使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

摘要

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。

摘要

利用重组噬菌体作为支架，展示由定向克隆的cDNA文库编码的各种蛋白质片段，并将其与固定的诱饵分子进行孵育，是发现分子相互作用的有效方法。该技术迄今主要用于发现蛋白质-蛋白质相互作用，但所使用的诱饵分子并不局限于蛋白质。本文所述方案已优化，可对适量的诱饵分子进行重复筛选，以最大限度地识别出展示相同蛋白的独立克隆，从而提高所鉴定出的相互作用蛋白确实是诱饵分子真实互作伙伴的可信度。在每轮亲和筛选后监测噬菌体滴度，有助于了解亲和筛选的进展状况以及阴性对照的有效性。本文介绍了测定噬菌体滴度的一种方法，并说明了为使该过程尽可能高效而需预先准备的材料和步骤。同时强调了在分离独立噬菌斑后获得扩增产物的特征，可用于评估亲和筛选的进行效果。文中还解释了减少假阳性结果或绕过持续回收噬菌体的故障排除技术，并讨论了降低病毒污染爆发的策略。

引言

为何要使用噬菌体展示和亲和筛选，而不是众多其他可用于发现和研究蛋白质与其他分子相互作用的技术？与其他检测蛋白质-配体相互作用的方法相比，噬菌体展示具有一些独特优势^1-3，包括以下几点：

诱饵分子的种类非常广泛

最主要的原因在于能够作为亲和筛选诱饵的分子具有高度多样性 ⁴。噬菌体展示是一种非常强大的技术，可用于分离能够与其它蛋白质、核苷酸、碳水化合物等等⁵ 相互作用的蛋白质片段。本质上，只要一种聚合物或分子能够被固定在可回收的载体上，就可以利用它来筛选与噬菌体展示蛋白具有亲和力的分子。此外，还可以对诱饵分子进行检测，以确定其在固定化后是否仍保留生物学活性⁶，验证用于降低或消除其活性的条件是否有效⁶，或者在亲和筛选前对诱饵分子引入翻译后修饰。

噬菌体对非特异性因素的抗性

使用噬菌体展示的第二个原因是，某些诱饵可能需要环境胁迫条件（如热、高渗透溶质浓度、特定辅因子， 等等.) 以捕获其相互作用的蛋白质，或者在进行亲和筛选之前可能需要对噬菌体展示的蛋白质进行某种修饰。研究的主要因素是诱饵蛋白与目标蛋白之间的相互作用，而非促成该相互作用发生的条件，或该相互作用是否对测试生物体具有致死性。T7噬菌体特别适用于此类研究，因为它在严苛的实验条件下仍能保持完整性和活性。例如 T7 存活性的已发表耐热上限约为 60 °C ⁷）。作为改变噬菌体展示蛋白的一个示例，在研究时 拟南芥 用于研究修复酶蛋白异天冬氨酸甲基转移酶（PIMT）底物蛋白的种子蛋白质组，本研究所用病毒为 "老年" 在每轮亲和筛选前，将样品置于上述条件下一周，以促进易感蛋白质中异天冬氨酸（isoAsp）残基的形成⁶ 这在能够识别并修复/代谢此类异常的生物体中是不可能的。

代谢惰性

此外，噬菌体通常对代谢抑制剂和干扰性小分子具有抗性，这些物质至少会对代谢活跃的测试生物体产生多效性影响。在经过严格洗涤步骤后，先去除抑制剂，再引入大量细菌进行感染，从而使抑制剂被稀释至对细菌或后续噬菌体复制无害的浓度。在研究PIMT修复酶的蛋白质靶标时，使用S-腺苷甲硫氨酸（AdoMet）激活微孔板包被的酶，以促进靶蛋白的捕获，同时利用S-腺苷高半胱氨酸（AdoHcy）使酶失活，提供有效的阴性对照；可以确信的是，噬菌体不会受到AdoMet或AdoHcy的不利影响。⁶此外，某些晚期胚胎发生丰富蛋白 本实验室研究的（LEA）蛋白家族已知在蔗糖等添加剂存在下会改变其构象⁸，可在大豆种子生理成熟时达到高达200 mM的浓度⁹该病毒预计不会受到每轮亲和筛选中添加200 mM蔗糖的影响，尽管蔗糖可能对某些LEA-客户蛋白相互作用是必要的，但这种情况不适用于自主存活的测试生物体¹⁰.

