星形细胞转运电流派生谷氨酸间隙的时间进程与反卷积分析

Summary

我们描述了一个分析估计寿命星形胶质膜谷氨酸在星形胶质细胞谷氨酸转运电流的电生理记录的方法。

Abstract

发现大脑中的谷氨酸转运体密度最高的星形胶质细胞。谷氨酸转运体的移动耦合谷氨酸穿过细胞膜的与共同运输3的Na ⁺和1 H ⁺和1 K计数器运输^+。运输过程中所产生的化学计量电流可以监视从星形胶质细胞与全细胞膜片钳记录。的时间过程中所记录的电流的时间过程中谷氨酸的浓度分布的星形胶质细胞暴露，谷氨酸转运体的动力学，和被动电张性能的星形胶质细胞的膜的形状。这里，我们描述的实验和分析的方法，可用于记录在星形胶质细胞谷氨酸转运体的电流和隔离的谷氨酸间隙从所有的其他因素而形成波形的星形胶质细胞的转运电流的时间过程。这里描述的方法可以被用来估计的生命周期F闪光灯开锁和突触释放的谷氨酸在任何地区的中枢神经系统在健康和疾病中的星形胶质细胞的膜。

Introduction

星形胶质细胞是大脑中的星形形态和细膜突起，扩展到整个神经纤维到达邻近的突触联系^1,2最丰富的细胞类型之一。星形胶质细胞的细胞膜被密密麻麻的与谷氨酸转运分子^3。谷氨酸转运体在生理条件下，迅速地结合在细胞外谷氨酸侧膜，并将其转移到细胞的细胞质中。通过这样做，转运保持较低的基底浓度的谷氨酸在细胞外空间^4。精美的星形胶质细胞的过程相邻兴奋性突触的谷氨酸转运体在理想的位置，结合谷氨酸突触活动期间发布，因为它远离突触间隙扩散。通过这样做，运输也限制对围绝经期和额外的突触区域到相邻的突触的谷氨酸溢出，减少兴奋信号的空间传播^5-7大脑S IN。

谷氨酸转运是一个生电的过程中化学计量的运动耦合到3 Na ⁺和H ⁺的电化学梯度沿它们的1 K ^{+ 8}的逆运输。谷氨酸运输相关的（但不是化学计量）阴离子电导渗透到SCN ^{- （}硫氰酸盐）> NO ₃ ^{- （}硝酸）≈CLO ₄ ^{- （}高氯酸盐）> ^- > ^- >氯^- > F ^-不CH ₃ SO ₃ ^{- （}甲烷磺酸钠）和C _{6 H 1....}

Protocol

1。切片制备

1. 准备500毫升/存储解决方案（单位:mm）:119氯化钠，氯化钾2.5 1.3 0.5 _氯化钙 ， _硫酸镁 ·7H ₂ O，4 _氯化镁 ，26.2的NaHCO _3，1的NaH ₂ PO _4，和22葡萄糖，320切片毫渗量，pH值7.4
2. 使用250毫升的烧杯中，准备淹没室，为片，填充200毫升切片/存储解决方案，在水浴加热34°C和_{95％O2，5％CO2}泡沫。
3. 保留剩下的切片/存储解决方案的玻璃瓶中，在4°C。
4. 使用氰基丙烯酸酯粘接剂vibratome的样本保持器上附加一个小的琼脂块（6％时，制备的人工脑脊液），并将其存储在4℃下
5. 前30分钟开始切片，将切片/存储解决方案，在一个桶充满了冰，用95％O _{2，5％CO 2}的气泡的玻璃瓶中。

6. 氟烷麻醉鼠标（P14-21，C57BL / 6）/异氟醚（异氟醚已上报增强星形胶质细胞谷氨酸摄取^15），斩首，头浸在50毫升烧杯中含氧，冷切片/存储解决方案。
7. 用纸巾包裹，并储存于-20℃下在冰包进行大脑的解剖
8. 使用手术刀作出头的....

Results

这里描述的分析方法的成功严重依赖于获得高质量转运电流从任何地区的中枢神经系统的神经胶质细胞的电生理记录。星形胶质细胞在急性小鼠海马脑片，可以很容易地确定下DODT照明或IR-DIC，因为他们的小细胞体（O = 10微米）和髓核突出（ 图1）。其独特的星形的形态与落射荧光，共焦或双光子激光扫描显微镜，可以理解，当加入类似的Alexa 594荧光团（50μM）细胞内的溶液中，（ 图1）。上面的电生理水平，星形胶质细胞的特点是低输入电阻，超极化膜电位（约-90毫伏），不能产生动作电位。星形胶质细胞产生的电流响应邻近的神经元的刺激，电或光遗传学约紫外光解GED化合物MNI-L-谷氨酸等。

星形细胞转运电流可以记录使用CS ⁺或K ⁺的内部解决方案。需要注意的是，一个流行的K ⁺的替代品，Cs ⁺的支持谷氨酸转运，但减缓的谷氨酸转运体循环率^16,17（因为谷氨酸转运体结合和/或转运CS ⁺穿过细.......

Discussion

这里，我们描述的实验方法得到的星形胶质细胞的电生理记录，协议在星形胶质细胞谷氨酸转运电流隔离的分析和数学方法获得谷氨酸的空隙，星形细胞转运电流的时间过程。

分析的成功依赖于星形胶质细胞的能力，获得高品质的膜片钳记录，用来描述转运电流的拟合算法的准确性。反卷积分析依赖于以下两个假设，（1）的多个进程扭曲谷氨酸的间隙进入实验记录转运电流的时间过程可被表示为一个线性系统。虽然在绝对数许多形状转运电流是非线性系统（谷氨酸原则结合和运输都可以进行饱和度），实验证据籼稻的因素TES，它们的线性制度是广泛的。因此，转运电流和谷氨酸清除的时间过程仍然是相同的，在很宽的范围内的刺激强度，释放概率，谷氨酸浓度^13,14,18。近似虽然这似乎是合法的我们的实验条件下，它应该被验证之前重复该分析在不同的实验制剂，（2）过滤器的特点是不受TBOA（10μM）的存在下。这个假设似乎是合理的，因为所有的因素，有助于过滤器（ 即转运动力学，电紧张的过滤，并在突触的刺激，异步跨突触释放谷氨酸）是不太可能受到的存在TBOA。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
（R，S）-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 二钠盐	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX 二钠盐	Tocris	1044
D，L-TBOA	Tocis	1223
印防己毒素	Sigma	P1675
MNI-L-谷氨酸	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	可选
基质电极	Frederick Haer Company	MX21AES（JD3）
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	PG10165-4
双级玻璃微量移液器拉拔器	Narishige	PC-10
Loctite 404 即时胶	Ted Pella	46551
Xe 灯	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics