我们描述了一种分析方法，用于根据星形胶质细胞中谷氨酸转运体电流的电生理记录，估算谷氨酸在星形胶质细胞膜上的存留时间。
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摘要
摘要
大脑中谷氨酸转运体密度最高的细胞是星形胶质细胞。谷氨酸转运体在跨膜转运谷氨酸的同时，伴随3个Na+和1个H+的同向转运以及1个K+的反向转运。该转运过程所产生的化学计量电流可通过全细胞膜片钳记录技术在星形胶质细胞中进行监测。所记录电流的时间进程受到星形胶质细胞所暴露的谷氨酸浓度变化过程、谷氨酸转运体的动力学特性以及星形胶质细胞膜的被动电紧张特性共同影响。本文描述了可用于记录星形胶质细胞中谷氨酸转运体电流，并将谷氨酸清除的时间进程从所有其他影响星形胶质细胞转运体电流波形的因素中分离出来的实验与分析方法。本文所述方法可用于估算在健康或疾病状态下，中枢神经系统任何区域的星形胶质细胞膜处，通过光解释放或突触释放的谷氨酸的存留时间。
引言
星形胶质细胞是大脑中最丰富的细胞类型之一，具有星状形态和细小的膜突起，这些突起延伸至神经组织中，并到达邻近的突触连接部位1,2。星形胶质细胞的细胞膜上密集分布着谷氨酸转运体分子3。在生理条件下，谷氨酸转运体能够迅速在细胞膜外侧结合谷氨酸，并将其转运至细胞质内。通过这一过程，转运体维持细胞外间隙中谷氨酸的基础浓度处于较低水平4。位于兴奋性突触附近的星形胶质细胞细小突起中的谷氨酸转运体，恰好处于有利位置，可在突触活动释放的谷氨酸从突触间隙扩散出来时迅速将其结合。通过这种方式，转运体还能限制谷氨酸向突触周围及突触外区域以及邻近突触的溢出，从而减少兴奋性信号在大脑中的空间扩散范围5-7。
谷氨酸转运是一种生电过程，其化学计量与3个Na+和1个H+顺其电化学梯度的内流以及1个K+的反向转运相偶联8。谷氨酸转运还伴随（但非化学计量偶联）一种阴离子电导，该电导对SCN-（硫氰酸根）具有通透性> NO3-（硝酸根）≈ ClO4-（高氯酸根）> I- > Br- > Cl- > F-，但对CH3SO3-（甲烷磺酸根）和C6H11O7-（葡糖酸根）不通透9-11。这两种电流（化学计量性和非化学计量性）均可通过在急性脑切片中，利用Dodt透射光照明或红外差分干涉对比（IR-DIC）技术在显微镜下识别星形胶质细胞后，进行全细胞膜片钳记录来检测12。通过使用含CH3SO3-或C6H11O7- 的细胞内溶液，可分离出与谷氨酸跨膜转运相关的化学计量性电流成分，并可通过在星形胶质细胞上进行谷氨酸光解闪脱释放13,14，或通过电刺激12或靶向光遗传学手段激活邻近突触的谷氨酸释放来诱发该电流。
转运体电流的化学计量组分的时间进程由谷氨酸在星形胶质细胞膜上浓度分布的持续时间决定（即 谷氨酸清除）、谷氨酸转运体的动力学、星形胶质细胞的被动膜特性，以及在突触刺激过程中，激活突触间谷氨酸释放的同步性 13在此，我们详细描述如下： (1) 一种实验方法，以急性小鼠海马脑片为示例实验体系，通过星形胶质细胞的全细胞膜片钳记录分离谷氨酸转运体电流的化学计量组分； (2) 一种从这些记录中推导谷氨酸清除时间过程的分析方法 13,14这些方法可用于记录和分析中枢神经系统任何区域星形胶质细胞中的谷氨酸转运体电流。
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方案
