成年斑马鱼灌胃

摘要

斑马鱼作为动物模型的应用日益广泛，这需要开发出能够递送已知数量化合物和溶液的有效方法。下文所述的灌胃操作可对成年斑马鱼安全、可靠且高效地口服递送精确体积的溶液。

摘要

斑马鱼已成为生物医学研究中重要的体内模型。为了科学研究，必须开发并使用有效的方法将化合物或试剂以溶液形式递送至斑马鱼体内。目前通过口服方式向成年斑马鱼给药的方法由于鱼类自主摄食行为的个体差异而准确性较低。为此，研究人员建立了一种灌胃技术，可精确地将感染性病原体递送至斑马鱼体内，用于生物医学研究。将6个月龄以上的成年斑马鱼用150 mg/L缓冲的MS-222麻醉后，采用连接在剪断的22号针头上的柔软导管植入管，经口灌胃给予5 μl溶液。将柔软导管插入斑马鱼的口腔，直至管尖越过鳃部（约1 cm）。随后将溶液缓慢注入肠道。该方法的成功率为88%，且鱼类均顺利恢复。此操作效率较高，一人可在一小时内完成20至30条鱼的灌胃。该方法可用于在成年斑马鱼中精确给予感染性疾病研究所需的病原体，或其他化合物的研究应用。

引言

目前向斑马鱼口服给药的方法包括将化合物涂覆于饲料表面、混入明胶饲料¹、包埋于卤虫体内²、与脂质包被饲料混合³、制成蜡质喷雾微珠⁴以及通过谷蛋白为基础的饲料给药⁵。这些口服给药方法的局限性包括药物渗漏率高，以及单条鱼对化合物的摄取量不完全或不可预测。这些变量在感染性疾病研究中可能带来问题，因为准确知晓给予斑马鱼的感染剂量对研究成功至关重要。此外，先前的研究表明，某些化合物通过水浴方式给药时，在尚未出现肠道效应（即待研究的靶向效应）之前，已对斑马鱼的鳃部造成毒性损伤⁶。

灌胃是其他实验动物物种中常用的标准方法，用于在生物医学和药物研究中给予已知浓度的精确剂量物质。直到最近，文献中才开始描述斑马鱼的灌胃方法。其中一种技术为双人操作法，使用连接至2-20 μl移液器的24-G导管套管，递送5 μl溶液。⁷ 该方法在第一次和第二次试验中的死亡率分别为8.7%和39%；大多数死亡归因于怀卵雌鱼。另一种描述的灌胃技术使用钝头灌胃注射器向青鳉（Oryzias latipes）递送5 μl溶液。⁸ 但该研究未提供有关死亡率的信息，也未详细描述灌胃操作的具体步骤。根据加拿大动物护理委员会和实验室斑马鱼指南，可通过灌胃给予鱼类最高达其体重1%的剂量。^9,10 我们的目标是建立一种可重复、安全且高效的方法，用于向不同性别及处于各种繁殖阶段的成年斑马鱼口服递送精确体积的化合物。该方法适用于任何需要准确口服给药的研究。

方案

1. 配制麻醉溶液

1. 使用系统水，从储备液或粉末配制浓度为 150 mg/L 的 MS-222 溶液。
2. 使用 pH 计检测 pH 值。
3. 根据需要加入碳酸氢钠缓冲，直至 pH 值达到 7–7.5 之间。
4. 准备一个不含 MS-222 的系统水水箱，用于鱼类复苏。通常复苏时间少于 1 分钟。

2. 准备受灌胃装置

1. 将透明的22-G植入导管剪成略长于鱼类从口腔到肠球部的近似长度。最初，我们建议对每组新使用的鱼类麻醉一条鱼，以获得所需长度的最佳估计值。
2. 将剪好的透明植入导管推入½英寸22-G针头，直至固定牢固，无脱落风险。若无½英寸22-C针头，可将较长的针头剪至约该长度。
3. 完成后，导管植入管应从针尖伸出约1 cm，若鱼类体型较小，则可更短。
4. 将22-G针头接头连接至1 cc鲁尔锁注射器。

