使用 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模基因敲低以产生稳定的基因功能缺失表型

摘要

尽管在C. elegans中通过喂食dsRNA是评估基因功能的有力工具，但现有的大规模喂食筛选方案常导致基因沉默效率不稳定。本文介绍了一种改进的大规模RNAi喂食筛选方案，可实现高效且可重复的基因表达沉默。

摘要

通过喂食表达双链RNA（dsRNA）的细菌来实现线虫的RNA干扰，已成为研究C. elegans基因功能的有效工具。尽管在靶向少数基因进行基因沉默时该策略效果良好，但在大规模喂食筛选中，基因沉默效率存在较大变异，限制了其应用价值。我们对先前发表的RNAi基因沉默实验方案进行了系统分析，发现导致沉默效率降低的主要原因是喂食过程中细菌丢失了编码dsRNA的质粒。基于这些发现，我们开发了一种dsRNA喂食方案，可显著减少甚至消除质粒丢失，从而实现高效、高通量的基因沉默。我们证明，该方案可在包括神经元在内的多种C. elegans组织类型中产生强烈且可重复的基因沉默效果，并适用于大规模筛选实验。本方案使用 commercially available 的dsRNA喂食文库，并详细描述了文库扩增及开展dsRNA筛选所需的全部步骤。该方案无需使用任何复杂仪器，因此任何C. elegans实验室均可实施。

引言

传统上，C. elegans 的遗传筛选是通过使用甲基磺酸乙酯等化学诱变剂处理线虫，从而在 DNA 中产生随机突变。随后分离经诱变处理的线虫的子代或孙代，筛选出具有特定异常表型的个体。然后通过耗时且繁琐的基因定位方法，或通过对突变线虫的全基因组进行测序，来确定导致该表型的突变位点。化学诱变筛选具有诸多优势，因其可在线虫基因组中产生永久性损伤，从而导致功能获得性或功能缺失性表型；但其基因定位过程较为缓慢且成本较高。

双链RNA干扰（dsRNAi）为鉴定参与重要生物学过程的基因提供了一种替代方法。该方法将与内源基因编码序列匹配的双链RNA导入线虫体内。该双链RNA被加工处理 体内 产生小分子（21-22个核苷酸）RNA，作为引导序列识别并结合互补的内源mRNA，从而靶向其降解 ¹该方法相对较快，但由于双链RNA（dsRNA）靶向的是mRNA而非DNA，因此使用此方法仅能观察到功能降低的表型。

将双链RNA（dsRNA）导入动物体内可通过直接注射dsRNA ²、将动物浸泡在dsRNA溶液中 ³，或喂食表达dsRNA的细菌 ⁴来实现。这些递送方法均可引起系统性的基因沉默效应，因为动物的大多数细胞都表达SID-1——一种能够摄取dsRNA的跨膜通道蛋白 ⁵。最初，该技术被用作反向遗传学手段，逐个敲低单个基因的表达；随着两种喂食文库的开发，现已可进行大规模的遗传筛选。市面上可获得的dsRNA文库包含细菌克隆，分别覆盖了约55%或87%的全部C. elegans基因 ^{6, 7}。

遗憾的是，大规模 dsRNAi 饲喂筛选通常会导致基因敲低效率的差异^8-10。尽管RNAi介导的基因敲低绝对水平难以直接测量，但在大规模筛选中观察到的敲低效率降低必然源于部分基因特异性mRNA未被RNAi机制降解而残留下来。这可能是由于在筛选过程中喂给动物的细菌丢失了表达dsRNA的质粒所致。支持这一观点的证据表明，当动物被喂食仅50%细菌表达靶基因dsRNA的混合菌液时，其基因敲低效果与对照组动物相比显著降低（甚至完全消失）¹¹。在进行dsRNAi筛选时，基因敲低的程度成为一个关键问题，因为大多数 C. elegans 基因具有单倍充足性，因此基因表达水平必须至少降低50%，才能产生功能缺失表型¹²。