1. 切片制备
- 配制 500 ml 切片/保存液，其成分（单位为 mM）如下：119 NaCl、2.5 KCl、0.5 CaCl2、1.3 MgSO4·7H2O、4 MgCl2、26.2 NaHCO3、1 NaH2PO4 和 22 葡萄糖，渗透压为 320 mOsm，pH 值为 7.4。
- 使用 250 ml 烧杯制备用于放置脑片的浸没式孵育 chamber，加入 200 ml 切片/保存液，置于 34 °C 水浴中并持续通入 95% O2 和 5% CO2 混合气体进行氧合。
- 将剩余的切片/保存液保存于玻璃瓶中，置于 4 °C 环境下备用。
- 使用氰基丙烯酸酯胶水将一小块琼脂（6%，用 ACSF 配制）固定在振动切片机的样品托上，并将该装置存放在 4 °C 环境中。
- 在开始切片前 30 分钟，将装有切片/保存液的玻璃瓶放入盛有冰块的容器中冷却，并持续通入 95% O2 和 5% CO2 混合气体进行预冷氧合。
注意：以下所述解剖步骤的关键在于速度与精确性。
- 用卤烷/异氟烷麻醉小鼠（P14-21，C57BL/6）（据报道异氟烷可增强星形胶质细胞对谷氨酸的摄取15），断头后将头部浸入盛有充氧、冰冷切片/保存液的50 ml烧杯中。
- 在用纸巾包裹并储存在-20 °C冰袋上进行脑组织解剖。
- 使用手术刀在头部背侧从额部至尾部沿正中矢状面做皮肤切口，暴露颅骨。
- 将小型手术剪的下剪刃插入枕骨大孔，分别向左侧和右侧（45°角）进行剪切。
- 沿正中矢状线从尾端向额端剪开颅骨。
- 用刮铲取出脑组织，并将其浸入充氧、冰冷的切片/保存液中。
- 使用手术刀进行五次切割： (1) 切除嗅球和额叶皮层；(2) 切除小脑；(3) 切除左侧和(4) 右侧颞叶；(5) 通过正中矢状切口分离两个脑半球。
- 用纸巾轻拍脑组织两部分，去除多余液体。
- 将每个脑组织切片的外侧面粘附到冰冷的振动切片机底板上：脑组织背侧应朝向振动切片机刀片；腹侧应接触琼脂块，远离振动切片机刀片。
注意：为获得最高质量的切片，必须确保脑组织两部分牢固地粘附在振动切片机底板上。为此，请使用一种不太稀且不会过快干燥的氰基丙烯酸酯胶水。 - 将振动切片机底板固定至解剖腔室，设置切片厚度为250 μm，并调整刀片行程宽度。开始切片。
注意：如果所有方向均正确，振动切片机应从脑组织背侧向腹侧、从内侧向外侧切割出旁矢状面切片。 - 当刀片通过皮层和海马后，使用手术刀将皮层/海马从中脑分离，并将每一片切片放入34 °C的浸没式孵育室中。
- 弃去最初的几片切片。通常，一只P14-21小鼠脑可获得约12片切片（厚度为250 μm）。
- 将切片在34 °C下孵育30分钟，随后在室温下冷却30分钟，再用于膜片钳电生理记录。
2. 星形胶质细胞鉴定与记录
- 配制一种内液，其中含有（单位：mM）：120 KCH3SO3，10 EGTA，20 HEPES，2 MgATP，0.2 NaGTP，5 QX-314Br 和 5 NaCl，290 mOsm，pH 7.2。
- 配制细胞外记录液，其成分如下（单位：mM）：119 NaCl，2.5 KCl，2.5 CaCl2，1.3 MgSO₄4·7H2O, 1 MgCl2，26.2 NaHCO₃3, 1 NaHPO4，以及22葡萄糖、300 mOsm、pH 7.4，用95% O₂饱和2，5% CO₂2.
