可视化的一个积极的早期经验，触觉刺激的影响，对树突状形态和突触连接与高尔基染色考克斯

摘要

本文介绍的程序幼鼠的触觉刺激和神经元形态的后续高尔基 - 考克斯染色。触觉刺激是受抚摸幼崽与家用除尘器投在围产期一个积极的经验。高尔基体的cox染色是一种可靠的方法，允许整个神经元的可视化。

摘要

为了产生行为的长期变化，经验必须在生产神经元形态和突触连接的稳定变化。触觉刺激是一个积极的早期经验，模仿产妇舔和修饰大鼠。暴露幼鼠这个积极的经验，可以通过使用非常方便的材料，如一个家庭掸子轻松且经济高效地完成。使用跨垃圾设计，幼仔要么抚摸或静置，15分钟，每天三次在整个围产期。测量与此相关的阳性早期经验的神经可塑型变化，脑组织中的高尔基体考克斯染色被利用。由于该高尔基考克斯浸渍染色离散神经元的数目，而不是所有的细胞的事实，所述啮齿动物的脑与高尔基体考克斯溶液的染色使得整个神经元素，包括细胞体，树突，轴突的可视化，并树突棘。在染色过程中，我s进行了数天，并要求研究人员密切关注细节。然而，一旦染色完成后，整个大脑已经浸渍和可无限期保存正在进行的分析。因此，高尔基体考克斯染色是研究经验依赖性可塑性的宝贵资源。

引言

虽然有许多报道和利用技术的负面早期经验对大脑的成熟，如围产期应激^1,2，感觉剥夺^3，药物的毒副作用⁴考试，有来检查的积极经验的影响非常少的方法这个时间段。除了 ​​丰富环境，触觉刺激是几大脑加强与展示效果⁵疗程之一。触觉刺激的感官刺激，模仿母亲的行为鼠，舔和修饰皮肤的方法。其普遍接受作为一个积极的操作来自研究表明触觉刺激改善早产儿和新生儿大鼠⁶成熟。此外，研究在实验室米尼⁷表明，较高水平的孕产妇舔和仪容产品都与后代的积极成果。由于到T灰褐色的积极影响，触觉刺激迅速演变成一个补救战略，旨在减少焦虑^8，改善与脑损伤有关的^9-11的结果，并减弱药物过敏^12。因此，触觉刺激是一个有价值的技术，以促进积极的早期经验，具有公认的能力大幅改组神经元形态和发育中的大脑的突触连接。

为了检查和定量改变神经元的形态，它是必要的可视化完好的神经元。高尔基-考克斯染色过程是刊登在1800年代后期卡米洛高尔基的技术，提供少数完整的神经元¹³离散染色的修改。虽然过程会出现染色神经元随机和再现性普遍提及的重大缺陷，整个神经元的小浸渍速度许可证可视化，包括CELL体，树突，树突棘和轴突。同样，浸渍给定的大脑与高尔基体解决方案所需的时间也被认为是一个垮台。不过，由于一旦染色完成组织可以无限期保存，和神经元用显微镜的大脑和可视化的灌注之间的时间不到21天完成，时间周期是没有道理的。此外，稍加修改的协议，高尔基 - 考克斯染色可有效地用于所有年龄段浸渍啮齿动物的大脑。由于在结构层面的变化都与执着的修改行为和心理功能，高尔基 - 考克斯染色技术为研究人员提供了一个宝贵的工具来测量神经可塑性。

方案

所有实验均符合动物保护的加拿大议会批准通过莱斯布里奇大学，动物护理委员会。

1。育种和触觉刺激

1. 订单孕鼠从普通动物的供应商，或使用标准的实验室繁育程序内部滋生的幼崽。
2. 房子在一个温度控制饲养室（21℃），保持在12:12小时的光所有的动物:暗周期，并提供获得食物和水随意 。
3. 当幼仔出生后，房子雌性大鼠分别与它们的后代。
4. 为了避免额外的压力与出生后立即处理，幼仔开始在P3的触觉刺激。
5. 触觉刺激应该从P3〜P21进行三次，每天（上午9:00，下午1:00和4:00 PM）和幼犬应在P21的母亲断奶。
6. 当使用交叉垃圾设计，一半的幼仔FR嗡每窝将经历触觉刺激的另一半用作对照。随机将雄性和雌性幼仔数目相等各组。为了区分幼崽接受触觉刺激和控制，对他们的后腿和尾巴记号笔标注一组幼崽。标记必须被重新应用每隔一天。