我们曾采用先前发表的饲喂方案进行大规模筛选，结果发现与他人报道的相同，基因敲低效果存在变异 ^8-10。在寻找可能原因的过程中，我们发现筛选中喂给线虫的细菌中近60%已丢失了dsRNA质粒。为此，我们开发了一种文库扩增与筛选方案，可显著减少甚至完全避免质粒丢失，从而大幅提高基因敲低效率。该方案适用于在C. elegans中开展大规模筛选，可用于筛选任意一种市售的dsRNA文库。采用此方案后，我们发现筛选过程中喂给线虫的细菌几乎100%均保留了编码dsRNA的质粒，并在所检测的所有组织中均引起强烈且高度完全的基因功能缺失表型。

方案

注意：本实验方案可用于鉴定多种组织类型中多种生物过程所必需的基因。在筛选过程中，作为必要的质量控制措施，需用表达阳性对照和阴性对照dsRNA的细菌饲喂动物，以验证在靶向组织中产生RNA干扰效应。

其他已发表的饲喂方案在含有50 μg/ml氨苄青霉素或25 μg/ml羧苄青霉素的条件下培养表达dsRNA的细菌^8-10。我们发现，在上述任一条件下培养的细菌会以较高频率丢失dsRNA质粒。事实上，即使在极高浓度（高达2 mg/ml）的氨苄青霉素中过夜培养，仍有超过50%的细菌不再含有质粒。虽然在羧苄青霉素中培养通常能实现较高的质粒保留率，但25 μg/ml的浓度仍不足以防止质粒丢失。相反，我们发现，在液体培养中需要500 μg/ml的羧苄青霉素才能阻止质粒丢失，而在固体琼脂基质上培养细菌时，则需要2 mg/ml的羧苄青霉素才能有效阻止质粒丢失。

由于质粒的保留对于基因敲低的成功至关重要，本实验方案在培养dsRNA细菌时仅使用羧苄青霉素。我们已仔细优化了本方案所述细菌培养过程中所用羧苄青霉素的浓度，以确保不含质粒的细菌无法在此类培养物中生长。然而，作为质量控制措施，需在实验流程的多个步骤中检测质粒丢失情况。为确保高效的基因敲低，每个步骤中超过80%的细菌必须含有dsRNA质粒。若在任一步骤中有超过20%的细菌丢失了dsRNA质粒，则应检查所用羧苄青霉素的质量。羧苄青霉素应在使用当天新鲜配制。请重新配制新鲜的羧苄青霉素并重复培养。

1. 如何测定质粒丢失

1. 在每个相关步骤中，取出少量细菌样品，并加入到 450 μl 无菌水中。
2. 取 100 μl 该稀释后的样品，用无菌水进行 1:10、1:100 和 1:1,000 的系列稀释，每次稀释后需充分混匀溶液。
3. 将每种稀释液各取 100 μl 涂布于 LB 和 LB AMP 平板上，并在 37 °C 条件下过夜培养。
4. 次日，找出含有 100 至 500 个菌落的 LB 平板。计数该平板及相应稀释度的 LB AMP 平板上的菌落数量。
5. 根据这些菌落计数确定质粒丢失率。不含质粒的细菌百分比按公式 1 计算，有效 dsRNA 沉默时应低于 15%。

2. 制备重复文库板

概述： dsRNA文库将由制造商（OpenBiosystems）以10,566个细菌克隆的形式提供，分装于96孔板中。收到后应立即将这些板存放于-80 °C超低温冰箱中。原始文库板将被复制，所有喂养筛选实验均使用这些复制的文库板作为细菌来源。建议将原始文库板和复制文库板分别存放在不同的冰箱中。为便于操作，建议每天仅复制10块文库板。

