后选择 point.smoothed 文件。在图19所示的示例中，Group-A 加载了六个文件，Group-B 加载了四个文件。（注意：在该示例中，平滑处理后的文件扩展名为 0 和 1，因为该实验中同时测试了两条金鱼。）
  7. 进行分析时，在右侧窗口中选择 point.smoothed 文件，选择“Data Processing”，从下拉菜单中选择“Single Endpoints”，并以“Duration freezing”为例（图20）。此时将弹出一个窗口，用于设定冻结行为的速度阈值和持续时间阈值。在示例中，鱼在观察期间有 25.86% 的时间处于冻结状态。
  8. 为熟悉程序操作，可尝试其他示例，如移动距离（Travel distance）、深度分布（Depth Distribution，可用于确定深度层级数量）和爆发频率（Burst frequency）。
  9. 还可进行更高级的计算，例如加速度 z 分量的频谱分析。此时，选择“Time-series features”，然后依次选择“TD freq domain analysis”、“Spectral analysis”和“Z accele spectrum”，将对指定参数执行傅里叶分析（详见文献7）。菜单中显示的部分选项尚未完全实现，例如“Path tortuosity”仅为实验性添加功能。
  10. 当选择“Batch processing using default threshold”选项时，系统将计算约 200 个终点参数。此处“默认”指已设定分界参数。例如，当前深度分布按三个深度层级计算，角分布按四个区域（即象限）计算，等等。参数生成后，将弹出新窗口，提示输入保存文件的位置和名称。这些数据将以 CSV 格式保存，可导入 Excel 等其他软件进行进一步处理。
  11. 与记录模块和轨迹模块不同，数据处理模块是一个持续发展的模块，未来将根据研究人员的需求进一步优化和调整。

结果

从 Aquatica Tropicals, Inc. 购买了 120 条未指明品系（“短鳍”野生型）的 6 月龄雌性斑马鱼（Danio rerio）。实验前，斑马鱼在 38 L 的水族箱中适应实验室条件约 8 周。水温与室温相同（约 23°C）。光照周期为：14 小时光照（6:00–20:00），10 小时黑暗。斑马鱼每日喂食三次：8:00 喂食 Tetra 热带鱼薄片饲料；12:00 喂食活体丰年虾幼虫；15:00 喂食 Tetra 热带鱼薄片饲料。实验当天，仅在 8:00 喂食薄片饲料。第二次记录结束后，立即使用 300 mg/L 三卡因甲磺酸盐（MS-222）对斑马鱼实施安乐死。

对照组为14组四胞胎（即使用四条为一组的斑马鱼，对照组共14组（n=14），MK-801组共16组（n=16）。暴露1小时后 10 µM MK-801（从9:30开始）置于1 L容器中，随后将四胞胎转移至观察容器。立即开始记录（10:30）并持续20分钟。之后，斑马鱼在容器中继续放置3.5小时，在此期间通过连接空气泵的管子提供通气。在14:00进行第二次20分钟的记录。两次记录的目的是研究习惯化效应和/或药物作用的减弱情况（MK-801在大鼠体内的半衰期约为2小时）。28）。我们分析了（1）平均社会距离（也称为个体间距离）11,29) 作为社会凝聚力的衡量指标，(2) 在十个深度层次上的垂直分布，(3) 在四个径向区域上的水平分布（见 图24A， 区域位置插图）及象限分布（见 图24B，插图显示象限位置），以及（4）移动距离的三个分量（x、y、z）。数据以鱼群为单位取平均值。Shapiro-Wilk 检验显示并非所有变量均呈正态分布，因此对所有变量采用 Mann-Whitney U 检验比较对照组与 MK-801 组的均值。上述比较分别在上午和下午的实验阶段中独立进行。由于共使用了四组变量（见上文），显著性水平设定为 α = 0.05/4 = 0.0125。

图2A展示了对照组斑马鱼在上午时段记录的典型示例帧，图2B展示了经MK-801处理的斑马鱼的典型示例帧。可见，对照组斑马鱼靠近底部，贴近前壁（即 靠近摄像机的一侧），且彼此聚集紧密（即 社会聚集性较高）。相比之下，经MK-801处理的斑马鱼靠近水面，在水平面上未表现出明显的位置偏好，且彼此之间保持较远距离游动（即 社会聚集性较低）。图21展示了代表性运动轨迹。对照组斑马鱼明显倾向于停留在观察容器的前侧区域，并且大部分时间保持在底部附近。而经MK801处理的斑马鱼在水平面上的活动范围较广，无明显区域偏好。然而，在10:30时，它们明显偏好上层水深区域；到14:00时，其垂直分布趋于均匀。

