一种用于小鼠肠神经前体细胞的定量细胞迁移检测方法

摘要

我们介绍一种 离体 一种细胞迁移实验，可在存在多种生长因子的情况下精确定量肠神经嵴细胞的迁移潜能。

摘要

神经嵴细胞（NCC）是一类短暂存在且具有多向分化潜能的细胞群体，起源于背侧神经管，并在发育中的脊椎动物胚胎内广泛迁移。除了生成外周胶质细胞和神经元外，NCC 还产生黑色素细胞以及大部分颅面骨骼结构。NCC 的迁移与分化受到其在神经管上轴向位置以及所处微环境中区域性差异信号分子的共同调控。细胞外配体的这种作用在肠神经系统（ENS）的形成过程中尤为显著；ENS 是一个由相互连接的神经节组成的复杂网络，局部调控（除其他功能外）肠道肌肉运动和肠蠕动。ENS 的大部分起源于一小群初始的 NCC，这些细胞经历长距离迁移，以头端至尾端的顺序定植于整个原肠。在已知影响肠源性 NCC 定植的多种信号通路中，GDNF/RET 信号通路被认为最为重要。事实上，肠间充质细胞在时空上受控分泌 RET 配体 GDNF，是吸引并引导表达 RET 的肠源性 NCC 进入并迁移于胚胎肠道内的主要机制。本文中，我们描述了一种离体（ex vivo）细胞迁移实验方法，利用一种带有荧光标记 NCC 的转基因小鼠品系，可在存在多种生长因子（包括 GDNF）的条件下，精确量化肠源性 NCC 的迁移潜能。

引言

神经嵴细胞（NCC）是一类仅存在于脊椎动物中的短暂性细胞类型，在胚胎发育过程中可分化为多种衍生物。这群细胞起源于神经板边缘，紧邻非神经外胚层¹。在神经管形成过程中，神经板的弯曲使神经嵴细胞位于正在形成的神经管背侧边缘。随后，神经嵴细胞经历上皮-间质转化，从神经管分离并迁移出去。神经嵴细胞定植于多个胚胎结构中，包括消化道，在其中形成完整的肠神经系统（ENS），即嵌于肠壁内、由相互连接的神经节组成的神经网络。正如近期综述所述^2,3，许多基因已被证实参与这一复杂结构的发育过程。

大部分肠神经系统（ENS）源自位于迷走神经管的一小群神经嵴细胞（NCC）即 在预期的后脑/脊髓边界周围⁴这些神经前体细胞在小鼠胚胎约第9.0天（e9.0）到达前肠，随后在肠壁间充质中向尾部迁移，直至约e15.0，最终定植于整个胚胎肠道。此外，结肠的一部分神经前体细胞也来源于骶部神经嵴细胞（sacral NCC），它们从后肠相反方向侵入，迁移至盲肠。⁴迷走神经和骶神经嵴细胞均需要多种促进迁移、增殖、存活和分化的信号刺激，以确保肠神经系统（ENS）的完整形成。在这方面，动物模型——尤其是基因修饰小鼠——在鉴定多种关键的细胞外配体方面发挥了重要作用：GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）、内皮素-3、神经营养素-3、BMPs（骨形态发生蛋白）、Netrin，以及Sonic和Indian Hedgehog（Shh和Ihh）。^5-10在这些信号通路中，通过酪氨酸激酶跨膜受体RET（转染时重排，Rearranged during transfection）介导的GDNF信号被公认为对神经嵴细胞（NCC）向胚胎肠道迁移及在肠内的导向最为关键。GDNF由肠间充质细胞分泌，并形成一种时空可控的头-尾梯度，直接对表达RET的肠源性NCC产生化学趋化作用。^11,12.

除了其他功能外，肠神经系统（ENS）通过与肠壁平滑肌的相互作用来调节消化道内的运动。当肠道末端区域缺乏神经节时，会导致先天性巨结肠症（Hirschsprung病）：受累肠段持续性收缩，引起梗阻、上游消化物积聚以及肠道和腹部显著扩张。Hirschsprung病的发生率约为每5,000例活产婴儿中1例。肠源性神经嵴细胞（enteric NCC）从头端向尾端的迁移模式被认为是该病病因的主要因素。结肠距离迁移中的神经嵴细胞来源最远，是肠道中最后被定植的部分，因此最易发生ENS发育缺陷。鉴于GDNF/RET信号通路在肠源性神经嵴细胞迁移中的关键作用，该通路的异常是目前已知的Hirschsprung病最主要的遗传学病因¹³。

为了更深入地研究神经嵴细胞（NCC）和肠神经系统（ENS）的发育过程，我们构建了一种转基因小鼠品系——命名为 Gata4p[5kb]-GFP¹⁴ - 其中迁移性神经嵴细胞（NCC）用绿色荧光蛋白（GFP）标记。接下来，我们优化了一种 离体 细胞迁移实验，改编自其他研究团队已发表的工作^11,12,15，现在可在存在多种生长因子（如GDNF）的条件下，精确量化肠源性神经嵴细胞的迁移潜能。

方案

伦理声明

涉及小鼠的实验均遵循加拿大动物护理委员会关于医学研究中使用动物的护理与操作指南进行。涉及动物操作的实验方案已获得蒙特利尔魁北克大学机构伦理委员会（Comité Institutionnel de Protection des Animaux；参考编号 0512-R3-650-0513）的批准。