本实验室致力于研究成熟、脱水或萌发种子中蛋白质-蛋白质相互作用，这些相互作用是种子脱水过程中储存蛋白质组保护机制的基础¹¹，或在种子吸水后修复易发生异天冬氨酸（isoAsp）修饰的储存蛋白质组组分的基础⁶。因此，制备并纯化作为诱饵所需的、具有活性的重组蛋白，并确保其在固定前后均保持活性，尽管常常具有挑战性，却是我们工作的基石。然而，由于每种重组蛋白的表达条件各不相同，本文不涉及重组蛋白表达条件的优化。建议使用者尽可能尝试确定固定后的蛋白质是否仍具功能活性（例如，若为酶类，可在微量滴定板孔中进行酶活性检测）。这将有助于确认诱饵蛋白具有生物学活性，从而提高所发现的相互作用具有生物学相关性的可能性。

方案

下文所述实验流程的示意图（图1）突出了利用噬菌体展示文库进行亲和筛选的两个主要组分：A）一个噬菌体展示cDNA文库，可能编码对诱饵具有亲和力的蛋白质；B）一种纯化的重组诱饵蛋白。诱饵（重组蛋白）的制备已有广泛研究，文献中详细阐述了从大肠杆菌（E. coli^12-13）、真核酵母¹⁴、昆虫^15-16、植物^17-18或哺乳动物^19-20细胞中获得可溶性、有活性的重组蛋白的最佳实践方法。

在以下实验方案中，使用了带有六组氨酸标签的重组蛋白作为诱饵。这可以验证诱饵蛋白在过夜孵育及洗涤步骤后仍保留在孔板中。

1. 微孔板孔中重组蛋白保留的酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 使用永久性墨水标记微孔板，并标明各孔所含的蛋白质浓度。每种浓度设置3个重复孔。同时设置3个阴性对照浓度系列（非六组氨酸标签蛋白；牛血清白蛋白BSA适合作为背景对照）。
2. 用大量水彻底清洗微孔板，每次清洗后将板倒置在4层纸巾上拍打以去除水分。
3. 在前3个孔中加入100 μl Tris缓冲液（pH 7.5，或所选缓冲液），其中含有最高浓度的重组蛋白（10 μg/ml）。在接下来的3个孔中依次加入重组蛋白，浓度分别为（1.0 μg/ml），依此类推，直至1.0 ng/ml。对BSA浓度系列进行相同操作。
4. 用塑料封膜覆盖微孔板，于4 °C孵育过夜。
5. 次日早晨，将微孔板倒置在4–5层纸巾上拍打，以去除孔内蛋白溶液。
6. 每次用200 μl 1x TBS洗涤各孔，共洗涤5次，每次停留约1分钟，并在每次洗涤后将板倒置在纸巾上拍打以去除洗涤液。
7. 在旋转摇床上，用200 μl 5% (w/v) BSA或200 μl 5% (w/v) 封闭试剂溶于TBS中，室温封闭2小时（或用塑料封膜包裹后于4 °C静置过夜，若操作方便）。
8. 通过将板倒置在纸巾上拍打去除多余的封闭液。用200 μl 1x TBS洗涤4次，每次1分钟，每次洗涤后均将板倒置在纸巾上拍打去除洗涤液。
9. 将五组氨酸（penta-HIS）一抗用封闭缓冲液按1:2,000稀释，每孔加入100 μl。室温静置孵育1–2小时。
10. 将板倒置在纸巾上拍打以去除一抗。用200 μl 1x TBST洗涤4次，每次1分钟，每次洗涤后均将板倒置在纸巾上拍打去除洗涤液。
11. 将二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG）用封闭缓冲液稀释后，每孔加入100 μl，室温静置孵育1小时。
12. 将板倒置在纸巾上拍打以去除二抗。用200 μl 1x TBST洗涤4次，每次1分钟，每次洗涤后均将板倒置在纸巾上拍打去除洗涤液。
13. 每孔加入200 μl 对-硝基苯磷酸酯（pNPP）底物溶液。该底物在-20 °C下为固体，因此需预先分装并从冰箱中取出足够数量的分装样品，确保在此步骤前已完全解冻。
14. 反应30分钟后，每孔加入50 μl 3 M NaOH终止反应。
15. 立即在酶标仪上读取405 nm处的吸光度。

