快速微离子导入谷氨酸和GABA：研究突触整合的有用工具

摘要

本文中，我们介绍了一种快速微离子电渗技术，用于以高空间和时间精度研究突触后信号的整合。

摘要

神经科学的一个基本研究兴趣是理解兴奋性和抑制性输入如何在结构极为复杂的树突树上进行整合，最终导致神经元在轴突处产生动作电位输出。目前，特定突触输入的各种空间和时间参数对神经元输出的影响正在被深入研究，例如 树突输入的随距离衰减效应、空间上分离的输入之间的位置依赖性相互作用、GABA能抑制对兴奋性整合的影响、线性与非线性整合模式，以及更多其他机制。

通过快速微离子电泳递送谷氨酸和GABA，可以精确研究谷氨酸能兴奋与GABA能抑制在空间和时间上的整合特性。关键技术要求是使用可触发的荧光灯、发光二极管（LED）或双光子扫描显微镜，以在不造成组织显著光损伤的情况下观察树突分支。此外，拥有一个能够对高阻抗微电极进行快速电容补偿的微离子电泳放大器也极为重要。另一个关键点是在实验过程中微电极不得非特异性地释放任何神经递质。

一旦建立，该技术将提供可靠且可重复的信号，具有高神经递质特异性和位置特异性。与谷氨酸和GABA解笼技术相比，快速离子电渗法允许同时使用这两种递质，且可在远离彼此的位置施加，不受视野范围的限制。与轴突的局灶性电刺激相比，该方法也具有优势：通过微离子电渗法，输入位点的位置是明确已知的，并且可以确保仅释放感兴趣的神经递质。然而需要注意的是，微离子电渗法仅激活突触后成分，无法解析神经递质释放的突触前特性。本文中，我们演示如何在脑片实验中建立微离子电渗法。

引言

中枢神经系统中的神经元在其细长且分支状的树突过程中接收多种突触输入¹。在这些树突过程中，大多数兴奋性输入由谷氨酸能突触介导。这些突触可以以空间分散的方式被激活，导致兴奋性突触后电位（EPSP）的线性整合。当突触在树突上同时且在空间上邻近地被激活时，这些兴奋性输入可发生超线性整合，并产生树突尖峰^2-5。

此外，兴奋性输入的整合依赖于输入在树突树上的位置。由于电缆过滤效应，到达远端树突簇区域的信号比近端输入衰减得更为显著⁶。在海马体中，远端树突簇接收的输入来自与近端树突不同的脑区⁷。因此，一个引人关注的问题是：不同树突区室如何处理突触输入，以及树突整合是否以不同方式调控这些分层输入对神经元放电的影响。

不仅树突的功能特性、形态特征以及输入的位置和聚集方式会影响兴奋性输入的树突整合，来自GABA能末梢的额外抑制性输入也在很大程度上决定了谷氨酸能突触的效能^8,9。这些突触整合的不同方面可通过神经递质微离子电泳技术进行理想研究，该技术可将不同神经递质精确施加于树突特定区域。本文展示了如何成功建立谷氨酸和GABA的微离子电泳，以研究神经元中的信号整合。

在此应用中，使用尖端精细且电阻较高的移液管，内充高浓度的神经递质溶液。这些移液管被放置在细胞外膜附近，即神经递质受体所....

方案

1. 系统要求

1. 显微镜系统：良好的树突可视化至关重要。如有条件，应使用双光子激光扫描显微镜系统。在本实验中，我们使用了德国比勒费尔德LaVision Biotec公司的TRIM Scope II系统，或美国威斯康星州麦迪逊Prairie Technologies公司的Ultima IV系统，配备钛宝石超快脉冲激光器（Chameleon Ultra II，Coherent）和高数值孔径物镜（60倍，0.9 NA，Olympus），用于观察通过膜片钳电极将荧光染料灌注至神经元后标记的树突。尽管双光子扫描被认为光损伤较轻，但仍应尽可能降低激光功率（组织处低于8 mW）和驻留时间（低于1 μsec）。
2. 另一种可能性是将宽场荧光光源（LED 或荧光灯）与图像采集同步触发，以尽可能缩短曝光时间。我们在配备 Dodt 反差红外照明装置（TILLPhotonics，Gräfelfing，德国）的蔡司 Axioskop 2 FS 直立显微镜上，使用了带有集成光源的单色器（TILLPhotonics，Gräfelfing，德国）。在我们的实验中，曝光时间通常为 10 毫秒，最长不超过 30 毫秒。
3. 使用快速微离子电渗放大器， 例如 一个双通道微电泳系统MVCS-C-02（npi electronic，Tamm，德国），具备快速电容补偿功能。微电泳微电极尖端精细，电阻为25–100 MΩ（关键取决于尖端尺寸和移液管形状），只有在电泳放大器的电容补偿被最优调节时，才能实现快....

