需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

脂肪组织免疫细胞的分离

36.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50707

⸱

2013年5月22日

 ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University School of Medicine

本文内容

摘要

脂肪组织（AT）是免疫细胞活化和相互作用的重要场所。几乎所有类型的免疫系统细胞都存在于脂肪组织中，且其比例会因肥胖而发生改变。对脂肪组织中免疫细胞群体进行准确的分离、定量和表征，对于理解其在免疫代谢性疾病中的作用至关重要。

摘要

在肥胖的啮齿类动物和人类脂肪组织（AT）中发现巨噬细胞浸润增加，促使人们对免疫细胞在局部和全身胰岛素抵抗中的作用产生了更浓厚的兴趣。目前，在代谢免疫学实验室中，分离和定量分析瘦型与肥胖型脂肪组织中不同免疫细胞群体已成为一种常用技术；然而，在基质血管细胞的分离以及流式细胞术分析过程中，必须格外谨慎，以确保所获得的数据可靠且可解释。在本视频中，我们演示了如何切碎、消化并分离富含免疫细胞的基质血管组分。随后，我们展示了如何使用抗体标记巨噬细胞和T淋巴细胞，并在流式细胞术实验中对其进行正确的设门分析。文中提供了来自低脂饮食瘦鼠和高脂饮食肥胖小鼠的代表性流式细胞术图谱。该分析的一个关键环节是使用不会在脂肪组织巨噬细胞具有天然自发荧光的通道中发光的抗体，同时必须设置适当的补偿对照。

引言

传统上，脂肪组织（AT）被视为一种惰性的脂质储存器官，会随着能量平衡的变化而扩张或收缩。如今我们认识到，AT 是一种动态的内分泌器官，能够主动分泌多种激素，直接影响摄食行为和全身葡萄糖稳态。此外，在过去十年中，人们日益认识到存在于脂肪组织基质血管组分（SVF）中的多种免疫细胞群体，以及它们对脂肪组织稳态的重要贡献。

利用胶原酶消化结合差速离心法分离脂肪组织脂肪细胞和基质血管组分（SVF）的方法最早由Rodbell于1964年描述1。由于胶原酶II能够维持脂肪细胞上的胰岛素受体活性，因此最常用于脂肪细胞与SVF的分离1。早期，脂肪组织的酶法分馏主要用于研究脂肪细胞代谢以及前脂肪细胞的分离。近年来，该技术结合流式细胞仪的广泛应用以及 commercially available 荧光素标记抗体数量的持续增加，促进了对脂肪组织中免疫细胞的表征研究。

尽管先前已有研究描述了炎症脂肪组织（AT）中存在免疫细胞的现象2，但Weisberg et al. 和Xu et al. 于2003年发表的两篇开创性论文首次记录了肥胖状态下脂肪组织巨噬细胞（ATMs）的积聚。这些巨噬细胞可分泌促炎性细胞因子，并与脂肪组织特异性和全身性胰岛素抵抗相关3,4。这些发现为一个新兴研究领域——“免疫代谢”（immunometabolism）5——奠定了基础，并推动了后续一系列研究，揭示了多种免疫细胞群体在肥胖相关胰岛素抵抗发展中的作用，包括树突状细胞6、肥大细胞7、T细胞8-10、B细胞11、NKT细胞12、嗜酸性粒细胞13以及中性粒细胞14,15。

本文旨在详细描述利用胶原酶消化法分离脂肪组织基质血管组分（AT SVF）细胞，并通过流式细胞术对脂肪组织巨噬细胞（ATMs）和脂肪组织T细胞（AT T cells）进行表征的技术流程。该方案已针对小鼠脂肪组织进行优化；然而，读者也可参考一篇详尽阐述该技术在人脂肪组织中优化应用的优秀文献以获益。 16本文的目标读者包括在小鼠脂肪组织（AT）操作和流式细胞术方面经验有限的研究人员。文中提出了若干实用建议，以在细胞得率与活性、时间及资源之间实现平衡，同时介绍了用于表征AT免疫细胞群体的最佳流式细胞术对照设置。除本实验方案外，还建议读者参考近期发表的相关文献 乔维 Basu 撰写的论文 等 关于流式细胞术某些技术方面的出色讨论，包括适当的对照设置和补偿调节 17.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 试剂与耗材