注意：如果目标重组蛋白无法结合到孔壁上，可大幅调整缓冲液的组成或pH值（如使用pH 10.0的碳酸盐缓冲液），或添加变性剂（如尿素），以促进蛋白与微孔板孔壁的结合。然而，建议重新确认该重组蛋白：1）在亲和筛选条件下仍能保持与微孔板孔壁的结合；以及2）在去除高pH或变性剂后仍保留其生物学活性。

2. 培养用于滴定的细菌宿主（BLT5403）

1. 高压灭菌（图 2A）十个 250 ml 锥形瓶和 3 根培养管。配制 LB 液体培养基和 LB 琼脂培养基用于倾注固体培养板。将 LB 琼脂冷却至 50 °C，然后在生物安全柜中无菌操作加入氨苄青霉素至终浓度为 100 μg/ml，并立即倒入培养皿中（图 2B）。
2. 同样在生物安全柜中（图 2B），用保存于 -80 °C、含 15%（v/v）甘油的菌种中接种 BLT5403 菌株，划线接种至 LB、100 μg/ml 氨苄青霉素（LB^AMP100）琼脂平板以获得单菌落（图 2C）。将平板倒置，于 37 °C 培养箱中过夜培养（图 2D）。
3. 次日早晨，挑取平板上的单菌落接种至装有 50 ml LB^AMP100 的 250 ml 锥形瓶中。在 37 °C、200 rpm 条件下置于水平摇床中培养（图 2E 和  2F），并使用分光光度计监测细胞密度，当 OD₆₀₀ 达到 0.5 至 0.6 时停止（图 2H）。
4. 将菌液倒入 50 ml Falcon 管或其他类似容器中，置于 4 °C 保存备用（图 2G）。细胞通常可在该条件下保持活性约 1 周。
5. 配制 500 ml LB 培养基，倒入带挡板的 Fernbach 瓶中并进行高压灭菌。待其灭菌完成后，将培养瓶置于 4 °C（图 2G）或室温下保存，直至下方“"第一天"”当晚使用。

注意： 宿主细菌细胞 BLT5403 表达一种质粒来源的 T7 天然衣壳蛋白，该蛋白是 T7 中拷贝数和低拷贝数载体成功复制所必需的，因此该细胞对病毒极为敏感。必须避免污染。一旦发生污染，所有接触过病毒或感染细菌的表面均需用 70%（v/v）乙醇擦拭，或使用洗涤剂刷洗（图 2I）。若此方法无效，则需对所有能够耐受 Envirocide 的表面进行彻底去污处理（图 2J）。每次新的亲和筛选实验均应从冻存菌种开始培养 BLT5403 细胞，以减少 4 °C 保存菌种被污染的风险，并确保实验中使用的细胞处于旺盛生长状态。必须使用带滤膜的移液器吸头。