1. 从 -80 °C 冰箱中取出文库板，当细胞仍处于冷冻状态时，移除封板铝箔。重新盖上文库板的塑料盖，将板置于水平面上，在室温下解冻（不超过 30 分钟）。

注意： 我们发现原始文库板中每个孔所含的细菌有相当一部分不携带质粒。然而，由于文库菌株是宝贵的资源，不建议对原始文库培养物进行质粒丢失的检测。

2. 使用多通道移液器，向一个空的 96 孔平底复制板的每孔中加入 150 μl 文库复制培养基。
3. 用设定为 100 μl 的多通道移液器将解冻的文库细菌培养物上下吹打 4 至 5 次以混匀。然后取每种混匀培养物的 10 μl 转移至复制板中对应的孔内。继续将文库板中的培养物转移至复制板，确保每次转移均更换移液器吸头。
4. 当文库板中的所有培养物完成转移后，使用压辊将新的自粘箔膜覆盖于原始文库板的孔上，以确保完全密封。将板盖重新盖上，并将板正立放置于 -80 °C 冰箱中，直至培养物完全重新冻结（至少 30 分钟）。然后将原始文库板放回文库储存盒中。
5. 将文库复制板的培养物在 37 °C 条件下水平震荡培养 8–10 小时（微型摇床，转速 450 rpm，振幅 3 mm）。
6. 测定每个文库复制板中的质粒丢失情况。我们发现原始文库板每孔中大部分细菌不含有 dsRNA 质粒。这些细菌不应在复制文库中生长，因此必须加以抑制。为防止其生长，文库复制培养基中使用高浓度的羧苄青霉素（3 mg/ml）。在上述条件下培养复制板后，我们发现超过 90% 的细菌含有 dsRNA 质粒。从每个复制板中代表性培养孔取 10 μl 样品，加入 450 μl 无菌水中。利用这些稀释后的样品，按照步骤 1.1–1.4 测定每个文库复制板中的质粒丢失率。若观察到显著的质粒丢失（>20% 的复制文库细菌不含质粒），则需使用新鲜的羧苄青霉素重新配制培养基，并从步骤 2.1 重新开始实验流程。
7. 培养结束后，将一张新的自粘箔膜直接覆盖在复制板的孔上，并将板盖盖在箔膜上。将文库复制板正立放置于 -80 °C 冰箱中（至少 30 分钟），直至完全冻结。冻结后，将板转移至文库复制储存盒中进行长期保存。

3. 在 Omniplates 上制作文库的临时拷贝

概述：为了开始为dsRNA筛选准备食物，需将来自两份重复文库平板的细菌转移至固体琼脂omni平板，并过夜培养。为防止在固体培养基上发生质粒丢失，omni平板中含2 mg/ml的羧苄青霉素。这些平板上的细菌可在一周内使用，且未出现质粒丢失现象。我们尚未检测在omni平板上培养超过一周的细菌是否会发生质粒丢失。

1. 从 -80 °C 冰箱中取出重复文库板（或多块板），并在菌种仍处于冷冻状态时揭去铝箔封膜。去除铝箔后，盖上板的塑料盖，将重复文库板置于水平台面上，在室温下解冻（不超过 30 分钟）。
2. 对 Boekel 96 针复制器进行灭菌。每次使用前，应先用蒸馏水冲洗洁净复制器的针头，然后进行灭菌。灭菌时，将复制器放入乙醇浴中（Pyrex 培养皿中乙醇深度约 3/4 英寸），再用本生灯点燃附着在针头上的乙醇，待火焰自然熄灭后重复一次该过程。
3. 将已灭菌的复制器插入已解冻的重复板孔中，轻轻搅动菌液。少量菌液会附着在复制器的针头上。
4. 小心地将复制器从重复板孔中取出，然后轻轻将其（针头朝下）放置在 omniplate 表面，注意不要刺破琼脂表面。让复制器在 omniplate 表面停留 3–4 秒，使针头上的细菌转移到琼脂表面。
5. 移开复制器，使少量菌液（2–3 μl）被琼脂吸收。将 omniplate 倒置，于 37 °C 培养 15–18 小时。这些 omniplate 可于次日用于接种 96 孔液体培养物。或者，含有过夜菌落的 omniplate 可在 4 °C 下保存最多七天。
6. 若需对更多重复板进行复制转移，先用无菌水冲洗复制器针尖，然后按前述方法将复制器浸入乙醇并用火焰灭菌两次。灭菌完成后，即可用于下一块重复板。
7. 测定 omniplate 上过夜培养后的质粒丢失情况。omniplate 上过夜生长后的细菌菌落将作为筛选实验的临时食物来源。确保每个菌落中超过 80% 的细菌含有 dsRNA 至关重要。细菌在固体琼脂培养基上比在液体培养中更容易丢失质粒。选取 omniplate 上两个代表性菌落，分别取少量菌接种至 1 ml 无菌水中，用此稀释样品按照步骤 1.1–1.4 测定质粒保留率。预期结果：每个菌落中超过 90% 的细菌应含有 dsRNA 质粒。若观察到显著的质粒丢失（omniplate 上某一菌落中超过 >20% 的细菌无质粒），则需使用新鲜的羧苄青霉素重新制备 omniplate 培养基，并从步骤 3.1 重新开始实验流程。