在开始本实验方案之前，准备以下试剂：

  1. 70% 乙醇
  2. 1X PBS
  3. 含 0.5% BSA 的 1X DPBS（不含 Ca 和 Mg）
  4. FACS 缓冲液：1X DPBS（不含 Ca 和 Mg）、2 mM EDTA 和 1% FCS
  5. ACK 缓冲液：水中含 150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3 和 0.1 mM Na2EDTA

2. 脂肪组织的采集与制备

  1. 根据各机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序对小鼠实施安乐死。
  2. 用70%乙醇充分浸湿毛发。
  3. 在剑突水平（胸骨下部）做切口，打开胸腔以暴露心脏，注意避免切断任何主要血管。

注意： 此时，尽量保持膈肌完整，并在右侧肋骨上切一个缺口，以使血液和灌注液能够从胸腔中流出。

  1. 剪开右心房，使血液和灌注液能够流出循环系统。

注意： 处理肥胖小鼠时，可能需要去除过多的心包脂肪组织，以方便接触心脏。

  1. 用镊子夹住心脏，从心尖处将针头轻轻插入左心室。用15 ml无菌PBS缓慢灌注小鼠。

注意：如果肺部开始充盈并扩张，请降低灌注速率。

  1. 打开腹腔，小心摘除附睾周围脂肪垫，注意避免损伤性腺组织。
  2. 将脂肪垫置于含有 2 ml 1X DPBS（不含 Mg 或 Ca）并添加 0.5% BSA 的冰上称重皿中，将脂肪组织切碎成细小碎片。

注意： 每个称量皿中的AT质量不得超过1.2 g。如果AT总量超过1.2 g，应将其平均分至两个称量皿中。

  1. 将脂肪组织（AT）样品置于冰上，并为每份AT样品配制3 ml胶原酶消化液，消化液成分为添加0.5% BSA、10 mM CaCl2和4 mg/ml II型胶原酶的1X DPBS溶液。

3. 胶原酶消化

  1. 将匀浆液倒入50 ml锥形管中，并用1 ml DPBS（0.5% BSA）和3 ml胶原酶II消化液冲洗称重皿，一并转移至锥形管。
  2. 将脂肪组织（AT）匀浆液置于37 °C旋转摇床中（200 rpm）孵育20分钟。
  3. 向锥形管中加入10 ml DPBS（0.5% BSA），并将管子置于冰上。
  4. 使用10 ml移液管反复吹打匀浆液，使细胞充分悬浮，然后将细胞悬液通过100 μm细胞筛滤入新的50 ml锥形管中。
  5. 在4 °C条件下，以500 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。
  6. 弃去上清液，将基质血管组分（SVF）细胞沉淀重悬于3 ml ACK缓冲液中，以裂解污染的红细胞。
  7. 加入12 ml FACS缓冲液，并在4 °C条件下以500 × g离心10分钟。
  8. 弃去上清液，将SVF细胞沉淀用FACS缓冲液重悬。

注意：根据细胞沉淀的大小来确定重悬所需的FACS缓冲液体积。如果细胞沉淀覆盖了50 ml锥形管底部，使用0.5–1 ml FACS缓冲液；否则，使用0.25–0.5 ml。

  1. 将样品置于冰上，并通过混合 40 μl FACS 缓冲液、50 μl 台盼蓝溶液（0.2%）和 10 μl 细胞悬液，为每个样品制备用于细胞计数的 1:10 稀释等分试样。
  2. 根据台盼蓝排斥法计数活细胞，并将细胞悬液稀释至终浓度为 5–10 × 106 个细胞/ml。