3. 亲和筛选

第一天

1. 用永久性墨水标记微孔板，并标注各孔所含的蛋白质/添加剂。（由于污染问题，微孔板从不重复使用）。每种蛋白质和处理条件均设三个复孔。
2. 用清水彻底洗涤平板，并在每次洗涤之间将平板倒置轻拍在四层纸巾上以去除水分。在9个孔中加入100 μl Tris缓冲液（pH 7.5，或所选缓冲液），其中6个孔加入重组蛋白（10 μg/ml），3个孔加入牛血清白蛋白（BSA，10 μg/ml），用于第一轮亲和筛选。用塑料封口膜覆盖培养板，于4 °C孵育过夜。图2G).
3. 确保准备9个250 ml锥形瓶（见上述2.1），已清洗、灭菌并正确标记（使用彩色胶带编码效果较好） 图 2F).
4. 根据所用文库的滴度和待筛选噬菌体的数量，计算每个孔所需的噬菌体裂解液体积。
5. 确保明天用于此轮亲和筛选滴定的新鲜BLT5403细胞已准备就绪（图3A).
6. 确保有足够的1x TBS（150 mM NaCl，50 mM Tris碱，pH 7.6）和1x TTBS（1x TBS + 0.05% (v/v) Tween 20），以对所用孔板孔数进行10次、每次200 μl的洗涤。此外，将TTBS预温至亲和筛选温度。确保在亲和筛选温度下，另备有一管密封的50 ml Falcon管，内含足量的1x TTBS作为备用。
7. 准备3种处理 × 3次重复 × 3个重复样本，共27个1.5 ml离心管，每管加入990 μl LB培养基^{100 安培} 每个并适当标记（例如 10^-2）。这些用于明天从微量滴定板孔中回收的感染细菌。在试管的一侧标记稀释倍数（10^-2）以及另一侧的升序编号（"1"）。为每个Eppendorf管，同时标记一个硼硅酸盐管和一个LB^{100 安培} 平板。通过这种方式，将平板和硼硅酸盐试管编号为1、2、3、4、5， 等等以加快滴定速度。之后，该简单编号可与Eppendorf管上的稀释倍数和处理条件相对应例如 12号管是BSA对照在稀释度10下第一次重复实验的第三个复管^-5）。将Eppendorf管和LB储存^{100 安培} 4 °C 过夜孵育平板（图示 2G 和 3B).

例如：为BSA复制孔中的噬菌体进行三个10^-2梯度稀释，准备1.5 ml Eppendorf管，并标记为1、2和3（对应复制一的噬菌体滴度三个重复读数），然后标记硼硅酸盐试管1、2和3，用于将感染的细菌与未感染的细菌及顶层琼脂混合，随后倒入LB^{100 AMP}琼脂平板中（图3C）。

8. 进行系列稀释时，标记离心管，并向每管中加入 900 μl 的 LB^{100 AMP}。待每个蛋白/处理组、重复组及三个平行样的初始稀释液（10^-2）制备完成后，第二天将各管充分混匀，从中取出 100 μl 加入含有 900 μl LB^{100 AMP} 的相应离心管中，以制备 10^-3 稀释液（例如，第一组 BSA 对照的 4、5、6 号管）。随后将这些管充分混匀，再用 10^-3 稀释液制备 10^-4 稀释液（7、8、9 号管），接着用 10^-4 稀释液制备 10^-5 稀释液（10、11、12 号管），依此类推，以获得三个 BSA 重复（孔）中第一个重复的滴度。
9. 对 BSA 第二重复（第 2 孔）、BSA 第三重复（第 3 孔）、毒饵的三个重复以及诱饵孔的三个重复，均进行相同操作。最终应得到编号从 1 到 135 的离心管（135 号为诱饵最大稀释度 10^-6 的最后一个重复的第三个平行样）。将这些离心管于 4 °C 过夜保存（图 3C 展示了 BSA 三个重复（三个孔）各平行样所有稀释度所用的离心管 和硼硅酸盐玻璃管 ）。
10. 接种 2 至 3 管 BLT5403 细胞培养物（从新划线培养过夜的 LB^AMP100 平板上的单菌落中挑取，见上述步骤 2.2），置于摇床培养箱中培养过夜（图 2E 和 图 2F）。向 500 ml LB 培养基（见上述第 2.5 点）中加入氨苄青霉素至终浓度 100 μg/ml，并将三角烧瓶固定在摇床培养箱的夹具中，使其在次日早晨保持 37 °C 并通气（图 2F）。

注意：第三轮和第四轮可能需要将噬菌体以大约 10^-10 的体积比稀释至 LB^AMP100 中。

第二天

11. 次日早晨，将已高压灭菌的空9 × 250 ml 锥形瓶（每个微孔板孔对应一个）放入恒温摇床的夹具中。取昨晚接种的BLT5403细胞过夜培养物之一，从中吸取500 μl加入500 ml LB^{100 AMP}培养基中，重新密封后开始培养（37 °C，220 rpm）。打开分光光度计（图2H），设置为测定600 nm处的吸光度。
12. 将微孔板从4 °C取出，移除塑料封膜，每次用200 μl 1× TBS（pH 7.5）洗涤10次以去除未结合的蛋白，每次洗涤后将微孔板倒扣在纸巾上轻拍。加入200 μl 5%（w/v）BSA或200 μl 5%（w/v）封闭试剂溶于TBS中，于室温封闭1小时（或过夜，若方便），并将微孔板用保鲜膜包裹。
13. 用1× TBST洗涤10次以去除封闭液，每次200 μl，每次洗涤后将微孔板倒扣在四层纸巾上轻拍。此时可向各孔中重新加入200 μl水，用保鲜膜覆盖后置于4 °C保存，最多可保存1周。

