斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

摘要

斑马鱼脊髓中的增殖、模式形成、分化和轴突导向等发育过程可被便捷地建模。本文介绍一种优化斑马鱼胚胎固定的方法，以实现对这些事件的清晰可视化。

摘要

斑马鱼脊髓是神经系统研究的有效实验模型，原因如下：首先，可利用遗传学、转基因及基因敲低技术来研究神经系统发育背后的分子机制；其次，大量发育同步的胚胎可提供充足的实验样本量；第三，斑马鱼胚胎具有良好的光学透明性，使研究人员能够清晰观察前体细胞、胶质细胞和神经元群体。尽管斑马鱼胚胎本身透明，但标本厚度可能阻碍显微观察的效果。其原因之一在于脊髓与覆盖其上的体节组织同步发育；另一个原因是早期神经发生阶段仍存在较大的卵黄球。本文中，我们展示了对固定胚胎进行显微解剖并去除卵黄的操作，该方法可在保留周围体节组织的同时实现良好的显微观察。我们还展示了斑马鱼胚胎的半永久性封片技术，该方法可保持组织的三维结构，从而便于在背腹轴和前后轴方向上观察神经发育过程。

引言

斑马鱼脊髓的观察受到多种因素的限制。由于其上方体节 较厚且脊髓位于体内深层，实现高细胞分辨率需要较长的工作距离。在神经发生早期仍存在的卵黄球会进一步增加所需的工作距离，且容易因盖玻片施加的压力而受损。此外，受损卵黄产生的碎片会阻碍组织的清晰观察。尽管可以在背腹（DV）轴向上进行横切观察，但难以同时在前后（AP）轴向上实现清晰成像¹。

为了克服这些障碍，需将胚胎解剖并固定在载玻片上。该操作具有多项优势：首先，斑马鱼胚胎可自然侧卧，使身体侧面向上，便于观察前后轴（AP轴）；其次，去除卵黄球可缩短工作距离，并减少杂质干扰；第三，该固定方法适用于荧光显微镜和明场显微镜观察；第四，固定后的胚胎在4 °C条件下可稳定保存数月，便于长期观察样本；最后，胚胎发育呈头尾梯度，即前部体节比后部体节更成熟。为确保不同胚胎间比较的是发育阶段匹配的脊髓半节段，需利用其上方的体节组织作为定位参考。例如，从后端数起的第10个体节所覆盖的即为第10个脊髓半节段，这在发育阶段匹配的胚胎中具有等同的发育状态。这种对完整胚胎的固定方法有助于清晰识别体节结构。

我们利用遗传学和基因敲低技术研究发育中脊髓内轴突导向的机制。特别是，我们已确定robo2、robo3和dcc基因对于联合初级上行（CoPA）轴突的路径寻找至关重要。通过使用此处所述的封片方法，我们能够观察轴突的腹侧生长、中线穿越、联合部宽度以及背侧和前侧生长^2,3。该封片方法也可应用于脊髓的背腹（DV）或前后（AP）模式形成研究。我们已利用此方法确定了Wnt信号通路下游效应分子在脊髓背腹模式形成中的不同作用。通过该封片技术，我们能够在单细胞水平上解析背腹标志物的表达，并确定因Wnt信号接收改变所导致的细微模式偏移^4,5。该封片方法还可通过抗磷酸化组蛋白3或BrdU标记来计算有丝分裂指数，从而分析前体细胞的增殖与分化⁵。

