使用重组蛋白诱饵进行噬菌体展示与亲和筛选的实验方案

摘要

噬菌体展示是一种强大的技术，可用于捕获与固定化目标分子相互作用的蛋白质或蛋白质片段。在确定了要构建和筛选的噬菌体cDNA文库类型后，本文所述方案可实现高效的亲和筛选，从而鉴定出相互作用分子。

摘要

利用重组噬菌体作为支架，展示由定向克隆的cDNA文库编码的各种蛋白质片段，并将其与固定的诱饵分子进行孵育，是发现分子相互作用的有效方法。该技术迄今主要用于发现蛋白质-蛋白质相互作用，但所使用的诱饵分子并不局限于蛋白质。本文所述方案已优化，可对适量的诱饵分子进行重复筛选，以最大限度地识别出展示相同蛋白的独立克隆，从而提高所鉴定出的相互作用蛋白确实是诱饵分子真实互作伙伴的可信度。在每轮亲和筛选后监测噬菌体滴度，有助于了解亲和筛选的进展状况以及阴性对照的有效性。本文介绍了测定噬菌体滴度的一种方法，并说明了为使该过程尽可能高效而需预先准备的材料和步骤。同时强调了在分离独立噬菌斑后获得扩增产物的特征，可用于评估亲和筛选的进行效果。文中还解释了减少假阳性结果或绕过持续回收噬菌体的故障排除技术，并讨论了降低病毒污染爆发的策略。

引言

为何要使用噬菌体展示和亲和筛选，而不是众多其他可用于发现和研究蛋白质与其他分子相互作用的技术？与其他检测蛋白质-配体相互作用的方法相比，噬菌体展示具有一些独特优势^1-3，包括以下几点：

诱饵分子的种类非常广泛

最主要的原因在于能够作为亲和筛选诱饵的分子具有高度多样性 ⁴。噬菌体展示是一种非常强大的技术，可用于分离能够与其它蛋白质、核苷酸、碳水化合物等等⁵ 相互作用的蛋白质片段。本质上，只要一种聚合物或分子能够被固定在可回收的载体上，就可以利用它来筛选与噬菌体展示蛋白具有亲和力的分子。此外，还可以对诱饵分子进行检测，以确定其在固定化后是否仍保留生物学活性⁶，验证用于降低或消除其活性的条件是否有效⁶，或者在亲和筛选前对诱饵分子引入翻译后修饰。

噬菌体对非特异性因素的抗性

使用噬菌体展示的第二个原因是，某些诱饵可能需要环境胁迫条件（如热、高渗透溶质浓度、特定辅因子， 等等.) 以捕获其相互作用的蛋白质，或者在进行亲和筛选之前可能需要对噬菌体展示的蛋白质进行某种修饰。研究的主要因素是诱饵蛋白与目标蛋白之间的相互作用，而非促成该相互作用发生的条件，或该相互作用是否对测试生物体具有....

方案

下文所述实验流程的示意图（图1）突出了利用噬菌体展示文库进行亲和筛选的两个主要组分：A）一个噬菌体展示cDNA文库，可能编码对诱饵具有亲和力的蛋白质；B）一种纯化的重组诱饵蛋白。诱饵（重组蛋白）的制备已有广泛研究，文献中详细阐述了从大肠杆菌（E. coli^12-13）、真核酵母¹⁴、昆虫^15-16、植物^17-18或哺乳动物^19-20细胞中获得可溶性、有活性的重组蛋白的最佳实践方法。

在以下实验方案中，使用了带有六组氨酸标签的重组蛋白作为诱饵。这可以验证诱饵蛋白在过夜孵育及洗涤步骤后仍保留在孔板中。

1. 微孔板孔中重组蛋白保留的酶联免疫吸附测定（ELISA）

1. 使用永久性墨水标记微孔板，并标明各孔所含的蛋白质浓度。每种浓度设置3个重复孔。同时设置3个阴性对照浓度系列（非六组氨酸标签蛋白；牛血清白蛋白BSA适合作为背景对照）。
2. 用大量水彻底清洗微孔板，每次清洗后将板倒置在4层纸巾上拍打以去除水分。
3. 在前3个孔中加入100 μl Tris缓冲液（pH 7.5，或所选缓冲液），其中含有最高浓度的重组蛋白（10 μg/ml）。在接下来的3个孔中依次加入重组蛋白，浓度分别为（1.0 μg/ml），依此类....