注意： 确保培养时间足够早，使得当完成亲和筛选的噬菌体感染BLT5403准备加入时，500 ml培养液中的细胞OD值处于0.6至1.0之间。₆₀₀若细胞生长超过1.0过多，由于接近稳定期时资源受限，可能无法发生裂解。若细胞未达到OD₆₀₀ 在加入噬菌体之前，若细胞密度尚未接近 OD 0.6，则感染复数可能过高，导致细胞迅速死亡，从而影响裂解液的代表性。如果细胞尚未达到接近 OD₆₀₀ 在亲和筛选完成时，当OD600达到0.6时，从第二个（或甚至第二和第三个）试管中接种更多BLT5403至烧瓶中，并在37 °C下振荡培养图2F）。如果 OD₆₀₀ 若OD值达到1.0且上升过快，关闭加热器和摇床，并打开盖子以冷却培养物，使细菌处于缺氧状态。在加入噬菌体后，重新开始加热和摇动。

从此步骤开始使用滤芯吸头，以避免噬菌体交叉污染。

14. 接种后，将噬菌体文库（100 μl）加入蛋白质中，用塑料封口膜重新密封培养板，并在室温下孵育1小时。
15. 在55分钟时，记录OD值₆₀₀ 细胞的倍增时间大约为每20分钟一代。请据此采取相应操作（参见 "注意" 如上所述。
16. 一小时结束后，从平板上去除塑料封膜，并立即通过振荡将噬菌体移入转化废液中，随后迅速加入 200 μl 的 1x TBST。（使用带有 1 = 100 μl 头的多通道移液器，并将移液器设置为 2 [即 每次按压活塞可释放200 μl）操作需迅速。设置计时器计时1分钟。1分钟后，将缓冲液振荡倒入转化废液容器中，将平板倒扣在纸巾上轻拍数下，再放回实验台（25 °C平板）。重复洗涤步骤10次。
17. 10 分钟后^th 洗涤后，从4 °C保存的50 ml Falcon管中吸取200 μl BLT5403细胞，加入到已去除最后一次TTBS洗涤液的孔底部。用塑料膜包裹酶标板，置于37 °C孵育20分钟，使仍与诱饵结合的噬菌体感染细菌（参见讨论部分关于持续回收的噬菌体和/或非特异性结合噬菌体导致高背景的说明）。
18. 20 分钟结束时，打开培养板，从 25 °C 条件下 BSA 的第一个重复孔中取出 10 μl 细菌，加入到 990 μl LB 培养基中^{100 安培} 显著的 "1"对该孔再重复两次（试管2和3），得到该孔噬菌体1/100稀释液的3个平行样本。这是BSA第一次重复的三个取样。这些稀释液将用于估算该次BSA重复的平均滴度±标准误（SEM）。
19. 对BSA的第2组和第3组重复实验（每组三个重复样本，每个样本10 μl），以及对毒饵蛋白的三个重复孔和诱饵蛋白，进行相同操作。将这27个Eppendorf管置于一旁，收集各孔中正在趋于裂解的感染细菌剩余的170 μl。
20. 如果烧瓶中的细菌处于 OD₆₀₀ = 0.6–1.0，将Fernbach烧瓶中的50 ml菌液分别倒入9个250 ml的锥形瓶中。取BSA复制1孔中剩余的170 μl噬菌体感染的BLT5403细菌，加入标记为50 ml细胞的锥形瓶中 "BSA 重复 1" （黄色胶带）。对全部九个孔均进行此操作，然后将其放入摇床培养箱中（图 2F).
21. 在接种后约3小时，不时在37 °C摇床培养箱中观察细胞裂解情况。从最初的27个稀释液中进行后续稀释（10^-2在此期间，将样品放入相应并已标记的Eppendorf管中。
22. 从3.12步骤中最初的27个稀释液开始，取100 μl含有细菌的LB培养基，来自Eppendorf管1（BSA重复一，该孔中此1/100稀释度三个重复样本中的第一个），加入至Eppendorf管4中含900 μl LB培养基的溶液中（1 x 10⁻¹）^-4 BSA 重复稀释一，该孔三个重复样本中的第一个。
23. 将Eppendorf管4中的含菌LB培养基取100 μl加入Eppendorf管7的900 μl LB培养基之前，应弃去滤芯吸头，更换新的滤芯吸头（1 × 10）^-5 BSA稀释液的第一个重复样本（该孔三个重复样本中的第一个）。继续进行稀释（直至1 × 10）^-6所有蛋白质和处理组的全部重复样本（共135个试管）。
24. 细胞裂解后，加入5毫升5 M NaCl贮存液，使培养物中NaCl浓度达到0.5 M，然后转移至已标记的离心瓶中。
25. 在 4 °C 条件下以 8,000 x g 离心 10 分钟。将上清液（病毒）倾入干净无菌的 50 ml Falcon 管中。
26. 向 Falcon 管中的上清液中加入几滴氯仿。
27. 4 °C 保存，用于下一轮亲和筛选。