方案

1. 胚胎封片（在完成所选的可视化技术后，如免疫细胞化学、原位 杂交 、 等）

1. 将胚胎置于一个盛有所选缓冲液的 35 mm 培养皿中（图 1A）。缓冲液的选择取决于标记方法，通常基于 PBS 的缓冲液是合适的。
2. 在解剖显微镜下，使用镊子，用一对镊子固定头部，同时用另一对镊子将卵黄拉开（图 1B）。或者，可使用固定在昆虫针夹持器中的昆虫针轻轻拉开卵黄。
3. 使用胚胎拨针（将直径为 0.41 mm 的钓鱼线粘附在毛细管或巴斯德移液管上制成），将胚胎移至培养皿中卵黄碎片较少的区域（图 1C-D）。
4. 使用玻璃巴斯德移液管，用尽可能少的液体吸取胚胎，并轻柔地将其转移至载玻片上（图 1E）。
5. 用实验室擦拭纸轻轻吸除多余液体，避免接触胚胎。
6. 向胚胎上加入一滴封片介质。对于荧光标记，可使用所选的抗荧光淬灭试剂；对于比色信号，可使用 70% 甘油作为封片介质。
7. 使用胚胎拨针，将胚胎以侧卧姿势排列成行（图 1F）。
8. 在盖玻片的每个角落各加一小点（"dab"）凡士林或高真空润滑脂（图 1G），以防止胚胎因过度压紧而受损。
9. 将盖玻片（涂有凡士林的一面朝下）覆盖在胚胎上方（图 1H）。
10. 轻轻按压盖玻片的每个角落，直至封片介质（70% 甘油或抗荧光淬灭封片试剂）接触到盖玻片（图 1H）。
11. 如有必要，使用 20–200 µL 移液器在盖玻片边缘附近添加更多封片介质，液体会自动渗入下方。
12. 使用实验室擦拭纸彻底清洁盖玻片周围区域。注意不要对盖玻片施加压力，以免损伤胚胎。该区域必须保持干燥，且不得残留凡士林或封片介质。
13. 用指甲油密封盖玻片边缘（图 1I）。

结果

在阐明细胞模式形成、分化以及轴突导向等各类发育事件的机制时，能够在组织环境中可视化细胞至关重要。背腹侧模式形成缺陷通常表现为 pax、nkx 或 dbx 基因家族转录因子表达区域向腹侧或背侧发生位移⁴。有时，这些变化较为细微，仅涉及数个细胞直径的范围⁴。横断面分析可用于此类研究。然而，信号较弱的试剂或未垂直于前后轴（AP轴）的切片可能限制结果的解读。此外，横断面分析难以判断变化是否在前后轴方向上持续存在，且依赖于冷冻切片机的可用性。这一局限性可通过脊髓的侧视观察加以克服。如图2B所示，在受精后24小时（hpf），nkx6.1 mRNA 主要分布于脊髓腹侧约一半的区域，位于前体细胞区。由于位于脊髓内侧的底板存在，前体细胞可与有丝分裂后的细胞区分开来。通过微分干涉差（DIC）光学观察，单个细胞清晰可辨，表达与非表达细胞之间具有明确的边界。

前体细胞退出细胞周期伴随着基因表达的变化。例如，所有终末分裂后的神经元均表达HuC/D，可通过免疫细胞化学方法检测到^1,5。针对islet、gata和vsx基因家族的mRNA探针可标记脊髓每个半节段内位置和数量恒定的特定终末分裂后神经元⁶。此外，轴突导向受体（如robo家族成员）在特定终末分裂后神经元亚群中呈限制性表达（图2C）^2,7,8。通过将胚胎侧向固定，可准确计数终末分裂后的神经元。类似地，持续分裂的前体细胞可通过抗磷酸化组蛋白3免疫细胞化学染色以及BrdU标记进行定量分析。此外，细胞死亡情况可通过TUNEL标记进行评估^4-6。

在24 hpf时，可通过多种方法观察到以下终末分裂后神经元的轴突，并可在单细胞水平上加以区分：背侧外侧上行神经元（DoLA）、联合初级上行神经元（CoPA）、联合次级上行神经元（CoSA）、腹侧纵行下行神经元（VeLD）、Kolmer-Agdur神经元（KA）、联合分叉/纵行神经元（CoB/L）、环行上行神经元（CiA）、环行下行神经元（CiD）和单极联合下行神经元（UCoD）、Rohon-Beard神经元（R-B）以及运动神经元（M）⁹。这些神经元的轴突向背侧、腹侧、头端和尾端方向延伸，发生分支，穿越中线，并从脊髓的背侧和腹侧离开。当与共聚焦激光扫描显微镜结合使用时，通过免疫细胞化学染色以及GFP等基因编码的荧光蛋白标记，在侧向固定的胚胎中可清晰观察到这些多样的细胞行为²。在图2D中，采用znp-1免疫细胞化学染色标记发育中的运动神经元。运动神经元从脊髓腹侧发出，支配周围正在发育的肌肉组织。

图1. 斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片 (A) 经免疫荧光处理后， 原位 杂交 等等。，将胚胎置于盛有PBT（含0.5% Triton X-100的PBS）或PTw（含0.1% Tween-20的PBS）的35 mm培养皿中。可见卵黄球（YB）。B用镊子固定胚胎头部，随后小心解剖以去除卵黄。C使用胚胎拨针（将钓鱼线粘附在巴斯德吸管上制成）分离胚胎和卵黄碎片D）。用移液器将清洗后的胚胎转移至显微镜载玻片上（E）并进行比对（F). (G在盖玻片的四个角上涂抹凡士林。H将盖玻片轻轻置于封片剂中的胚胎上方。I) 指甲油用于密封盖玻片的边缘。 单击此处以查看大图.