结果

确定离子电泳空间扩散范围的一种简单方法是，在保持谷氨酸释放量恒定的同时，逐步将离子电泳移液管从树突回撤。我们发现，微离子电泳刺激的空间范围直径约为 12 μm（图 1 显示半径）。离子电泳在组织中的可应用深度取决于移液管的刚性。然而，本实验所用的脑片实验所需离子电泳移液管（图 2）并不限制穿刺深度；真正限制因素是光学系统以及脑片深层分辨率的下降。为获得高质量的记录，关键在于移液管中不能有递质泄漏。对于谷氨酸而言，若在移液管尖端接近树突时出现突然的去极化，或记录基线突然变得不稳定，则可判断存在泄漏（图 5）。在建立稳定记录后，该技术可在树突树的任意位置诱发特定幅度的兴奋性突触后电位（EPSP）、树突尖峰或动作电位（图 6）。通过快速微离子电泳施加谷氨酸，可研究 EPSP 的特性、其传播与叠加效应，甚至可在不同且相距较远的位置同时进行研究（图 7）。可通过将另一根离子电泳移液管填充高浓度 GABA 溶液（见：方案第 2 节）并施加正向喷射电流，单独或同时诱发 GABA 能事.......

讨论

在此，我们介绍如何应用快速微离子电泳技术递送神经递质，以研究树突上的突触整合。该技术已成功用于探究不同脑区中的谷氨酸能和GABA能突触传递 体外 和 体内^9,20-22微离子电渗法已应用超过60年，但在早期主要仅用于在较慢或中等时间尺度上局部施加神经递质和药物²³ 或用于向细胞内显微注射物质²⁴.

自从引入配备了针对高阻抗电极的快速电容补偿功能的放大器以来，微离子电渗技术成为研究树突整合的一种特别有用的工具^10,11。由于这一改进，现已能够施加短暂的矩形离子电渗电流，从而产生更真实地模拟突触事件时间进程的突触后反应^10,25。

在建立微离子电渗技术时，需要应对哪些技术要求和难点？需要使用一种离子电渗放大器，能够补偿精细离子电渗移液管的高电容。如果需要在使用高阻抗微电极的同时实现高速操作，则正确调节电容补偿至关重要。未补偿的杂散电容会由仪器提供的离子电渗电流充电，从而减慢药物施加速度。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
			<强>材料
双光子激光扫描显微镜（TRIM Scope II）和Ultima IV，Prairie Technologies，美国威斯康星州麦迪逊	LaVision Biotec，比勒费尔德，德国
双光子激光扫描显微镜 Ultima IV	美国威斯康星州麦迪逊草原科技公司
钛宝石超快脉冲激光器	Chameleon Ultra II，Coherent
60倍物镜，数值孔径0.9	Olympus
蔡司 Axioskop 2 FS 正置显微镜	TILLPhotonics, Grä费尔芬，德国
单色仪	TILLPhotonics，Grä费尔芬，德国
微离子电渗系统 MVCS-02	NPI Electronics，德国塔姆
Sutter拉针仪P-97	Sutter Instrument Company，诺瓦托，加利福尼亚州
玻璃细丝（150 GB F 8P）	科学产品公司，德国霍夫海姆
			<强>试剂
Alexa Fluor 488 肼	Molecular Probes life technologies	A-10436
Alexa Fluor 594	分子探针生命科技	A-10438
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
KCl	Sigma Aldrich	P9333
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S8282
NaHCO₃3	Sigma Aldrich	S6297
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903
CaCl2	Sigma Aldrich	C5080
MgCl2	Sigma Aldrich	M2670
葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528
K-葡萄糖酸盐	Sigma Aldrich	G4500
HEPES-酸	Sigma Aldrich	H4034
磷酸肌酸	Sigma Aldrich	P7936
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
谷氨酸	Sigma Aldrich	G8415
GABA	Sigma Aldrich	A5835
NaOH	默克	1.09137.1000
HCl	默克	1.09108.1000