4. 第三天

1. 将用于本轮亲和筛选的所有实验器材进行高压灭菌或漂白处理，以备下一轮使用。

5. 滴定

1. 根据稀释梯度的数量，按升序标记相应数量的固体LB^{100 AMP}平板（现在应为每个硼硅酸盐试管和每个Eppendorf管各对应一个平板，且编号相同）。将平板放入37 °C培养箱中（图3D）。
2. 融化顶层琼脂糖（1.0 g Bacto胰蛋白胨，0.5 g酵母提取物，0.5 g NaCl，0.6 g琼脂糖，加水至100 ml，高压灭菌），先将顶层琼脂糖瓶盖松开，然后交替使用微波炉加热瓶子并轻轻旋转混匀，直至琼脂糖完全融化。将瓶子放入水浴中冷却至50 °C（图3E）。
3. 取一支带有移液泵的10 ml硼硅酸盐移液管。点燃本生灯。将泡沫聚苯乙烯Falcon管架或冷藏箱盖倒置放在实验台上，并将刚从37 °C培养箱中取出的LB100 AMP平板1至6号依次放置其上，1号平板置于最上方（图4A）。泡沫材料可帮助保持平板温度。
4. 从4 °C取出BLT5403细胞，向上述第一天准备好的编号硼硅酸盐试管（第3.7节及图4B和图4C）中每管加入250 μl。将编号的硼硅酸盐试管按与1.5 ml Eppendorf管中稀释液相同的升序排列（图4A）。
5. 从1号Eppendorf管中的稀释液取100 μl加入1号硼硅酸盐试管的250 μl细胞中（图4D和 图4E）。将移液管前端约5英寸在火焰上轻微加热（不可过度！约3次快速通过火焰，图4F），随即插入熔化的顶层琼脂糖中，吸取3 ml并迅速加入试管中细胞/噬菌体的上方（图4G）。
6. 用手指轻弹试管混匀（另一只手握住试管，图4H），然后将内容物倒入平板中（图4I）。倾斜平板，用试管推动以驱除气泡和未覆盖区域，直至整个平板表面被顶层琼脂糖均匀覆盖。将其直立放置于实验台上冷却凝固。
7. 丢弃使用过的硼硅酸盐试管，弹出滤芯吸头，更换新的吸头，继续操作直至所有稀释液均完成涂布。当平板用完时，从培养箱中陆续取出新的LB^{100 AMP}平板，但每次不超过6个，否则平板冷却过快，导致顶层琼脂糖过早凝固。
8. 待顶层琼脂糖完全凝固后，将平板倒置（此步骤 至关重要）。否则，琼脂/琼脂糖会"渗出"，冷凝水会积聚在皿盖上并滴落至顶层琼脂糖表面，造成液体流动，带动噬菌体扩散，从而无法准确测定滴度。倒置后可选择：1）将平板放入37 °C培养箱[由于T7噬菌体生长迅速，4小时后需返回计数滴度]；或2）将平板倒置放置于实验台上，次日早晨即可进行滴度计数。
9. 采取一切必要防护措施以防玻璃瓶破裂或造成伤害，将顶层琼脂糖瓶盖重新盖上，但必须松松地盖紧，然后用微波炉加热至沸腾，重复两次。待其冷却后，拧紧瓶盖并存放。将水浴温度调回常规设定或关闭。将稀释液放入4 °C冰箱保存，后续可能需要用于分析滴度结果或重复部分滴定实验。