3. 灌胃前准备

1. 用手术刀片在海绵上切出一条凹槽。
2. 将海绵浸泡于不含 MS-222 的系统水中。
3. 将湿润的海绵放置在平坦的表面上。
4. 用 22 号导管和 1 cc 注射器吸取适量的 5 μl 灌胃溶液。

4. 麻醉与灌胃

1. 在操作前至少禁食鱼类 24 小时。
2. 将鱼放入 MS-222 溶液中，直至其失去翻正反射，对尾鳍夹捏无反应，但仍保持鳃盖运动。此过程通常需要约 2–3 分钟。
3. 将鱼从麻醉液中取出，放入海绵的凹槽中，使鱼头略微突出于海绵之外，但鳃部仍被海绵覆盖。
4. 将海绵调整至垂直位置。
5. 使用 22 号导管插入斑马鱼口中以撑开口腔。
6. 轻柔插入导管，直至管尖通过鳃部（约 1 厘米或导管长度），植入过程不应施加过大压力。若遇阻力，提示导管可能触碰到鳃弓或心脏。
7. 若遇到阻力，应轻柔撤回导管，重新调整位置后再次尝试。
8. 缓慢注射材料。
9. 注射过程中，确保溶液不会从鳃部或口腔溢出。
10. 将鱼从海绵中取出，放入恢复缸中。
11. 恢复通常在 1 分钟内完成，表现为鱼体恢复正常直立游动并维持平衡。
12. 需观察鱼是否出现反流现象，表现为可见的从口中主动排出物质，或鳃盖无运动。
13. 鱼体恢复后即可放回常规养殖缸中。

结果

包括怀卵雌鱼在内的雌雄鱼类均成功完成了灌胃操作（图1）。一次成功的操作耗时不到一分钟，且无液体从鳃部或口腔流出。导管可轻松插入，无需施力，拔出导管后未见出血。该操作快速高效，平均每次灌胃3至4条鱼约需10分钟，每条鱼平均耗时30至45秒。

斑马鱼灌胃时，任何溶液的体积均不应超过 5 μl。使用 10 μl 溶液进行灌胃的成功率仅为 50%（图 2）。在怀卵雌鱼中，10 μl 的灌胃操作则完全失败。本研究中，成年斑马鱼平均体重为每条 0.2 g。根据加拿大实验动物管理委员会（CCAC）的建议，这意味着每条鱼最多可给予 4 μl 溶液。目前使用的 5 μl 体积与该建议基本一致。该技术的死亡率约为 10%，主要发生在怀卵雌鱼，这些鱼通常在次日被发现死亡。尽管该死亡率显著低于其他报道的灌胃技术，但理想情况下，除非研究需要，明显怀卵的雌鱼应避免进行灌胃操作。

讨论

意义

该技术是一种改进方法，相较于此前描述的两种成年斑马鱼灌胃技术具有多项优势。首先，使用海绵固定鱼类可使一人独立完成操作，而此前描述的技术需要两人配合⁷。其次，导管植入管材比静脉导管更具柔韧性，有助于最大限度减少穿孔造成的继发性损伤，其效果类似于使用钝头注射器^7,8。第三，由于采用透明管材，可清晰观察溶液进入鱼体的过程。最后，灌胃装置结构稳定，便于在需要对大量鱼类进行灌胃时快速高效地重复使用。总体而言，灌胃技术可减少其他口服给药方法在斑马鱼中常见的摄取量和浓度差异，因此还可能减少实验所需的鱼类数量^1-5

关键步骤

还必须至少禁食鱼类24小时，因为12小时的禁食时间不足以使所有斑马鱼的肠囊排空。24小时的禁食可防止由于肠道部分充盈而导致溶液从口部和鳃部反流或流失¹³。最常见的问题是液体从口部或鳃部流出，这表明导管插入肠道的深度不够。通过观察导管的正确位置，并使用足够长的导管以绕过鳃部，可避免液体从...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
一块海绵
1-cc 鲁尔锁注射器	Becton Dickinson Co
22-G Micro-Renathane 植入导管（已剪断）	Braintree Scientific, Inc.
1 支 22-G 针头（如需要可剪断）	Becton Dickinson Co
pH 计	Hanna probe
1 片手术刀片
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试剂/材料
MS-222 (Finquel)	Argent Laboratories