- 向细胞外记录液中加入以下药物，以阻断GluA、GluN、mGluRII、mGluRIII和GABA的激活A, γ-氨基丁酸B，以及A1腺苷受体（在 μM): 10 2,3-二氧代-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[ƒ]喹喔啉-7-磺酰胺二钠盐（NBQX），10 (RS)-3-(2-羧基哌嗪-4-基)-丙基-1-膦酸（CPP），(2S)-2-氨基-2-[(1S,2S)-2-羧基环丙基]-3-(9-氧杂蒽基)丙酸二钠盐（LY341495），100 (R,S)-α-甲基丝氨酸-O-磷酸（MSOP），100 毕可毒素，5 3-[[(3,4-二氯苯基)甲基]氨基]丙基]二乙氧基甲基)膦酸（CGP52432），1 8-环戊基-1,3-二丙基黄嘌呤（DPCPX）。
- 设定记录浴槽中外液的温度；通常温度范围为 34 - 36 °C.
- 使用双级玻璃微电极拉制仪，从硼硅酸盐玻璃毛细管制备膜片钳电极（R ≈ 2.5 MΩ）。
- 取一片组织置于记录舱中，用铂丝和尼龙线制成的金属丝网固定。
- 在Dodt照明或红外微分干涉（IR-DIC）下目视检查切片。星形胶质细胞可通过其较小的细胞体（Ø = 10 μm）以及明显的细胞核（图1).
- 对于突触刺激，放置一个双极不锈钢电极，~100 μm 远离你计划进行膜片钳记录的星形胶质细胞。
- 通过施加极轻微的负压，对星形胶质细胞进行膜片钳制并形成全细胞记录模式。
注意： 星形胶质细胞通常具有较低的输入电阻（约10 MΩ）、超极化的静息膜电位（约-90 mV），且无放电活动。在电压钳制模式下，整个实验过程中星形胶质细胞均维持在其静息膜电位即 钳制电流应读数为0 pA。每次刺激前，使用10 ms的超极化电压步阶（-3 mV）监测星形胶质细胞的串联电阻和输入电阻。 - 如果串联电阻发生变化，则舍弃该记录 >20% 或星形胶质细胞的膜电位发生去极化时。可通过从电压钳制模式切换至电流钳制模式，直接测量星形胶质细胞的膜电位。或者，在保持电压钳制模式的同时，通过读取产生 0 pA 钳制电流的维持电位值来监测膜电位。
- 如果采用突触刺激，则交替使用单次刺激和成对刺激（例如 间隔100毫秒，每10至20秒一次。
- 对于紫外光解实验，将解笼用氙灯连接至显微镜的落射荧光端口，并将笼锁化合物加入细胞外溶液中。当进行脉冲光解时，可获得幅度约为100 pA的转运体电流。 100 μM MNI-L-谷氨酸在整个视野中（Ø = 662.5 μm 使用40倍物镜时 14）。每隔10 - 20秒交替进行光路开启与遮挡的刺激。
- 在对照条件下以及在存在亚饱和浓度的广谱谷氨酸转运体拮抗剂 D,L-时，诱发谷氨酸瞬时信号并记录转运体电流苏式-β-苄氧基天冬氨酸（TBOA； 10 μM）以使转运体电流幅度降低至其对照值的至少30%（见第4、5节），或在存在高浓度TBOA（50 - 100 μM) 以完全阻断转运体电流并分离出持续性 K+-电流（见第3节）。
3. 持续性 K+-电流的药理学分离
- 在对照条件以及存在高浓度、饱和浓度TBOA（50 - 100 μM）的情况下记录星形胶质细胞电流。
- 对至少20次在TBOA（50 - 100 μM）存在下的扫描信号进行平均。
- 使用以下函数拟合步骤3.2中获得的平均迹线：
注意：TBOA不敏感组分（即在TBOA（50 - 100 μM）存在下记录的组分）代表持续性K+电流。其时间进程可用上述单指数函数近似描述。 - 在不同的星形胶质细胞中重复此拟合，并得出Τrise的平均值（即持续性K+电流的平均上升时间（见第5节））。