6. 确定与计算滴度

1. 观察平板上形成的噬菌斑，弃去出现完全裂解的平板（图5A，例如 10^-2 稀释度）。确定其余连续稀释样品中哪些稀释度产生的噬菌斑数量足够少，以便进行准确计数（图5A和 5B）。记录这些平板上的噬菌斑数量（表1；图5B）。
2. 将噬菌斑数量乘以稀释倍数，再将结果乘以100，得到每毫升感染细菌样品中的噬菌斑形成单位数（即 每个三复孔仅取10 μl感染细菌样品，因此需乘以100以换算为每毫升的数值）。计算来自该孔的三个复孔样品每毫升噬菌斑形成单位（PFU）的平均值（PFU/ml，指从微孔板孔中取出的未稀释感染细菌样品）。
3. 对三个重复孔的计数结果计算总平均值，并求出该均值的标准误差（表1）。该结果将用于记录每轮亲和筛选及处理条件下噬菌体滴度增加的图示数据（图5C）。

7. 空斑分离、PCR 及测序

1. 在第四轮亲和筛选结束时，挑选18个独立且形态清晰的噬菌斑克隆，并使用无菌巴斯德吸管、牙签、黄色移液器吸头或类似工具，从滴定平板上挑取这些噬菌斑。如果使用移液管或吸头，应先用Eppendorf管中的Tris-HCl（pH 8.5）润湿其内壁（图5D）。
2. 若使用移液管，请确保硼硅酸盐玻璃吸头内无多余Tris液滴，按压吸球并保持压缩状态，将硼硅酸盐吸头穿过一个孤立良好的噬菌斑，直至触及下方的塑料培养皿底部（图5E）。在吸头仍处于琼脂/顶层琼脂中的情况下释放吸球，吸取噬菌斑核心部分（图5F，见箭头）。
3. 将吸取的噬菌斑核心部分排入含有100 μl Tris-HCl（pH 8.5）的相应离心管中（图5G），短暂涡旋混匀。
4. 取20 μl该溶液，在65 °C下加热10分钟。
5. 将加热后的样品在室温下以13,000 × g离心10分钟。从上清液中取3 μl作为模板，用于T7-UP和T7-DOWN引物的PCR反应。
6. 针对这18个分离的噬菌斑所获得的加热处理溶液，分别建立50 μl的PCR反应体系，退火温度设为58 °C，进行35个循环。
7. 取每种PCR反应产物20 μl，在含有0.015%（v/v）溴化乙锭的1%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳。使用透射紫外灯观察凝胶，并佩戴适当的护目镜和丁腈手套（注意：溴化乙锭为强效诱变剂）。拍摄凝胶图像，并妥善处理被污染的材料（图6A和6B）。
8. 若扩增产物为单一片段而非空载体（空载体产物在1%（w/v）TAE琼脂糖凝胶上迁移至约100 bp处；图6A和6B中的箭头），则将剩余30 μl产物纯化后作为测序模板。若凝胶显示非单一产物（图6B，噬菌斑15），则从凝胶中切下最明显的条带，使用试剂盒提取DNA。
9. 对非空载体的扩增产物，使用T7-UP引物进行测序。
10. 检查每个序列中的接头臂，并据此确定插入片段的起始位置。利用基本局部比对搜索工具（BLAST；美国国家医学图书馆）分析所编码cDNA的身份，判断插入片段是否处于正确阅读框内，以及若处于正确阅读框，则确定被诱饵展示并捕获的蛋白编码序列（CDS）的具体区域。

结果

能够抑制诱饵与噬菌体展示蛋白相互作用的能力（即对诱饵进行代谢抑制）可为该技术提供强有力的阴性对照。此外，建议验证诱饵在结合至微孔板孔壁后是否仍保持其功能。这两项验证均可提高实验结果的可信度，确保由未抑制的诱饵回收到的、能与之相互作用的噬菌体展示蛋白是真实有效的。