触觉刺激

7. 从他们的家笼坝移除，并放置在一个临时笼子里的食物和水。保持在养殖/屋室大坝和临时笼。
8. 称取幼鼠作为一个群体之前，早上触觉刺激会（上午9:00）。对于每个会话，运输幼鼠饲养笼到一个单独的试验室触觉刺激。将笼子上，它被设置为24°C的加热垫
9. 使用硬板来划分家笼成两半。将幼鼠的触觉刺激组一半，控制幼崽中的另一半。设置一个计时器到15分钟。
10. 使用柔软的羽毛般的掸子，刷触觉刺激组中的所有幼崽的同时，连续15分钟。这位年轻的幼鼠（〜P3-P12）后容易挤在一起，似乎进入深睡眠周期使它很容易刺激所有的幼崽一次。随着年龄的幼崽，他们变得​​更加活跃，一些幼崽行走，并在会议期间调查。实验者应连续移动的小狗闲逛进组，以确保每一个小狗获得相等的刺激。
11. 一旦15分钟会话结束后，运送幼仔回到饲养室和母亲回到笼子里。
12. 重复此过程每天三次对19天触觉刺激的。在P21的最后触觉刺激会后，幼崽应该从他们的母亲断奶。幼崽然后应安置在笼子里与同性的5或6其他断奶的动物。
13. 如果大鼠进行任何额外的测试，他们应保留不做不安，在正常光线:暗周期与获取食物和水libitm（除了定期笼清洗和处理），直到他们达到大约100天的年龄。如果发生其他实验操作，应该这样对待动物试验或按照这些实验室的协议。

2。牺牲和高尔基 - 考克斯染色

1. 通过IP注射在约P100，管理的戊巴比妥钠过量的大鼠和用大约100ml的0.9％盐水灌注心内。
2. 提取时，大脑灌注完成。从头骨中取出大脑，切断视神经下方与努力保持小脑完好，研究人员可以选择保留或删除嗅球。把提取的大脑中的不透明的Nalgene瓶用20ml高尔基考克斯溶液^14。
3. 保持大脑中高尔基体考克斯解决方案14天。 14天后，更换高尔基-C牛溶液用30％的蔗糖溶液。保持大脑在2-5天的蔗糖溶液切片之前。

注意:如果大脑不能内转移到蔗糖溶液后14天内切片，研究人员需要用30％蔗糖的新股票取代蔗糖。研究者可与染色无不良影响取代蔗糖每两周为4个月。

4. 为了部分大脑，大脑应吸干并固定在切片阶段cyanocacrylic胶水。为了防止撕裂或不均匀切片，研究人员必须保持谨慎，确保整个大脑被牢固地固定在舞台。
5. 在vibratome水库必须充满6％蔗糖溶液，以覆盖该切片刀片的水平。设置vibratome参数的速度和幅度为5，（在两个尺度上的中点）。切片脑入200微米的部分，然后将切片用2％凝胶化的微范围滑动。请务必切片的过程中，保持部分湿润。
6. 当所有感兴趣的部分已收集，通过施加压力与湿润吸水纸的幻灯片按路段上的幻灯片。保存幻灯片在湿度室的幻灯片机架，直到他们准备被染色。他们应该留在潮湿的房间至少12小时，但不超过4天以上。幻灯片需要是潮湿和不应该被允许干燥。
7. 在开始染色过程前准备染色团。标签12玻璃染色皿（10.7×8.5×6.8厘米）和过程以下面的方式:
   1. 蒸馏水 - 1分钟
   2. 氢氧化铵 - 30分钟（在黑暗中）
   3. 蒸馏水 - 1分钟
   4. 柯达修复的电影 - 30分钟（在黑暗中）
   5. 蒸馏水 - 1分钟
   6. 50％酒精 - 1分钟
   7. 70％酒精 - 1分钟
   8. 95％酒精 - 1分钟
   9. 100％Alcoh醇 - 5分钟
   10. 100％酒精 - 5分钟
   11. 溶液（1/3氯仿，1/3 HemoDe，1/3 100％酒精） - 15分钟
   12. HemoDe - 15分钟