数据的定量分析证实了我们的描述。图22A显示，在上午（10:30）时，MK-801处理组斑马鱼的平均社会距离（即四尾斑马鱼组成的四联体之间的个体间平均距离）超过对照组斑马鱼的三倍，U = 0，p<0.00001。经过3.5小时的适应后（14:00），对照组斑马鱼的社会距离增加，而MK-801处理组斑马鱼的社会距离则基本保持不变。然而，两组之间仍存在显著差异（U = 19，p<0.0005）。图22B展示了两个实验组在10:30和14:00两个时间点的社会距离随时间变化的曲线。

两个组别的垂直分布也存在显著差异。图23显示，无论是在上午（10:30）还是下午（14:00），对照组斑马鱼大部分时间都处于最下方的两到三个深度层级（即最接近观察容器底部的层级）。而MK-801处理的斑马鱼在10:30时大部分时间在水面附近游动（图23A）。经过3.5小时的适应后，在14:00时，它们在各个深度层级的分布大致均匀。

两个实验组在水平分布上也表现出显著差异。图24A显示，与对照组斑马鱼相比，MK-801处理的斑马鱼在边缘区域停留的时间更少，而在中间区域和中心区域停留的时间更多。各组在象限分布上的差异更为明显（图24B）。对照组斑马鱼对前两个象限（1和4）具有强烈的偏好性，即靠近摄像机一侧的容器区域；而MK-801处理的斑马鱼在四个象限中的分布则大致均匀。

就运动学参数而言，我们在此仅讨论移动距离（图25）。MK-801处理的斑马鱼比对照组斑马鱼移动得更远。有趣的是，这种差异在移动距离的y分量方向上尤为显著。该方向对应于摄像机的视角（见图1）。事实上，对照组斑马鱼大部分时间停留在靠近前壁的第1和第4象限（如图24A和图24B所示）。而MK-801处理的斑马鱼则在容器的前半部和后半部之间来回移动。

此处仅展示了分析实验所提供数据的若干可能方法。目前我们暂不对结果附加任何特定的生物学解释。然而值得指出的是，已有研究发现MK-801可诱导社交退缩30 并减少大鼠的社会探究行为31 并被作为精神分裂症阴性症状的模型进行研究30它还引起了活动过度31，环形运动行为32，感觉障碍33，以及prepulse抑制减弱34 在哺乳动物中。尽管我们并未专门针对这些损伤进行测试，但我们的研究结果似乎与之相符。需要更具体的实验设计来确定MK-801在斑马鱼中所描述的作用是否与哺乳动物中的表现具有可比性。进一步的分析和实验也将有必要以判断焦虑、呼吸问题、空间定向障碍、注意力缺陷、刻板行为 等等。 在斑马鱼中，对MK-801诱导的行为改变具有重要作用。

Optical measurement setup diagram with camera, computer, cube, and mirror; photonics study.
图1. 实验装置示意图。 相机捕获帧（即 显示观察水箱正面和顶部视角的静态图像。这些图像帧被存储在计算机中以供进一步处理。请注意xyz维度的位置，这对于描述斑马鱼运动和位置的三维特征至关重要。图中两个阴影侧壁（以及水箱底部）在本实验中（见代表性结果）被涂成白色，而另外两个侧壁为透明。 单击此处查看大图.

鱼类行为实验，两个鱼缸中的鱼分布情况，行为学研究装置示意图。
图 2. 示例图像帧。 请注意，单独的前视图或顶视图均存在信息丢失的问题。这一点在 B 图中尤为明显：从前视图看，左侧的三条斑马鱼似乎彼此非常接近，而顶视图则显示事实并非如此。另一方面，顶视图无法提供任何关于距底部距离的信息。A) 对照组斑马鱼。B) 经 10 µM MK-801 处理的斑马鱼。请注意，背景颜色（蓝色）由录制软件生成，选择该颜色是为了获得良好的对比度。实际背壁、右侧壁以及底部的颜色均为白色。点击此处查看高分辨率图像。

水生动物行为追踪系统；视频分析装置；校准板；监测过程。
图3. 侧镜的对齐。 左侧的白色箭头表示侧镜中的前壁（最靠近相机的一侧）。如果看到两条线，则需调整侧镜的位置，直到仅能看到一条线为止（步骤1.2）。校准板上的5个LED在三个视图中均清晰可见。请注意，由于实验腔室内的灯已打开，LED面板上出现了许多其他反射光点（步骤1.4）。点击此处查看高清图像。