4. 细胞表面抗原染色

  1. 加入抗小鼠 CD16/CD32 抗体（Fc 封闭抗体），终浓度为 0.5–1 μg/106 个细胞，冰上孵育 10 分钟。
  2. 将样本（≥106 个细胞）转移至 12 × 75 mm 聚苯乙烯圆底试管中。若同时分析 ATM 细胞和 T 细胞，需分别准备独立的试管，并额外预留足够细胞以制备足够的试管，用于补偿调节及改良的荧光减一（FMO）对照。

注意： 以基于 F4/80 和 CD11b 定量 ATM 比例为例，需要准备以下补偿和 FMO 对照：

- 未染色（细胞）

- DAPI 或碘化丙啶（PI）单染（细胞；在步骤 5.1 之前不要加入活性染料）

- F4/80 APC 单染（细胞或补偿微珠）

- CD11b FITC 单染（细胞或补偿微珠）

- FMO 1（细胞）：大鼠 IgG2a κ 同型对照 APC + CD11b FITC + 活性染料（在步骤 5.1 中加入）

- FMO 2（细胞）：F4/80 APC + 大鼠 IgG2b κ 同型对照 FITC + 活性染料（在步骤 5.1 中加入）

  1. 加入适当浓度的荧光素标记的一抗和/或同型对照（参见试剂与材料表）。
  2. 避光，4 °C 孵育 30 分钟。
  3. 加入 2 ml FACS 缓冲液，于 4 °C 以 500 × g 离心 5 分钟。
  4. 倾去上清液，将 SVF 细胞沉淀重悬于 2 ml FACS 缓冲液中。
  5. 于 4 °C 以 500 × g 离心细胞悬液 5 分钟，将 SVF 细胞沉淀重悬于 ≥400 μl FACS 缓冲液中。
  6. 将样品转移至配有 35 μm 细胞筛网管盖的 12 × 75 mm 聚苯乙烯圆底管中。
  7. 避光，于 4 °C 保存样品直至进行 FACS 分析。

注意：为获得最佳结果，应立即分析细胞；然而，使用本方案对在4 °C条件下于FACS缓冲液中保存1-2小时的标记细胞进行FACS分析也已成功实现。若需固定细胞以延长保存时间，可在FACS分析前将标记细胞在4 °C条件下用2%多聚甲醛固定24小时。抗体公司建议标记细胞可保存长达一周；但此条件在本实验流程中尚未经过验证。

5. FACS 分析

  1. 在进行流式细胞术分析之前，向样品及相应的对照组中加入活死细胞鉴别染料，以区分活细胞与死细胞。

注意：市面上有多种活力染料可供选择，但应根据所用荧光素标记抗体的激发/发射光谱特性，推荐选用 DAPI 或 PI。将 DAPI 和碘化丙啶以每样 0.2 mg/ml 的终浓度加入各样品中。

  1. 使用未染色的阴性对照样本（最好是从与实验样本相同组织中分离的细胞），调节侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC），使目标细胞群体处于量程范围内。

注意：在分析脂肪组织基质血管组分（SVF）细胞时，建议将侧向散射光（SSC）以对数尺度显示，而前向散射光（FSC）以线性尺度显示。在分析脂肪组织巨噬细胞（ATMs）时，使用对数尺度显示SSC尤为重要，因为这些细胞通常体积较大且具有高度颗粒性。

  1. 根据所分析细胞的类型绘制初步的光散射门，并调节光电倍增管（PMT）增益，使未染色细胞位于相应通道单参数直方图的最左侧（大约以102为中心）。

注意：由于自发荧光存在差异，建议分别分析淋巴细胞和巨噬细胞（或其他髓系细胞）。

  1. 使用单染对照或抗体捕获补偿微珠进行多色补偿。

注意：建议使用补偿微珠；但必须确保每种抗体的兼容性。例如，补偿微珠可能不会与兔抗体发生交叉反应，此时则需要使用分离的细胞来获得适当的单染对照。

  1. 根据改良的FMO对照设置实验门。
  2. 根据目标细胞群的丰度，设置流式细胞仪采集适当数量的事件，并记录实验数据。
  3. 导出FCS数据文件以进行离线分析。目前有多种可用于流式细胞术数据分析的软件程序。我们推荐使用Cytobank，这是一个基于网络的平台，研究人员可通过任何连接互联网的计算机存储和分析数据，并生成图表18。此外，Cytobank还支持将数据公开共享，或仅限合作者访问。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