4. 分离突触激活的转运体电流的易化部分（fSTC）
- 在对照条件下和TBOA（10 μM）中，分别对成对刺激获得的至少20次扫描结果进行平均（图2a 左）。
- 在对照条件下和TBOA（10 μM）中，对相同数量的单次刺激获得的扫描结果进行平均（图2a 中）。
- 比较四种平均迹线中对-3 mV电压阶跃的平均电流反应幅度（对照单脉冲、对照成对脉冲、TBOA单脉冲、TBOA成对脉冲）。
- 如果四种迹线中的电流反应幅度相同，则继续进行步骤4.7。
- 如果四种迹线中任意一条的平均电流反应幅度不同，请检查所有单个迹线是否均适合纳入平均。
- 如果四种迹线中任意一条的平均电流幅度不同，但所有单个迹线均适合纳入平均，请验证每条迹线中fSTC的大小是否与测试电压阶跃引起的电流反应大小呈线性关系。如果是，则相对于彼此对所有迹线进行缩放，使各迹线中对测试电压阶跃的电流反应幅度均相等。
注意：在本文所述的记录条件下（即 细胞内使用CH3SO3- 或 C6H11O7-），兴奋性轴突的突触刺激会产生具有复杂波形的星形胶质细胞电流，包括快速上升的瞬时内向化学计量电流，以及缓慢上升、持续的内向K+电流，后者反映了动作电位沿邻近轴突传播后细胞外空间K+的再平衡。必须去除这种持续的K+电流，因为任何残余电流都会导致谷氨酸寿命被高估。 - 从成对刺激获得的平均迹线中减去单次刺激获得的平均迹线（图2a 右）。此步骤可分离出由第二次刺激诱发的化学计量电流和持续的K+电流。
- 将单次刺激获得的平均迹线沿时间轴平移一个等于双脉冲间间隔的时间（即 100 msec）（图2b）。
- 从步骤4.7中获得的第二次刺激的平均反应中，减去时间平移后的单次刺激平均反应（图2c）。此步骤可分离出由第二次刺激诱发的转运体电流中的易化部分（即fSTC）。
- 在大多数情况下，前述步骤可完全去除持续的K+电流。若如此，则fSTC的分离已完成，可继续进行去卷积分析，并推导出星形胶质细胞清除谷氨酸的时间过程。然而，在某些情况下，仍可能存在少量持续的K+电流（图2d），需进一步分析（见第5节）。
注意：请记住，步骤4.7–4.10中描述的分析必须在对照条件和TBOA（10 μM）下获得的平均迹线上分别进行。
5. 从fSTC中减去残余的zdustained K+-电流
- 测量执行第4节所述分析后剩余的持续性K+电流的幅值。
- 将3.3节中描述的单指数函数的幅值调整至与5.1节中测得的残余持续性K+电流幅值一致（图2d 左图和中图）。具体操作为：在公式3.3中，令参数A等于5.1节中测得的持续性K+电流幅值，参数Τrise等于3.4节中估算的Τrise平均值。
- 从4.10节获得的fSTC和持续性K+电流中减去上述单指数函数（图2d 右图）。此步骤完成fSTC的分离。
6. 光激活转运体电流（FTCs）的分离
- 在对照条件和TBOA（10 μM）条件下，对光路打开时获得的至少20次扫描信号进行平均。
- 在对照条件和TBOA（10 μM）条件下，对光路关闭时获得的相同数量的扫描信号进行平均。
- 比较四种平均轨迹中对-3 mV电压阶跃的电流反应幅度（对照单脉冲、对照成对脉冲、TBOA单脉冲、TBOA成对脉冲）。
- 如果四个轨迹中的电流反应幅度相同，则进入步骤6.7。
- 如果四个轨迹中任一轨迹的平均电流反应幅度不同，请检查所有单个轨迹是否均适合纳入平均。
- 如果四个轨迹中平均电流幅度存在差异，但所有单个轨迹均适合纳入平均，请验证在每个光路打开的轨迹中，FTC的大小是否与测试电压阶跃引起的电流反应大小呈线性关系。若如此，应对所有轨迹进行相对缩放，使各轨迹中对测试电压阶跃的电流反应幅度相等。