粒子检测过程，红色标记框，光学分析示意图，低光照条件。
图 4. LED 的标记。 左侧图像显示，校准程序识别出的五个标记（编号为 0-4）与实际的 LED 位置不一致。除 LED 外，还可观察到其他光斑（实际上是反射光点）。右侧图像中，已降低增益和快门值，使得仅有 LED 可见。此时，五个标记已正确分配（如步骤 1.7–1.10 所述）。点击此处查看高分辨率图像。

显示摄像头控制和校准设置的水生动物行为追踪软件界面。
图5. 采集容器信息。 图中展示了需通过鼠标右键点击选择的六个点的顺序。线条将自动绘制。请注意，图中所示编号不会在屏幕上显示。完成后，按下“Collect container info”按钮（如步骤1.12所述）。点击此处查看大图。

流体动力学实验示意图；流体动力学与浮力水箱装置；带注释的组件。
图6. 采集体积。 在标记水体角落的指定位置右键单击鼠标：首先在前视图中标记角落，然后在顶视图中标记。接着移动到下一个角落（从1到8）。请注意，这八个点标记的是水体的轮廓，而不是水箱的轮廓。另外请注意，当右键单击鼠标时，仅显示“x0”，在点击下一个位置时该标记会消失（因此数字1-8实际上不会显示在屏幕上）。该操作步骤在1.17步中有详细说明。 点击此处查看高清图像。

水生动物行为追踪装置，包含摄像头控制，用于监测水箱中动物的运动。
图7. 未校正的对比度。图像曝光过度，鱼与背景之间的对比度较低（尤其是前视图）。点击此处查看高清图像。

用于静水平衡研究的水生装置及鱼类；流体动力学实验。

图8. 校正后的对比度。与图7相比，当前图像的对比度已得到改善。请注意，屏幕上显示的颜色为伪彩色。点击此处查看高分辨率图像。

Bumblebee2 BB2-03S2C 相机设置界面，显示亮度、曝光和饱和度调节。
图9. 常规设置。在主菜单中选择“相机控制”后，将打开“常规设置”窗口。取消选中“快门”和“增益”选项框，并使用滑块调节，以获得鱼类与背景之间最佳的对比度。点击此处查看大图。

相机白平衡调整图形用户界面；红/蓝滑块；图像处理优化。
图10. 颜色设置。在“白平衡/颜色”窗口中，取消选中“自动”选项，并使用“红色”和“蓝色”滑块找到鱼类与背景之间对比度最佳的组合。参数。打开Trajectory Module后，使用“数据位置”选择实验文件，然后通过“系统设置”打开“参数”窗口。此处为各参数分配了合适的初始值。点击此处查看大图。

水生动物行为追踪软件界面；校准参数；视频分析设置。
图11. 参数。 打开Trajectory Module后，使用“Data location”选择实验文件，然后通过“System Setup”打开“Parameters”窗口。此处为各参数设置了合适的初始值。 .点击此处查看大图.

水生行为追踪装置、3D系统校准、软件界面、轨迹分析。
图12. 盒区对齐。注意顶部视图和前视图中的红色框如何定义鱼类可能出现的区域。左侧的框被缩小为一条线，以排除该区域的搜索范围。 点击此处查看高清图像。

水生动物追踪软件界面，显示用于行为分析的校准与监测设置。

图13. 标签分配。按下“开始生成轨迹”按钮并选择起始帧（通常为第0帧）后，将弹出“标签分配”窗口。点击“向前一步”，直到标签（'X0'）出现在屏幕上。如果标签未正确位于鱼的图像上，请持续点击“否”，直至其正确放置。然后点击“确定”。点击此处查看大图。

显示力矢量、应力集中的动态分析示意图；组件标注为 A、B。
图 14. 信息界面。图（A）显示正确的标签分配。标签（'X0'）在两个视图中均被放置于鱼的图像上。通常有一条线穿过该标签。图（B）显示噪声过多且未进行标签分配的情况。这些帧来自同一段录像，通过在步骤 2.2 中将颜色和尺寸阈值分别从 1,000-50 和 10-5 进行调整而获得。点击此处查看高分辨率图像。

三维轨迹分析，矢量图显示粒子在笛卡尔坐标系中的运动。
图15. 重建路径的三维表示。为便于定位，箭头的起点位于水箱的左前角（另见图1）。因此，在本示例中，鱼保持在靠近左侧壁的位置（相对于相机而言）。点击此处查看大图。