采用胶原酶消化脂肪组织（AT）并结合差速离心法，从饲喂低脂（10% kcal 来自脂肪）或高脂（60% kcal 来自脂肪）饮食（分别为 LFD 和 HFD）16 周的雄性 C57BL/6J 小鼠附睾脂肪垫中分离基质血管组分（SVF）。随后使用荧光染料标记的特异性一抗对 SVF 细胞进行染色，通过流式细胞术（FACS）定量分析存活的脂肪组织巨噬细胞（ATMs）（图 1）和脂肪组织 T 细胞（AT T 细胞）（图 2）的比例。初始设门策略，包括光散射、双联体排除及活细胞门控，如 图 1A 和 图 2A 所示。需特别强调的是，图 2A 中的初始光散射门控范围仅限于淋巴细胞群体，以避免纳入自发荧光的髓系细胞。使用改良的荧光减一对照（FMO）设定实验门控的示例如 图 1B 所示。在该示例中，F4/80（左列）和 CD11b（右列）抗体分别被相应的同型对照抗体替代，以校正自发荧光...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

随着人们对免疫系统在肥胖代谢后果中作用的兴趣日益增加，流式细胞术被广泛用于表征脂肪组织（AT）中的免疫细胞。尽管具体实验方案会因实验室的经验和可用设备的不同而有所差异，关键步骤通常包括胶原酶消化、差速离心以及细胞表面抗原标记。本文旨在为在处理脂肪组织和/或进行流式细胞术方面经验有限的研究人员提供一种详细的AT基质血管组分（SVF）分离方案及实用操作指南。

与任何实验技术一样，存在多种可能对预期结果产生显著或不显著影响的变异方法。根据我们的经验，本文详述的方案在时间、资源、细胞得率和细胞活力之间实现了最高效的平衡。例如，我们发现，在胶原酶浓度相似的情况下，将胶原酶II消化时间延长至60分钟，对细胞得率的影响可忽略不计；因此，我们采用20分钟的消化时间以减少细胞暴露于胶原酶的时间。胶原酶II是脂肪组织消化中最常用的胶原酶。有关各种胶原酶及其主要用途的详细说明可在Sigma公司网站上找到。采用上述方案，分别从饲喂低脂（脂肪提供10%千卡热量）和高脂（脂肪提供60%千卡热量）饮食16周的小鼠中获得的典型细胞得率通常为每克脂肪组织（AT）2–3 × 106 和 4–5 ...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