4. 准备用于喂食线虫的细菌

概述：用于喂养线虫的细菌通过96孔板格式中的1 ml液体培养物（来自omniplates的细菌）制备。这些液体培养物经夜间培养以产生饱和的非对数期细菌培养物。过夜培养可确保所有培养物中含有相似浓度的细菌，从而保证所有线虫摄取的食物量一致。在此培养过程中不应观察到质粒丢失现象。

1. 使用多通道移液器和50 ml Combitip，将1 ml细菌培养基加入至2 ml深孔96孔板的每个孔中。
2. 将无菌复制器轻轻放置在已完成步骤3.1–3.6所生成细菌菌落的omniplate表面，确保每个针头均接触96个细菌菌落。
3. 小心地将复制器从omniplate表面转移至深孔板中，注意针头在浸入培养基前不要刮擦深孔内壁。缓慢沿深孔板内壁做方形移动，使细菌从针头脱落并分散到培养基中。注意避免液体飞溅，防止孔间交叉污染。
4. 对照孔：每块96孔深孔培养板中，应加入一孔表达dsRNA的细菌作为阳性对照，用于预期基因敲低表型的验证；另加一孔含空dsRNA载体（pL4440）的细菌作为阴性对照。我们每周将对照用dsRNA表达菌在含四环素（15 μg/ml）和羧苄青霉素（2 mg/ml）的LB平板上重新划线一次，以保持菌种新鲜并维持质粒稳定性。
5. 使用无菌接种环从对照平板上挑取单个分离良好的菌落（菌量应与复制器转移的量相当），接种至深孔培养板中的一个空孔中，并记录接种孔的位置。或者，也可将带菌的接种环放入含有250 μl培养基的Eppendorf管中，涡旋混匀后用于接种多个孔。
6. 将深孔板置于37 °C恒温摇床中，以650 rpm（振幅3 mm）水平振荡过夜培养。次日清晨培养物将达到饱和状态。尽管如此，培养基中所用的羧苄青霉素浓度应足以防止质粒丢失。
7. 检测1 ml过夜培养物中的质粒丢失情况。这些培养物将直接用于喂食线虫进行筛选实验。确保每孔培养物中超过80%的细菌仍携带dsRNA质粒。根据步骤1.1–1.4检测两个代表性培养物的质粒保留率。预期结果：每个培养物中超过90%的细菌仍携带dsRNA质粒。我们在实际操作中从未观察到此类过夜培养物出现显著质粒丢失。然而，若发现质粒丢失严重（>20%），则需使用新鲜羧苄青霉素重新配制培养基，并从步骤4.1开始重复实验流程。只要omniplate保存时间不超过1–2周，即可从中重新启动培养。
8. 用于启动1 ml培养物后，omniplate应保存于4 °C直至筛选完成，后续可作为食物来源用于启动任何复测培养。
9. 培养过夜后，使用12通道多通道移液器从深孔板中取出150 μl细菌培养物，滴加至喂食板表面。转移过程中切勿刺破琼脂表面，否则线虫会钻入琼脂而无法摄食表达dsRNA的细菌。每次可同时转移四个孔（图1）。具体操作为：将移液器吸头安装在多通道移液器每隔三个通道的位置（因喂食板每行仅有四个孔）。每完成一组四孔转移后，更换为新的无菌吸头。每块96孔深孔培养板需使用96个吸头，将培养物转移至八块12孔喂食板。
10. 将接种后的平板直立存放于避光环境中过夜，使细菌充分渗入琼脂。