从每个孔中取三个重复样会显著增加亲和筛选过程中的时间和工作量，但相比仅取一次样，能更准确地估计每个孔中的滴度。尽管大多数重复样的滴度结果一致性较好，但请注意，在第四轮实验中BSA的第2个重复的三个重复样之间差异较大（表1）。通过多次取样，最终估算值对移液误差的敏感性降低，从而获得了更准确的实际滴度估计值以及孔间滴度变异程度的更可靠评估（表1，图5C）。

随着亲和筛选轮次的增加，针对非毒化诱饵的噬菌体滴度逐渐升高，表明该技术正在有效发挥作用（图5C）。同时，随着亲和筛选次数的增加，含有插入片段的噬菌体在非毒化诱饵孔中的保留比例也逐步上升...

讨论

通过在三个重复的孔中进行实验，即使为同一克隆（i.e. 所获得的CDS区域核苷酸序列无差异，但这些克隆来自独立的孔），也可区分结合诱饵的相同蛋白质的噬菌体。否则，只有当编码结合诱饵的相同蛋白质的噬菌体来自独立的逆转录区域，并且其核苷酸序列的某些部分存在差异时，才能加以区分。

使用一个 Fernbach 摇瓶培养所有用于扩增亲和筛选噬菌体的细菌，相比同时监测9个锥形瓶，可显著减少感染前细菌生长监测的工作强度。在感染前将这些细菌转移至预热的锥形瓶中，还可消除因个别锥形瓶中细菌生长不良导致的感染复数变化，从而避免亚文库滴度差异。因此，每轮之间噬菌体滴度的变化应主要取决于保留在孔中的噬菌体数量，而重复孔之间的滴度差异应极小。

使用噬菌体展示技术的一个显著优势在于，该方法能够高效地鉴定出对特定诱饵具有亲和力的噬菌体展示蛋白。由于噬菌体在BLT5403宿主中具有高效的复制能力，即使在第一轮亲和筛选中仅有一个代表稀有编码序列（CDS）的噬菌体被保留在某个孔中，只要其外壳融合蛋白对诱饵具有高亲和力，该噬菌体在第二轮筛选中就会...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	Becton Dickinson 公司	211705
酵母提取物	Becton Dickinson	212750
琼脂	Becton Dickinson	214010
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-10
琼脂糖	研究产品国际公司	A20090
封闭试剂	EMD Chemicals 公司	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
氢氧化钠	Fisher Scientific	BP359-212
十二烷基硫酸钠	Fisher Scientific	BP166-500
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-5
氯仿	Fisher Scientific	BP1145-1
大肠杆菌 BLT5403	EMD Chemicals 公司	BLT5403	基因型：F- ompT hsdS<强>B (r<强>B - 米B -) gal dcm pAR<强>5403 (AmpR)
氨苄青霉素钠盐	研究产品国际公司	A40040
溴化乙锭	Fisher Scientific	BP102-1
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich 公司	A-9647
Penta-HIS 一抗	Qiagen 公司	34660
山羊抗小鼠碱性磷酸酶偶联物	Sigma-Aldrich 公司	A-5153
para对硝基苯磷酸盐	Sigma-Aldrich 公司	N-7653
T7-UP 引物	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN 引物	EMD Chemicals 公司		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen 公司	28104
Qiaquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen 公司	28706
Big Dye Terminator v3.1 循环测序试剂盒	Invitrogen Life Technologies	4336917
加热模块	Pierce化学公司（Thermo Fisher Scientific公司）	18780
96孔细胞培养板	康宁	Costar 3590
Isotemp 培养箱烘箱	Fisher Scientific	516D
巴斯德吸管，5 支 ¾ 在	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView 透射式凝胶成像仪	UVP 公司	TS-15
紫外线防护	Oberon	071AF
丁腈手套	Fisher Scientific	19-170-010C
无菌 1.5 ml 离心管	USA Scientific 公司	1615-5500
10 ml 硼硅酸盐吸管	Fisher Scientific	13-678-25E
硼硅酸盐培养管	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I 酶标仪	Labsystem 和 Flow Laboratories，赫尔辛基，芬兰	362型