我们无任何披露事项。

致谢

JSO 由美国国立卫生研究院 Ruth L. Kirschstein 国家研究服务奖（F32 DK091040）资助，AK 由美国糖尿病协会博士后奖学金（7-10-MI-05）资助，AHH 由美国心脏协会资深研究者奖（12EIA8270000）资助。流式细胞术实验在范德堡医学中心流式细胞术共享资源平台完成。范德堡医学中心流式细胞术共享资源平台由范德堡消化系统疾病研究中心（DK058404）提供支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DPBS（不含 Ca 或 Mg）10 × 500 mlLife Technologies14190-250
DAPILife TechnologiesD3571
BSASigmaA2153-100G
胶原酶SigmaC6885-5G
碘化丙啶溶液SigmaP4864-10 ml
稳定堆叠 20 微升RaininSS-L10
20 微升滤芯吸头RaininSRL10F
稳定堆叠 250 微升吸头RaininSS-L250
1000 微升吸头RaininGPS-L1000
1000 微升滤芯吸头RaininGP-L1000F
250 微升滤芯吸头RaininSR-L200F
FC封闭BD 生物科学553142
fisher 100mn 细胞筛Fisherbrand22-363-549
中等大小称量皿Fisherbrand02-202B
铝箔Fisherbrand1213100
剪切剪刀Fisherbrand089531B
涡旋震荡Fisherbrand2215365
50 ml 锥形管BD Falcon14-959-49A
过滤顶部FACS管BD Falcon352235
10 ml 移液管盒 200BD Falcon1367520
圆底管BD Falcon352058
5 ml 注射器BD Falcon309646
V型底板Costar07-200-107
移液管赛默飞世尔科技13-711-22
Shaker赛默飞世尔科技11 676 071
粘性垫Thermo Scientific1368750
细胞培养离心机Sorvall75253839
适配器Sorvall75003723
小鼠 CD16/CD32 抗体（大鼠来源）BD Biosciences553142浓度：0.5 - 1 μ克/106 细胞
大鼠抗小鼠 F4/80eBioscience17-4801荧光素偶联物：APC
浓度：0.2 μ克/106 细胞
同型对照目录号：17-4321
大鼠抗小鼠 CD11beBioscience11-0112荧光素偶联物：FITC
浓度：0.5 μ克/106 细胞
同型对照目录号：11/1/4031
Armenian Hamster 抗小鼠 CD11ceBioscience12-0114荧光素偶联物：PE
浓度：0.8 μ克/106 细胞
同型对照目录号：Dec-88
山羊抗小鼠 MGL1/2 多克隆抗体R&D SystemsFAB4297P荧光素偶联物：PE
浓度：0.1 μ克/106 细胞
同型对照货号：IC108P
山羊抗小鼠 CD206R&D SystemsFAB2535P荧光素偶联物：PE
浓度：0.1 μ克/106 细胞
同型对照目录号：IC108P
大鼠抗小鼠 CCR2R&D SystemsFAB5538P荧光素偶联物：PE
浓度：0.1 μ克/106 细胞
同型对照目录号：IC013P
Armenian Hamster 抗小鼠 TCRβBD 生物科学553174荧光素偶联物：APC
浓度：0.2 μ克/106 细胞
同型对照目录号：553956
大鼠抗小鼠 CD8aBD Biosciences552877荧光素偶联物：PE-Cy7
浓度：0.8 μ克/106 细胞 <脂肪组织中巨噬细胞浸润增加的发现，已在肥胖的啮齿类动物和人类中引起人们对免疫细胞在局部和全身胰岛素抵抗中作用的广泛关注。目前，在代谢免疫学实验室中，分离和定量分析瘦型与肥胖个体脂肪组织中不同免疫细胞群体已成为一种常用技术；然而，在基质血管细胞的分离以及流式细胞术分析过程中，必须格外谨慎，以确保所获得的数据可靠且可解释。在本视频中，我们将演示如何切碎、消化并分离富含免疫细胞的基质血管组分；随后展示如何对巨噬细胞和T淋巴细胞进行抗体标记，并在流式细胞术实验中正确设门分析。我们提供了来自低脂饮食瘦型小鼠和高脂饮食肥胖小鼠的代表性流式细胞术图谱。该分析的关键环节包括使用不在脂肪组织巨噬细胞具有天然自发荧光的通道中发光的抗体，以及设置恰当的补偿对照。> 同型对照目录号：552784
大鼠抗小鼠 CD4BD 生物科学557956荧光染料偶联物：Alexa Fluor 700
浓度：0.2 μ克/106 细胞
同型对照目录号：557963

表1. 材料与试剂列表

参考文献

  1. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
  2. Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
  3. Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
  4. Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
  5. Mathis, D., Shoelson, S. E. Immunometabolism: an emerging frontier. Nature Reviews. Immunology. 11, 81(2011).
  6. Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
  7. Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
  8. Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
  9. Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
  10. Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
  11. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
  12. Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
  13. Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
  14. Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
  15. Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
  16. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
  17. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).
  18. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10(2010).
  19. Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
  20. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

基质血管组分流式细胞术分析胶原酶消化差速离心四种荧光标记抗体巨噬细胞定量T细胞设门活力染色补偿对照
脂肪组织免疫细胞的分离
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。