注意：在本文所述的记录条件下（即细胞内使用CH3SO3-或C6H11O7-），闪光刺激产生的星形胶质细胞电流仅包含快速上升的瞬时化学计量性内向电流。 - 将光路打开时获得的平均轨迹减去光路阻断时获得的平均轨迹。此步骤可消除刺激伪迹并分离出FTC。
注意：步骤6.7中描述的分析必须在对照条件和TBOA（10 μM）条件下获得的平均轨迹上进行。
7. 去卷积分析
- 在对照条件下记录的转运体电流（fSTC 或 FTC）进行拟合图3a 左侧）及TBOA中10 μM) (图3a 右侧）并按照第4-6节所述方法分离，采用多指数函数：
- 创建一个瞬时上升且按以下函数单指数衰减的函数：
以及最能描述在TBOA中记录的转运体电流衰减相的特征10 μM) (图3b).
注意： 7.2 节所述功能即 H(t) 表示在存在 TBOA 的情况下星形胶质细胞清除谷氨酸的时间过程10 μM). - 对7.2中获得的单指数函数进行解卷积图3b 和 3c 在TBOA中记录的转运体电流拟合得到的中间值（middle）10 μM) 在 7.1 中获得的图3a 右 c 左侧。
注意： 去卷积是一种数学运算，包含在许多分析软件包中，例如（例如 Matlab、Python）。在 IgorPro 中，我们通常使用以下所述的编程代码来执行此类分析，即通过离散快速傅里叶变换高效计算解卷积运算。首先，使用 FFT 运算计算在 7.2 中获得的单指数函数以及在 7.1 中获得的 TBOA 条件下记录的转运电流拟合结果的离散快速傅里叶变换。接着，使用 IFFT 运算计算上述两个 FFT 函数之比的逆离散快速傅里叶变换。所得函数 I(t) 可描述如下：
步骤7.3所述操作可用于推导出在TBOA中转运体电流的滤波器10 μM) (图3c 右侧）。该滤波器代表了将星形胶质细胞膜上谷氨酸寿命转换为第4至6节中分离出的转运体电流的失真因素。即 fSTC 或 FTC - 去卷积滤波器（图3c 右 图3d 对照条件下转运体电流拟合的中部图3a 左侧 图3d 左侧。
注意： 此步骤可用于获得对照条件下星形胶质细胞谷氨酸清除的时间过程（图3d 右侧）。此去卷积步骤的基本假设是，滤波器的时间特征在对照条件和TBOA条件下保持不变。10 μM). - 为了定量估算谷氨酸清除的整体时间进程，计算其质心（centroid）步骤7.4中获得的波形的）值。通过计算实现 作为：
其中 G(t) 是步骤 7.1 中获得的波形。在上述方程中，项 t 对应于计算积分的时间窗口。
注意： 当该方法首次建立时， 在未加约束的时间窗口内计算得出 13 只要积分时间窗设置得比谷氨酸清除持续时间更宽，且清除波形完全衰减回基线，该方法即可适用。然而，若不满足此条件，则这种估算方法 存在一些局限性。例如，如果清除波形未能完全衰减回基线水平，则 随着积分窗口宽度的增加而增加。为避免估计值出现任何潜在的不准确来源 现在，我们在转运体电流峰值出现前后，计算对应于其峰值10%时间窗口内的数值 14 后一种方法提高了结果的一致性 在细胞水平上进行测量。这在分析药物处理对清除过程时间进程的微小效应时尤为有用。
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结果
本文所述分析方法的成功关键在于能否从中枢神经系统任一区域的星形胶质细胞中获得高质量的转运体电流电生理记录。在急性小鼠海马脑片中，由于星形胶质细胞具有较小的胞体（直径 = 10 μm）和明显的细胞核，因此可在Dodt透射光或红外微分干涉（IR-DIC）显微镜下轻易识别（图1）。当向细胞内溶液中加入Alexa 594（50 μM）等荧光染料后，可通过落射荧光、共聚焦或双光子激光扫描显微镜观察到其独特的星状形态（图1）。在电生理特性方面，星形胶质细胞表现为低输入电阻、超极化的膜电位（约-90 mV），且不具备产生动作电位的能力。星形胶质细胞可在邻近神经元的电刺激或光遗传学刺激，以及MNI-L-谷氨酸等笼锁化合物的紫外光解作用下产生电流反应。