5. 生成L1期停滞的C. elegans幼虫

概述：使用L1期停滞的幼虫在dsRNA喂食平板上起始同步的线虫培养物。这些幼虫通过漂白处于产卵期的成年虫群体以分离健康的卵，然后将卵置于无食物的S-complete培养基中孵化而获得。由于缺乏食物，孵化出的L1幼虫将停滞发育，从而形成同步化的L1幼虫群体。在筛选过程中，应每周制备新鲜的L1期停滞幼虫，因为这些饥饿状态的动物会随着时间推移而状态变差，必须丢弃。用于dsRNA喂食菌株的动物遗传背景可根据具体应用而选择；对于神经元筛选，推荐使用eri-1; lin-15B突变体。

1. 挑选10-20条L4期幼虫至六块独立的NGM平板上，每块平板均含有OP50细菌菌苔，等待6-7天，直至平板上出现大量新产的卵和怀卵成虫。
2. 向每块平板表面加入3 ml水，用戴手套的手指轻轻搅动，使卵、细菌及线虫从平板表面脱离并悬浮于水中。确保覆盖平板所有区域，特别注意细菌菌苔区域。使用玻璃移液管将每块平板中的水、细菌、线虫和卵收集起来，转移至一个无菌的50 ml锥形管中。
3. 再次向每块平板表面加入3 ml水，用移液管反复吹打表面，以去除残留的细菌、线虫和卵。将此液体一并加入上述50 ml锥形管中。
4. 将锥形管在台式离心机中以1,500 rpm离心1分钟。线虫和卵应形成沉淀，而细菌则保持悬浮状态。小心吸除上清液，仅保留4 ml液体，注意避免扰动沉淀中的线虫和卵。
5. 用玻璃移液管将沉淀的线虫重新悬浮于残留液体中，并转移至一个无菌的15 ml锥形管中。用无菌水定容至10 ml。
6. 同前以1,500 rpm离心1分钟。吸除上清液，仅保留200 μl水，以免扰动线虫/卵沉淀。
7. 向锥形管中加入10 ml水以洗涤线虫和卵，然后同前离心，以进一步去除残留细菌。

注意： 在步骤 5.8–5.11 中，线虫和卵将暴露于漂白液中。漂白液会破坏线虫，但对卵的损伤相对较小。然而，若卵在漂白液中停留时间过长，也会被破坏。在步骤 5.8 加入漂白液时应设置计时器，确保卵暴露于漂白液的时间不超过 10 分钟。

8. 除去上清液，仅保留 200 μl，注意避免触及沉淀，然后加入 10 ml 次氯酸钠溶液，并启动计时器。
9. 将线虫和虫卵在次氯酸钠溶液中孵育 3–4 分钟，期间偶尔颠倒混匀。随后在台式离心机中以 1,500 rpm 离心 45 秒。观察试管底部的沉淀，其应比原始沉淀更小、更致密，且可能呈现黄色。
10. 吸除次氯酸钠溶液，保留 200 μl 以避免扰动沉淀。
11. 再加入 10 ml 新鲜次氯酸钠溶液，同前颠倒混匀。当计时器达到 10 分钟时，再次离心并吸除次氯酸钠溶液，保留 200 μl，然后迅速加入 10 ml 无菌水。在解剖显微镜下观察溶液，其中幼虫及多数成虫应已被溶解，主要剩下虫卵。
12. 同前离心 45 秒，再次小心吸除上清液，避免扰动沉淀。此沉淀主要含有虫卵，质地非常疏松。
13. 加入 10 ml 水，颠倒混匀，离心后吸除上清液，保留少量水。务必尽可能彻底去除残留的次氯酸钠溶液。
14. 向锥形管中加入 4 ml S-complete 培养基，重悬虫卵后转移至无菌的 100 ml 锥形瓶中。将锥形瓶置于 20 °C 摇床培养箱中，调节摇床速度至使瓶内液体轻微旋转即可。此条件可提供足够的通气，以支持 L1 幼虫孵化后的生长。约 15 小时内，所有虫卵应均已孵化，获得同步化的 L1 期滞育幼虫群体。