轨迹平滑参数设置窗口；滤波器设置：噪声阈值、窗口大小。
图16. 轨迹平滑。 点击“轨迹平滑”按钮后将打开此窗口。目前请直接点击“OK”接受默认值。 点击此处查看大图。

文件组织示意图，显示数据从“fish1”文件夹传输到“Trajectories”子文件夹。
图17. 子文件夹。 上图显示了记录过程中生成的文件夹。路径重建后，该文件夹包含所示的六个子文件夹。点击此处查看大图。

用于统计分析的文本格式数值数据。
图 18. 平滑处理后的文件。 展示了一个 point.smoothed 文件的上部示例，其中包含帧数、记录时长（以分钟计）、水体中心相对于摄像机的坐标，以及每一帧的坐标和持续时间。点击此处查看高清图像。

用于分析轨迹数据的数据处理软件界面；项目设置和分组分配。
图19. 数据处理。选择待分析的文件（右侧窗口）。点击此处查看大图。

显示用于轨迹评估的冻结分析设置的 ABMT 3D 数据处理界面。
图 20. 示例分析。 可通过从菜单中选择感兴趣的时间终点来计算相关参数。在此示例中选择了“Duration Freezing”（冻结持续时间）。程序将提示输入定义冻结状态的速度和持续时间阈值。结果以记录总时长的百分比形式表示。点击此处查看大图。

运动分析示意图，显示对照组和MK-801处理组小鼠在不同时间间隔内的追踪路径。
图21. 代表性运动轨迹。 展示了对照组斑马鱼的两条代表性轨迹，以及经10 µM MK-801处理的斑马鱼的两条代表性轨迹，分别对应于上午10:30开始的实验阶段（上排）和下午14:00开始的实验阶段（下排）。每组四条鱼中每条斑马鱼的轨迹以不同颜色表示。但需注意，可能存在标签互换的情况。如果需要准确追踪个体轨迹，则必须进行人工校正。图中所示容器的左前方（插图箭头的起始位置）为靠近摄像机的一侧（参见图1中的鱼缸定位）。点击此处查看高分辨率图像。

社交距离分析；图表；对照组与MK-801效应比较；不同实验阶段结果对比；时间序列
图22. 鱼类之间的平均社交距离。A) 展示了对照组斑马鱼与经10 µM MK-801处理的斑马鱼在上午和下午实验阶段的平均社交距离。数据以均值±标准误（S.E.M.）表示。***，p<0.001。 B) 展示了两组个体间平均距离的时间进程。 点击此处查看高分辨率图像。

深度分析；多变量图；对照组与MK-801组比较；不同深度水平的时间百分比。
图23. 深度分布。A) 斑马鱼在上午时段于十个相等深度水平上的分布情况（其中第1层为最接近底部的层级）。B) 斑马鱼在下午时段的分布情况。数据以均值±标准误（S.E.M.）表示。*，p<0.0125；**，p<0.005；***，p<0.001。点击此处查看高清图像。

Radial zone and quadrant time proportion graph; data analysis; psychological experiment results.
图24. 水平分布。 (A) 实验组在四个径向区域的时间分布如图所示。插图显示了从中心到外围各区域的位置：中心区、中区、外区和联合角区。B) 实验组在四个象限中的时间分布情况如图所示。插图显示了各象限的位置。双线表示的墙为白色墙，单线表示的墙为透明墙。摄像头位于插图左侧。 即最接近第1和第4象限（另见 图1）。数据以均值和标准误（S.E.M.）表示。黑色星号表示上午时段各组间的比较，灰色星号表示下午时段各组间的比较：*，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001。<0.0125；**，p<0.005；***，p<0.001. 单击此处以查看大图.

静态平衡图；移动距离与坐标；对照组与MK-801组；数据分析。
图25. 移动距离。 显示了斑马鱼在上午和下午实验阶段移动距离的xyz分量。数据以均值±标准误（S.E.M.）表示。黑色星号表示上午阶段各组之间的比较，灰色星号表示下午阶段各组之间的比较：*，p<0.0125；***，p<0.001。 点击此处查看高清图像。

讨论

此处展示的实验流程可用于记录单条斑马鱼、成对斑马鱼（例如用于研究交配或攻击行为）以及斑马鱼群（如代表性示例所示）。该系统特别适用于同时获取有关三维（垂直和水平）分布、运动学特征（例如速度、加速度、转向角）和社会参数（例如社会凝聚力）的信息。以下列出在规划实验时需考虑的一些重要事项。