结果

能够抑制诱饵与噬菌体展示蛋白相互作用的能力（即对诱饵进行代谢抑制）可为该技术提供强有力的阴性对照。此外，建议验证诱饵在结合至微孔板孔壁后是否仍保持其功能。这两项验证均可提高实验结果的可信度，确保由未抑制的诱饵回收到的、能与之相互作用的噬菌体展示蛋白是真实有效的。

从每个孔中取三个重复样会显著增加亲和筛选过程中的时间和工作量，但相比仅取一次样，能更准确地估计每个孔中的滴度。尽管大多数重复样的滴度结果一致性较好，但请注意，在第四轮实验中BSA的第2个重复的三个重复样之间差异较大（表1）。通过多次取样，最终估算值对移液误差的敏感性降低，从而获得了更准确的实际滴度估计值以及孔间滴度变异程度的更可靠评估（表1，图5C）。

随着亲和筛选轮次的增加，针对非毒化诱饵的噬菌体滴度逐渐升高，表明该技术正在有效发挥作用（图5C）。同时，随着亲和筛选次数的增加，含有插入片段的噬菌体在非毒化诱饵孔中的保留比例也逐步上升.......

讨论

通过在三个重复的孔中进行实验，即使为同一克隆（i.e. 所获得的CDS区域核苷酸序列无差异，但这些克隆来自独立的孔），也可区分结合诱饵的相同蛋白质的噬菌体。否则，只有当编码结合诱饵的相同蛋白质的噬菌体来自独立的逆转录区域，并且其核苷酸序列的某些部分存在差异时，才能加以区分。

使用一个 Fernbach 摇瓶培养所有用于扩增亲和筛选噬菌体的细菌，相比同时监测9个锥形瓶，可显著减少感染前细菌生长监测的工作强度。在感染前将这些细菌转移至预热的锥形瓶中，还可消除因个别锥形瓶中细菌生长不良导致的感染复数变化，从而避免亚文库滴度差异。因此，每轮之间噬菌体滴度的变化应主要取决于保留在孔中的噬菌体数量，而重复孔之间的滴度差异应极小。

使用噬菌体展示技术的一个显著优势在于，该方法能够高效地鉴定出对特定诱饵具有亲和力的噬菌体展示蛋白。由于噬菌体在BLT5403宿主中具有高效的复制能力，即使在第一轮亲和筛选中仅有一个代表稀有编码序列（CDS）的噬菌体被保留在某个孔中，只要其外壳融合蛋白对诱饵具有高亲和力，该噬菌体在第二轮筛选中就会.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	Becton Dickinson 公司	211705
酵母提取物	Becton Dickinson	212750
琼脂	Becton Dickinson	214010
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-10
琼脂糖	研究产品国际公司	A20090
封闭试剂	EMD Chemicals 公司	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
氢氧化钠	Fisher Scientific	BP359-212
十二烷基硫酸钠	Fisher Scientific	BP166-500
Tris碱	Fisher Scientific	BP152-5
氯仿	Fisher Scientific	BP1145-1
大肠杆菌 BLT5403	EMD Chemicals 公司	BLT5403	基因型：F- ompT hsdS<强>B (r<强>B - 米B -) gal dcm pAR<强>5403 (AmpR)
氨苄青霉素钠盐	研究产品国际公司	A40040
溴化乙锭	Fisher Scientific	BP102-1
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich 公司	A-9647
Penta-HIS 一抗	Qiagen 公司	34660
山羊抗小鼠碱性磷酸酶偶联物	Sigma-Aldrich 公司	A-5153
para对硝基苯磷酸盐	Sigma-Aldrich 公司	N-7653
T7-UP 引物	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN 引物	EMD Chemicals 公司		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen 公司	28104
Qiaquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen 公司	28706
Big Dye Terminator v3.1 循环测序试剂盒	Invitrogen Life Technologies	4336917
加热模块	Pierce化学公司（Thermo Fisher Scientific公司）	18780
96孔细胞培养板	康宁	Costar 3590
Isotemp 培养箱烘箱	Fisher Scientific	516D
巴斯德吸管，5 支 ¾ 在	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView 透射式凝胶成像仪	UVP 公司	TS-15
紫外线防护	Oberon	071AF
丁腈手套	Fisher Scientific	19-170-010C
无菌 1.5 ml 离心管	USA Scientific 公司	1615-5500
10 ml 硼硅酸盐吸管	Fisher Scientific	13-678-25E
硼硅酸盐培养管	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I 酶标仪	Labsystem 和 Flow Laboratories，赫尔辛基，芬兰	362型