图2. 侧向固定斑马鱼胚胎中基因表达模式与轴突导向的分析。（A）24小时受精后（hpf）斑马鱼胚胎的示意图。在B-D中，显示了卵黄囊延伸部上方约四个半体节的区域（方框所示区域）。（B）nkx6.1在脊髓腹侧表达，包括底板（FP）。（C）robo3在终末分裂后神经元（PMN）中表达。在此更偏外侧的焦平面上，底板和前体区不明显。在B、C中，脊髓左侧以括号标示边界。（D）使用共聚焦显微镜观察znp-1免疫荧光信号，该信号标记从脊髓腹侧伸出的运动轴突。所有图像中，头端朝左，背侧朝上。使用40倍长工作距离水浸物镜（数值孔径0.8）（3.3 mm）。点击此处查看高分辨率图像。

讨论

固定斑马鱼胚胎的侧向安装有助于观察脊髓发育过程。通过去除卵黄球，可缩短实现优异显微成像所需的工作距离。本研究的代表性结果仅限于受精后24小时（24 hpf）阶段，但该技术最早可在18 hpf时使用，尽管更早期的胚胎由于体积较小且组织脆弱，解剖难度更大。此技术同样适用于超过24 hpf的胚胎。借助斑马鱼胚胎良好的光学通透性，以及其适用于正向遗传筛选、反向遗传学和转基因研究的优势，多种发育过程可被深入探究。这包括利用BrdU和抗磷酸化组蛋白3等标记物检测神经前体细胞的有丝分裂指数^4-6 ，以及通过分析pax、nkx、dbx和olig基因家族中神经元与胶质前体细胞标记物的表达来研究模式形成^1,4-6。可用于报告胶质细胞和神经元命运决定的试剂（如胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和HuC/D）^1,4,5,10 也可应用于此。神经元亚型的分化可通过检测islet、vsx、engrailed和gata基因的表达进行分析^1,4-6。最后，可通过抗乙酰化微管蛋白、3A10和znp-1等抗体实现对轴突导向的分析^2,11,12。尽管其他脊椎动物模型系统（如小鼠和鸡）也被用于研究脊髓发育，但只有斑马鱼能够在完整胚胎中同时观察所有发育轴向。

该方法的明显局限在于胚胎已被固定，因此无法进行活体成像。事实上，卵黄的移除或损伤会导致胚胎迅速死亡，因此无法通过该技术缩短活体胚胎的工作距离。然而，在活体胚胎中实现脊髓的高倍成像是可行的。为了在活体成像过程中保护卵黄，可将胚胎置于凹面载玻片中，从而在样本与盖玻片之间提供更大的空间。或者，也可使用若干 22 mm × 22 mm 盖玻片可粘贴在 3 英寸 × 1 英寸载玻片的任意一侧 1英寸 显微镜载玻片。盖玻片用作 "桥接" 对于上方的盖玻片。若胚胎超过18小时受精龄（hpf），需使用三卡因（tricaine）麻醉胚胎以防止其移动。在观察24 hpf去卵黄胚胎时，需要0.288 mm的工作距离；而在观察嵌入琼脂糖中、卵黄完整的活体胚胎时，使用工作距离为3.3 mm的显微镜物镜即可。 Alternatively，可采用血浆凝块固定技术来观察源自去卵黄胚胎的外植体培养物。¹³可以利用基因编码的荧光蛋白（如GFP、mCherry或光转化染料Kaede等）观察多种细胞群体。此外，该方法还可用于观察嵌合胚胎中荧光标记的细胞。¹⁴.

一种可长期稳定保持数月的固定技术，是发育生物学和细胞生物学研究者的关键工具。该方法简便且可重复，便于不同实验组之间的轻松比较。此外，将胚胎以行列形式排列，可方便地在后续分析中识别特定胚胎。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养皿 35 mm × 10 mm	VWR	25373-041
杜蒙特镊子 #3	费舍尔科学公司	NC9839169
盖玻片	费舍尔科学公司	12-541-B22X22-1.5
载玻片	费舍尔科学公司	12-550-343
SlowFade Gold	费舍尔科学公司	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
凡士林	任意杂货店
接种环架	VWR	80094-482
昆虫针	精细科学工具公司	26002-10
镀镍针座	精细科学工具公司	26016-12
奥林巴斯体视显微镜	奥林巴斯	SZ61