*二甲苯可用于替换HemoDe的。为了确保一致的染色质量，新的解决办法应该用于处理每张幻灯片机架。

8. 继上次15分钟再现的HemoDe，盖玻片Permount的幻灯片。
9. 检查用显微镜才允许的幻灯片风干。

结果

当这个染色过程一直遵循适当，会产生枝晶的一致和统一的染色和刺。参见图1中高尔基体考克斯神经元染色的表示。此过程会产生染色相媲美的新开发的体外方法和可允许的树突状字段是不间断以下组织包埋的可视化。在vibratome基于技术高尔基考克斯染色已经发现产生终末分支与锥体神经元更广泛的染色，比用染色或火棉胶包埋和低温恒温器剖组织^，15。此外，由于染色的这个方法浸渗到整个大脑，各段可立即或在将来分析。作为形态学改变的位置是生成原始假设当它并不总是明显的，这个过程允许额外的大脑区域的探索一个D可预防处置的组织，可能在未来会很有用的。

这种染色方法可用于任何老年大鼠大脑（P0-老年）的可靠的染色。然而，染色年轻人的头脑（<1克）时，大脑应该只停留在高尔基体考克斯解决方案6天，而不是推荐用于成人的大脑14天，所有其他程序维持不变。可能在这个高尔基 - 考克斯染色过程中遇到的主要困难是无法产生的中央脑区，包括丘脑的高品质的染色。作为整个大脑中浸渍的同时，中央区域可以不接受染色的理想浓度。尽管这一发现，高尔基 - 考克斯技术生产皮质下区域如海马和纹状体的特殊染色。该过程的最后一个限制来源于不完全清除血液从大脑中灌注过程。血液可能在脑组织产生伪影这使得它很难拍摄和跟踪的神经元。

高尔基 - 考克斯染色技术提供树突形态学和解剖学是为旨在探讨在神经元水平变化的研究范围广泛有用的可靠措施。当在前额皮层以下的触觉刺激在早期产后检查的神经元结构，高尔基 - 考克斯染色显示急剧增加树突的复杂性。与早期触觉刺激的解剖结构变化可以直观地通过比较锥体神经元棘密度从对照大鼠从鼠是经历触觉刺激锥体神经元（参见图1）来证明。此外，参数如树突分支，树突长度和脊柱密度，可以计算和统计分析，以产生可以在动物相比连续数据。为了产生可靠的结果，分析应进行对时每个治疗组三只动物，每个半球大约五神经元的最小值应在分析中随机选取每个大脑区域。 图2显示了树突的复杂性所收到的触觉刺激和动物，没有动物（刺/枝晶微米×微米） 。同时在心尖和基底从内侧前额叶皮质（CG3）分析了神经元的字段，触觉的刺激导致的神经细胞增殖的参数。

图1。高尔基-考克斯A.代表的照片在开发过程中收到的触觉刺激大鼠染色锥体神经元从区域CG3的第三层。B.代表放大在CG3的基底领域的终端树突树突棘（1,000倍）的照片;左侧较浅的图像是对照组的老鼠并在里较深的图像GHT是谁收到触觉刺激老鼠。

图2。的平均顶端和基底树突复杂性（棘/微米×微米），用于从该接收的任一触觉刺激在开发期间或没有（* P <0.01）成年大鼠的CG3区域神经细胞说明性表示。

讨论

由于发育中的大脑的可塑性明显，但重要的是，涉及早期经历的实验步骤进行彻底检讨，并尝试都是为了控制所有中介变项。出于这个原因，一个横垫料设计的触觉刺激过程期间使用，以确保幼仔被接收在发展的所有其他域类似的经历。此外，它也是重要的，从多个窝幼仔多个被选择用于分析，以避免影响来自于单一小狗​​或垫料的偏压导致的可能性。

