脂肪组织（AT）是免疫细胞活化和相互作用的重要场所。几乎所有类型的免疫系统细胞都存在于脂肪组织中，且其比例会因肥胖而发生改变。对脂肪组织中免疫细胞群体进行准确的分离、定量和表征，对于理解其在免疫代谢性疾病中的作用至关重要。
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摘要
摘要
在肥胖的啮齿类动物和人类脂肪组织（AT）中发现巨噬细胞浸润增加，促使人们对免疫细胞在局部和全身胰岛素抵抗中的作用产生了更浓厚的兴趣。目前，在代谢免疫学实验室中，分离和定量分析瘦型与肥胖型脂肪组织中不同免疫细胞群体已成为一种常用技术；然而，在基质血管细胞的分离以及流式细胞术分析过程中，必须格外谨慎，以确保所获得的数据可靠且可解释。在本视频中，我们演示了如何切碎、消化并分离富含免疫细胞的基质血管组分。随后，我们展示了如何使用抗体标记巨噬细胞和T淋巴细胞，并在流式细胞术实验中对其进行正确的设门分析。文中提供了来自低脂饮食瘦鼠和高脂饮食肥胖小鼠的代表性流式细胞术图谱。该分析的一个关键环节是使用不会在脂肪组织巨噬细胞具有天然自发荧光的通道中发光的抗体，同时必须设置适当的补偿对照。
引言
传统上，脂肪组织（AT）被视为一种惰性的脂质储存器官，会随着能量平衡的变化而扩张或收缩。如今我们认识到，AT 是一种动态的内分泌器官，能够主动分泌多种激素，直接影响摄食行为和全身葡萄糖稳态。此外，在过去十年中，人们日益认识到存在于脂肪组织基质血管组分（SVF）中的多种免疫细胞群体，以及它们对脂肪组织稳态的重要贡献。
利用胶原酶消化结合差速离心法分离脂肪组织脂肪细胞和基质血管组分（SVF）的方法最早由Rodbell于1964年描述1。由于胶原酶II能够维持脂肪细胞上的胰岛素受体活性，因此最常用于脂肪细胞与SVF的分离1。早期，脂肪组织的酶法分馏主要用于研究脂肪细胞代谢以及前脂肪细胞的分离。近年来，该技术结合流式细胞仪的广泛应用以及 commercially available 荧光素标记抗体数量的持续增加，促进了对脂肪组织中免疫细胞的表征研究。
尽管先前已有研究描述了炎症脂肪组织（AT）中存在免疫细胞的现象2，但Weisberg et al. 和Xu et al. 于2003年发表的两篇开创性论文首次记录了肥胖状态下脂肪组织巨噬细胞（ATMs）的积聚。这些巨噬细胞可分泌促炎性细胞因子，并与脂肪组织特异性和全身性胰岛素抵抗相关3,4。这些发现为一个新兴研究领域——“免疫代谢”（imm....
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方案
1. 试剂与耗材
在开始本实验方案之前，准备以下试剂：
- 70% 乙醇
- 1X PBS
- 含 0.5% BSA 的 1X DPBS（不含 Ca 和 Mg）
- FACS 缓冲液：1X DPBS（不含 Ca 和 Mg）、2 mM EDTA 和 1% FCS
- ACK 缓冲液：水中含 150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3 和 0.1 mM Na2EDTA
2. 脂肪组织的采集与制备
- 根据各机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的程序对小鼠实施安乐死。
- 用70%乙醇充分浸湿毛发。
- 在剑突水平（胸骨下部）做切口，打开胸腔以暴露心脏，注意避免切断任何主要血管。
注意： 此时，尽量保持膈肌完整，并在右侧肋骨上切一个缺口，以使血液和灌注液能够从胸腔中流出。
- 剪开右心房，使血液和灌注液能够流出循环系统。
注意： 处理肥胖小鼠时，可能需要去....
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结果
采用胶原酶消化脂肪组织（AT）并结合差速离心法，从饲喂低脂（10% kcal 来自脂肪）或高脂（60% kcal 来自脂肪）饮食（分别为 LFD 和 HFD）16 周的雄性 C57BL/6J 小鼠附睾脂肪垫中分离基质血管组分（SVF）。随后使用荧光染料标记的特异性一抗对 SVF 细胞进行染色，通过流式细胞术（FACS）定量分析存活的脂肪组织巨噬细胞（ATMs）（图 1）和脂肪组织 T 细胞（AT T 细胞）（图 2）的比例。初始设门策略，包括光散射、双联体排除及活细胞门控，如 图 1A 和 图 2A 所示。需特别强调的是，图 2A 中的初始光散射门控范围仅限于淋巴细胞群体，以避免纳入自发荧光的髓系细胞。使用改良的荧光减一对照（FMO）设定实验门控的示例如 图 1B 所示。在该示例中，F4/80（左列）和 CD11b（右列）抗体分别被相应的同型对照抗体替代，以校正自发荧光.......