可以使用基于Cs+或K+的细胞内溶液记录星形胶质细胞转运体电流。需要注意的是，Cs+作为一种常用的K+替代物，虽然能够支持谷氨酸的转运，但会减慢谷氨酸转运体的循环速率16,17
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讨论
本文介绍了一种从星形胶质细胞获取电生理记录的实验方法、一种用于分离星形胶质细胞中谷氨酸转运体电流的分析方案，以及一种通过星形胶质细胞转运体电流推导谷氨酸清除时间进程的数学方法。
分析的成功依赖于能否从星形胶质细胞获得高质量的膜片钳记录，以及用于描述转运体电流的拟合算法的准确性。去卷积分析基于以下两个假设。 (1) 将谷氨酸清除时间过程扭曲为实验记录的转运体电流的多种过程可表示为线性系统。尽管从绝对意义上讲，影响转运体电流的许多因素属于非线性系统（原则上谷氨酸结合与转运均可发生饱和），但实验证据表明其线性范围较宽。因此，在广泛的刺激强度、释放概率和谷氨酸浓度范围内，转运体电流的时间过程与谷氨酸清除的时间过程保持一致。 13,14,18尽管该近似在我们的实验条件下似乎是合理的，但在不同实验体系中重复此分析之前，应对其进行验证。 (2) 滤波器的特性不受TBOA（10 μM）存在的影响。这一假设似乎是合理的，因为所有对滤波器有贡献的因素即 转运体动力学、电紧张性滤波以及突触刺激期间跨突触的谷氨酸异步释放等过程不太...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由国家神经疾病和卒中研究所院内研究计划（NS002986）资助。AS 撰写了手稿并实施了去卷积分析。JSD 开发了去卷积分析的初始版本并对文本提出了修改意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CGP52432 | 陶克瑞斯 | 1246 | |
| (R,S)-CPP | 陶克瑞斯 | 173 | |
| DPCPX | 陶克瑞斯 | 439 | |
| LY341495 二钠盐 | 陶克瑞斯 | 4062 | |
| MSOP | 陶克瑞斯 | 803 | |
| NBQX 二钠盐 | 陶克瑞斯 | 1044 | |
| D,L-TBOA | 陶克瑞斯 | 1223 | |
| 苦味毒 | 西格玛 | P1675 | |
| MNI-L-谷氨酸 | 陶克瑞斯 | 1490 | |
| Alexa 594 | 生命技术公司 | A10438 | 可选 |
| 阵列电极 | 弗雷德里克·海尔公司 | MX21AES(JD3) | |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | 世界精密仪器公司 | PG10165-4 | |
| 双级玻璃微电极拉制仪 | 纳利希格 | PC-10 | |
| 乐泰 404 瞬干胶 | 特德·佩拉公司 | 46551 | |
| 氙灯 | 拉普光电电子公司 | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics |
参考文献
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