在筛选过程中，应每周新鲜制备滞育的L1幼虫。在完成第一批制备后，后续批次可通过将500条滞育L1幼虫（来自上周批次）分别接种到四个标准的已涂布OP50的6 cm培养板（每板含100 μl OP50过夜培养物）中，并在20 °C下培养4天来启动。第4天时，培养板中应含有大量卵和怀卵成虫，此时可进行漂白处理，以获得新鲜卵用于制备更多同步化的L1幼虫。

6. 将滞育的L1幼虫转移至喂养平板

概述：为了进行dsRNA筛选，将20-30条L1期停滞的幼虫转移至含dsRNA的饲喂平板上。在动物摄食表达dsRNA的细菌2-3天后，可观察到早期的基因敲低效应，例如幼虫停滞或致死现象。根据筛选实验的设计，目标表型可能在最初放置于饲喂平板上的动物（P0代）中出现，也可能在其后代（F1代）中出现。表型的显现取决于多种因素，包括被敲低基因所编码蛋白的存续时间，以及目的基因在发育过程中发挥作用的时间点。以每板仅20-30个动物起始dsRNA饲喂培养，可在食物耗尽前同时观察到P0代和F1代的表型。

为将20-30个动物轻松转移至喂养板，首先需确定L1期停滞动物在停滞L1培养物中的浓度。

1. 轻轻混匀装有停滞在L1阶段幼虫的锥形瓶，使动物分布均匀。
2. 吸取10 μl样品，分4-5滴缓慢滴加到未接种的6 cm NGM平板中央，确保移液枪头中的全部液体均已排出。
3. 使用移液枪头末端将各液滴的线虫悬浮液摊开，形成一条贯穿平板直径的连续液线。
4. 在液体被平板吸收且线虫开始分散之前，使用解剖显微镜从液线一端开始计数，逐个计至另一端。为确保不遗漏任何个体，可能需要持续调节解剖显微镜的焦距。
5. 对三个独立的10 μl样品重复上述操作，取三次计数结果的平均值，计算每微升线虫悬浮液中的平均线虫数量，并将该数值直接记录在锥形瓶上。

7. 开始喂养筛选

概述：开始双链RNA筛选时，将20至30条停滞在L1期的幼虫加入含有少量表达双链RNA细菌的12孔喂养板的每个孔中。喂养板含有标准的线虫生长培养基（NGM），并添加500 μg/ml羧苄青霉素（防止质粒丢失）和1 mM IPTG（诱导双链RNA表达）。将线虫置于20 °C下喂养并发育数天。通常，进行P0代筛选时喂养3天，进行F1代筛选时喂养6至7天。然而，喂养时间可根据筛选中所关注的特定表型进行调整。

1. 使用L1期 arrested 幼虫的悬浮液和无菌水配制含有2,000条线虫/毫升的溶液。每块12孔喂食板需要120 μl该线虫悬浮液。充分混匀以确保线虫分布均匀，并将线虫转移至无菌储液槽中用于移液。
2. 使用多通道移液器，枪头安装在每隔两个位置（即每第三个通道安装枪头，参见图1），将10 μl线虫溶液直接加到喂食板的细菌菌苔上。注意不要刺破琼脂表面，否则线虫会钻入琼脂内部而无法摄取表达dsRNA的细菌。
3. 由于线虫沉降迅速，每处理两行喂食板后，需轻轻摇动储液槽重新混匀线虫溶液。持续分装线虫悬浮液，直至所有喂食板均加样完毕。实验初期可在解剖显微镜下检查若干孔，确保每孔含有20–30条线虫。
4. 将培养板直立放置于湿润盒中，于20 °C培养箱内培养。次日，待线虫悬浮液完全渗入培养基后，将培养板倒置，重新放回20 °C湿润环境中继续培养。接种后的培养板可在3天后观察P0代表型，6天后观察F1代表型。