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讨论
随着人们对免疫系统在肥胖代谢后果中作用的兴趣日益增加，流式细胞术被广泛用于表征脂肪组织（AT）中的免疫细胞。尽管具体实验方案会因实验室的经验和可用设备的不同而有所差异，关键步骤通常包括胶原酶消化、差速离心以及细胞表面抗原标记。本文旨在为在处理脂肪组织和/或进行流式细胞术方面经验有限的研究人员提供一种详细的AT基质血管组分（SVF）分离方案及实用操作指南。
与任何实验技术一样，存在多种可能对预期结果产生显著或不显著影响的变异方法。根据我们的经验，本文详述的方案在时间、资源、细胞得率和细胞活力之间实现了最高效的平衡。例如，我们发现，在胶原酶浓度相似的情况下，将胶原酶II消化时间延长至60分钟，对细胞得率的影响可忽略不计；因此，我们采用20分钟的消化时间以减少细胞暴露于胶原酶的时间。胶原酶II是脂肪组织消化中最常用的胶原酶。有关各种胶原酶及其主要用途的详细说明可在Sigma公司网站上找到。采用上述方案，分别从饲喂低脂（脂肪提供10%千卡热量）和高脂（脂肪提供60%千卡热量）饮食16周的小鼠中获得的典型细胞得率通常为每克脂肪组织（AT）2–3 × 106 和 4–5 .......
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
JSO 由美国国立卫生研究院 Ruth L. Kirschstein 国家研究服务奖（F32 DK091040）资助，AK 由美国糖尿病协会博士后奖学金（7-10-MI-05）资助，AHH 由美国心脏协会资深研究者奖（12EIA8270000）资助。流式细胞术实验在范德堡医学中心流式细胞术共享资源平台完成。范德堡医学中心流式细胞术共享资源平台由范德堡消化系统疾病研究中心（DK058404）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DPBS（不含 Ca 或 Mg）10 × 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| 胶原酶 | Sigma | C6885-5G | |
| 碘化丙啶溶液 | Sigma | P4864-10 ml | |
| 稳定堆叠 20 微升 | Rainin | SS-L10 | |
| 20 微升滤芯吸头 | Rainin | SRL10F | |
| 稳定堆叠 250 微升吸头 | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 微升吸头 | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 微升滤芯吸头 | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 微升滤芯吸头 | Rainin | SR-L200F | |
| FC封闭 | BD 生物科学 | 553142 | |
| fisher 100mn 细胞筛 | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| 中等大小称量皿 | Fisherbrand | 02-202B | |
| 铝箔 | Fisherbrand | 1213100 | |
| 剪切剪刀 | Fisherbrand | 089531B | |
| 涡旋震荡 | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml 锥形管 | BD Falcon | 14-959-49A | |
| 过滤顶部FACS管 | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml 移液管盒 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| 圆底管 | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml 注射器 | BD Falcon | 309646 | |
| V型底板 | Costar | 07-200-107 | |
| 移液管 | 赛默飞世尔科技 | 13-711-22 | |
| Shaker | 赛默飞世尔科技 | 11 676 071 | |
| 粘性垫 | Thermo Scientific | 1368750 | |
| 细胞培养离心机 | Sorvall | 75253839 | |
| 适配器 | Sorvall | 75003723 | |
| 小鼠 CD16/CD32 抗体（大鼠来源） | BD Biosciences | 553142 | 浓度：0.5 - 1 μ克/106 细胞 |
| 大鼠抗小鼠 F4/80 | eBioscience | 17-4801 | 荧光素偶联物：APC 浓度：0.2 μ克/106 细胞 同型对照目录号：17-4321 |
| 大鼠抗小鼠 CD11b | eBioscience | 11-0112 | 荧光素偶联物：FITC 浓度：0.5 μ克/106 细胞 同型对照目录号：11/1/4031 |
| Armenian Hamster 抗小鼠 CD11c | eBioscience | 12-0114 | 荧光素偶联物：PE 浓度：0.8 μ克/106 细胞 同型对照目录号：Dec-88 |
| 山羊抗小鼠 MGL1/2 多克隆抗体 | R&D Systems | FAB4297P | 荧光素偶联物：PE 浓度：0.1 μ克/106 细胞 同型对照货号：IC108P |
| 山羊抗小鼠 CD206 | R&D Systems | FAB2535P | 荧光素偶联物：PE 浓度：0.1 μ克/106 细胞 同型对照目录号：IC108P |
| 大鼠抗小鼠 CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | 荧光素偶联物：PE 浓度：0.1 μ克/106 细胞 同型对照目录号：IC013P |
| Armenian Hamster 抗小鼠 TCRβ | BD 生物科学 | 553174 | 荧光素偶联物：APC 浓度：0.2 μ克/106 细胞 同型对照目录号：553956 |
| 大鼠抗小鼠 CD8a | BD Biosciences | 552877 | 荧光素偶联物：PE-Cy7 浓度：0.8 μ克/106 细胞 <脂肪组织中巨噬细胞浸润增加的发现，已在肥胖的啮齿类动物和人类中引起人们对免疫细胞在局部和全身胰岛素抵抗中作用的广泛关注。目前，在代谢免疫学实验室中，分离和定量分析瘦型与肥胖个体脂肪组织中不同免疫细胞群体已成为一种常用技术；然而，在基质血管细胞的分离以及流式细胞术分析过程中，必须格外谨慎，以确保所获得的数据可靠且可解释。在本视频中，我们将演示如何切碎、消化并分离富含免疫细胞的基质血管组分；随后展示如何对巨噬细胞和T淋巴细胞进行抗体标记，并在流式细胞术实验中正确设门分析。我们提供了来自低脂饮食瘦型小鼠和高脂饮食肥胖小鼠的代表性流式细胞术图谱。该分析的关键环节包括使用不在脂肪组织巨噬细胞具有天然自发荧光的通道中发光的抗体，以及设置恰当的补偿对照。> 同型对照目录号：552784 |
| 大鼠抗小鼠 CD4 | BD 生物科学 | 557956 | 荧光染料偶联物：Alexa Fluor 700 浓度：0.2 μ克/106 细胞 同型对照目录号：557963 |
表1. 材料与试剂列表 |
参考文献
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-ind....
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重印与许可