根据实验方案的不同，可以研究不同的行为系统。例如，为了探究新奇恐惧（即对新环境的恐惧），应在将斑马鱼放入观察水箱后立即开始记录（仅等待数秒，待水体稳定以减少干扰），无需预先适应11,17,37。另一方面，某些研究主题可能需要斑马鱼充分适应环境，例如在研究警戒信息素效应时16。在研究斑马鱼群体时，实验者应意识到，尽管软件可最大程度减少标签切换，但目前尚无法在整个实验过程中持续追踪个体斑马鱼。在侧重于社会聚集性的群聚行为研究中，这一点并不重要，但在研究攻击性或交配行为时则至关重要。手动重新分配标签是一种可行方案，但可能非常耗时。

观察容器和观察室壁的颜色可能对斑马鱼的行为产生显著影响。例如，已有研究描述白色墙壁会引发斑马鱼的厌恶反应。36, 37尝试不同颜色时，需牢记两点：1）前壁（即. 靠近摄像机一侧的壁面需保持透明，且若使用盖子，盖子也必须是透明的；2）选择从未使用过的颜色时，应首先确定斑马鱼与背景之间的对比度是否适合录制。需进行一次测试运行。调整录制时的摄像机设置（增益、快门、红色和蓝色，具体见步骤2.5和2.6）以及轨迹重建的设置（例如颜色和大小阈值（如步骤 3.3、3.5、3.11 和 3.12 中所述）可能产生显著影响。同样，对系统的使用经验将在判断可行性方面起到重要作用。

根据实验目的，可能需要具有不同特性（例如：光谱、强度）的光源。LED灯条可轻松更换。确保光线能够照射到容器的每个部分。

如果实验要求斑马鱼在观察容器中停留数小时，需确保提供通气。可使用夹子将通气管固定在容器右后角。通过计算机屏幕检查夹子是否干扰图像采集。 即确保斑马鱼在任何时候均不被遮挡。在 图2A 和 2B 从顶部视图可以观察到黑色夹子。理想情况下，应在记录前或记录间歇期间提供通气，但记录过程中不应通气，以避免产生噪声。还需注意，开启或关闭强通气可能会惊扰斑马鱼。

如果实验需要将斑马鱼在容器中过夜，建议用透明盖子覆盖观察室，以防止斑马鱼跳出（这是非常常见的现象）。如果在开始记录前不取下盖子（以避免干扰斑马鱼），需考虑以下两点：1）确保光源的镜像反射不会干扰记录；例如 通过调整光源位置或选择几乎不反射光线的盖子；2）需考虑盖子在过夜使用时可能起雾，尤其是在需要同时提供通气的情况下；减少此现象的一种方法是选择带有小孔的盖子。

对于某些实验，可能需要在给予斑马鱼药物之前确定其基础行为。在这种情况下，可以通过管道（类似于上文所述的通气管）在实验阶段之间加入药物。

尽管本文主要关注斑马鱼（Danio rerio）的记录，但该系统当然也可用于记录其他鱼类物种。该系统已被用于研究（幼年）金鱼（Carassius auratus）、虎皮鱼（Barbus tetrazona）和绿剑尾鱼（Xiphophorus helleri）的行为。

最后需要指出的是，观察箱的其他尺寸原则上也是可行的。然而，若使用更大的观察容器，则需要对系统进行重新配置，并在空间分辨率和时间分辨率之间找到良好的平衡。此外，容器的形状必须为长方体。斑马鱼或其他实验对象的数量在理论上没有限制；但随着实验对象数量的增加，标签互换现象会增多。

披露

Hans Maaswinkel、Liqun Zhu 和 Wei Weng 是位于美国纽约州罗纳孔科马的 xyZfish 公司员工，该公司生产了本文所使用的追踪系统。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AABT-3D 跟踪硬件xyZfishAABT II包含摄像头、视频采集卡、带反光镜和照明装置的观察室
AABT-3D 校准设备xyZfishcalib包含校准板和侧反光镜
AABT-3D 观察容器xyZfishcubes 
AABT-3D 跟踪软件xyZfishv.1.0 
计算机可选不适用Windows XP 或更高版本
(+)-MK-801 氢马来酸盐SigmaM107 
气泵Fusion500 
气管管路 3/16”Lee’s Aquarium and Pet Products14508 
中型文件夹夹子OfficeDepot561339用于将气管固定在观察容器上

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