注意： 蠕虫生长7天后，取食平板上残留的细菌经检测发现质粒丢失率极低，几乎100%的细菌仍保留有dsRNA质粒。

结果

在用表达dsRNA的细菌喂养动物2-3天后，P0基因敲低的表型将开始出现。一些早期表型包括幼虫停滞和致死现象，这些表型应在所有喂养孔的2-3%中观察到。这些相同的表型也将在F1代动物中出现。F1代卵无法孵化是另一种常见的F1代表型，这三种表型合计将在F1代筛选的所有孔中接近10%的孔中观察到。

我们采用此处描述的方案，检测了多个在P0和F1代表型中于多种组织类型中表达的基因的敲低效应。由于我们还想检测神经组织中的基因敲低效应，因此在筛选中使用了eri-1; lin-15B突变体。eri-1和lin-15B的突变，以及rrf-3的突变，是在筛选导致RNAi敏感性增强的突变体时被鉴定出来的^8,13,14。

我们测试了四个基因的敲低效果：egl-30、dpy-17、pat-10 和 unc-4。其中两个基因 egl-30 和 unc-4

讨论

我们描述了一种利用 commercially available 的 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模筛选的实验方案。我们提供了复制该文库并有效使用它的全部操作步骤。我们证明，该方法能够鉴定出参与动物不同组织中多种生物学过程的基因。尽管本文所描述的表型易于观察（如 Unc、Egl 和 Dpy），但该方案可被调整用于搜索几乎任何生物学过程所必需的基因。例如，我们已利用该方案鉴定了线虫中神经传递所必需的基因²⁵。当动物摄食表达 dsRNA 的细菌后（P0 筛选通常为 3 天，F1 筛选为 6–7 天），可将其从饲喂平板中移出，并检测其是否存在任何行为表型。

质粒丢失：

我们发现，在大规模 dsRNA 筛选中观察到的基因沉默效率降低可直接归因于喂食线虫的细菌中丢失了 dsRNA 质粒。质粒的丢失发生在细菌培养过程中，原因是 dsRNA 文库质粒编码的 β-内酰胺酶能够降解氨苄青霉素和羧苄青霉素，导致这些抗生素的浓度随时间逐渐降低。当抗生素浓度降至足够低时，不含质粒的细菌便能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料
96孔Falcon平底板	Fisher Scientific	353072	无菌
粘性封口膜	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml深孔96孔聚丙烯Masterblock	USA Scientific	5678-0285	可高压灭菌
深孔板盖	USA Scientific	5665-6101
50 ml Combitips	USA Scientific	4796-5000	单独包装
储液槽	USA Scientific	2977-8500	可高压灭菌
12孔板	USA Scientific	CC7682-7512	单独包装
dsRNA饲喂文库	OpenBiosystems	RCE1181	保存于 -80 °C
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5
四环素	Fisher Scientific	BP912-100
羧苄青霉素			允许2-4周交货时间 www.biochemicaldirect.com
细菌学琼脂，超纯级A	Affymetrix	10906	用于线虫培养板
仪器
压板滚轮	USA Scientific	9127-2940
B–kel 96针复制器	Fisher Scientific	05-450-9	可高压灭菌
微型振荡器	Thomas Scientific	1231A93	3 mm轨道
12通道多道移液器（0.5-10 μl）	USA Scientific	7112-0510
12通道多道移液器（30-300 μl）	USA Scientific	7112-3300
Repeater Plus手动移液器	USA Scientific	4026-0201