触觉刺激被认为是模仿天然存在的母体行为，舔和修饰，这被认为是给子代发育有利。虽然之前的研究强调生命的第一周（P0-P7）是为舔和梳理¹⁶的关键时期，变革的庞大规模确定以下18天TA的ctile刺激可能意味着，虽然敏感时期存在的，较长的曝光优越。同样重要的是要注意，接受触觉刺激在这个实验范式的幼仔也经历舔和修饰由他们的母亲，因此触觉刺激是除了正常的刺激由母亲管理。最后，我们还必须认识到的区域依赖性变化。虽然在开发过程中的触觉刺激前额叶皮质树突增加的复杂性，这并不能保证这种性质的结构性变化将体现在所有大脑区域。这可能是在其他脑区如顶叶皮层神经元形态，会在一个截然不同的方式，以同样的经历作出回应。然而，由于触觉刺激程序是容易施用并不会带来任何危险的后代或水坝，它具有以作为许多研究，旨在改善发展的有价值的工具的潜在人的结果。

相对于脑组织的高尔基体考克斯染色，是对神经元细胞的成功的可视化的关键步骤如下:1）必须有大脑用生理盐水溶液充分灌注。脑组织导致血管文物，使其难以实际上是通过血管的迷宫可视化的神经元细胞，同时也复杂拍摄染色神经元的能力，不当或不充分灌注。 2）灌注的大脑应该存储在高尔基体考克斯溶液并在黑暗中的蔗糖溶液。存储所述的脑组织在黑暗中减少了组织的背景染色，再增加成功可视质量的神经元细胞的机会。 3）脑组织被存储在以下第14天存储在高尔基体考克斯溶液的蔗糖溶液。当组织浸没在2-5天的30％蔗糖溶液，大脑更柔韧，防止粉碎和撕裂部分的时切割。它以防止残留在增加的时间段的蔗糖溶液的脑组织（除蔗糖溶液连续用新鲜溶液替换）因为长期贮存中蔗糖降低了染色质是重要的。 4）最后，一旦幻灯片已染色和盖下滑，就应该给他们足够的时间可视化前的干燥用显微镜。如果幻灯片是不允许的充分风干，该组织可能会变暗，降低皮层神经元的成功可视化。

在心理功能和行为反应发生在回应经验稳定的变化被认为是由神经元形态和突触连接¹⁷的重组提供便利。由于这些结构变化的经验依赖性可塑性提供了一个可衡量的资源，使用可靠染色过程中是非常重要的。这vibratome基于高尔基 - 考克斯染色过程提供可靠的污点ING精分支和树突棘，可能不会很明显与其它协议如火棉胶嵌入的。在高尔基体考克斯程序的独特性源于其容量仅染色的神经元元件（1-10％），其允许单个神经元的跟踪长距离的一小部分。尽管神经元的只有一小部分被浸渍有污垢，所呈现的可见细胞，维持所有的功能，包括细胞体，树突，树突棘和轴突。此外，当染色过程是否正确执行，染色细胞中脱颖而出清楚而明确地对一个透明的背景，因为其他的皮层结构仍然未染色和透明。由于认识到在向外运作持续变化，必须进行相关的神经系统的可塑性， 即神经元来修改它们的结构和连接能力，高尔基-考克斯染色过程为研究人员提供一个可靠的技术来可视化和量化这种可塑性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重铬酸钾	Fisher	P188
氯化汞	Fisher	M1561
铬酸钾	Fisher	P220
氢氧化铵	Fisher	A669-500
柯达快速修复	Vistek	柯达 146 4016
乙醇-95 &无水	商业醇类	无猫编号	所有其他 Et-OH 都是稀释液
Swiffers- 柔软的羽毛状除尘器	Safeway		可以在大多数杂货店找到
蔗糖	Sigma-Aldrich	S-9378
HemoDe	电子显微镜科学	23410
Permount	Fisher	Sp15
载玻片	VWR	160004-365
盖玻片	VWR	062011-9