1. 胶原凝胶的制备

在组织培养罩内以无菌方式操作。

1. 配制完全5倍浓度DMEM（Eagle改良必需培养基），包括标准抗生素。将3.37 g DMEM粉末和0.925 g NaHCO₃溶解于20 ml水中，通过0.22 μm滤膜过滤除菌。加入2.5 ml无菌100倍浓度青霉素/链霉素和25 ml无菌热灭活胎牛血清。4 °C保存。
2. 在冰上混合800 µl I型胶原溶液（3.77 mg/ml，溶于0.02 N乙酸中，已过滤除菌）、600 µl完全5倍浓度DMEM和17 µl 1 N NaOH。用无菌水稀释至终体积3 ml。在混合液中加入相关生长因子。我们通常使用10 ng/ml GDNF以促进肠源性神经嵴细胞迁移。
3. 在24孔板的每行孔中各加入约480 µl。避免产生气泡。其余行可用于测试其他生长因子对细胞迁移的影响。
4. 将胶原置于37 °C无菌培养箱中聚合至少1小时。

2. 动物解剖¹⁶

1. 设置交配并在次日上午检查阴道栓。以发现阴道栓当天中午为 e0.5，将雌鼠隔离并等待 12 天至 e12.5。
2. 用异氟烷麻醉怀孕小鼠，并通过吸入 CO₂ 实施安乐死。
3. 用 70% 乙醇喷洒小鼠。提起腹部皮肤，用解剖剪刀打开腹腔。
4. 将子宫移至盛有冰上预冷的 PBS（磷酸盐缓冲盐水）的玻璃培养皿中。在各个蜕膜膨大之间横向剪开子宫，以分离每个胚胎着床部位。
5. 在另一盛有冰上预冷 PBS 的玻璃培养皿中，分别处理每个着床部位。在解剖显微镜下，用精细镊子去除子宫的肌层。
6. 切开卵黄囊内层和羊膜，暴露胚胎。切断连接胚胎与胎盘/卵黄囊内层的血管时需格外小心，因为这些血管与正在发育的肠道相互缠绕。
7. 在颈部处切断胚胎头部。
8. 将闭合的镊子插入胚胎腹腔，位置位于深红色肝脏上方，然后停止施加压力，让镊子自行张开，从而在腹腔上形成一个横向开口。将张开的镊子向下拉向胚胎后端，以完全打开腹腔。
9. 夹住肝脏后方的结缔组织，小心地将肠道从腹腔中拉出，注意不要损伤肠道（结肠与肛门相连）。
10. 切断结肠，使肠道与胚胎其余部分分离。切断位置可在结肠任意部位进行。保留尾部组织以备后续使用。
11. 小心剥离盲肠周围的结缔组织，然后继续清除其余肠道上的结缔组织。操作过程中注意避免损伤肠道。
12. 切除肝脏和胃（位于小肠头端），若存在，同时切除中肾和生殖嵴。
13. 分离小肠。操作时仍需小心避免夹伤肠道。此后，可通过小肠头端的锐利弯曲来追踪肠道组织的头-尾方向。分离后的小肠应尽快进行包埋处理（见步骤 3.3），避免在室温 PBS 中放置过久。
14. 最后，记录每个胚胎的尾部体节数量，以准确判断胚胎发育阶段。

3. 胚胎肠道切片

1. 在进行胚胎解剖之前，将1.5 g琼脂糖溶于100 ml PBS（磷酸盐缓冲液）中，并保持在50 °C。
2. 将熔化的琼脂糖倒入包埋模具中（例如，将一个封闭的2 ml 微离心管沿长度方向切去约1/4管壁制成的模具）。让琼脂糖冷却至约42–45 °C，此时触感应仅微温。
3. 在琼脂糖即将凝固前（可用镊子尖端测试，凝固温度约为36–38 °C）包埋胚胎肠道。用镊子夹住肠道折叠的头端，缓慢地沿模具长度方向将其拉过琼脂糖。这有助于在琼脂糖凝固过程中保持肠道平直。一旦组织开始抵抗移动，立即松开。注意记录肠道的头-尾方向。
4. 将模具放入冰箱2–3分钟，以确保琼脂糖完全凝固。
5. 从模具中取出琼脂糖块（通过将其从切开的Eppendorf管中滑出）。用刀片切去两端多余的琼脂糖，切口应与肠道垂直。
6. 用胶将肠道/琼脂糖块的头端固定在振动切片机的金属载物台上。修去肠道/琼脂糖块两侧多余的琼脂糖。
7. 将金属载物台安装到振动切片机的样品腔中。如有必要，调整载物台角度，使肠道尽可能垂直（即与刀片垂直）。用冰冻的PBS覆盖样品。将切片刀降至缓冲液表面下方几毫米处。
8. 对最尾端的小肠进行200 μm厚度的振动切片机横切，确保每片琼脂糖切片均包含完整的肠段。

4. 肠道外植体的培养

1. 用镊子将新切割的肠/琼脂糖切片轻轻平放于胶原凝胶上，每个孔中放置一片，置于孔的中央位置。
2. 在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育3天，以允许神经嵴细胞（NCC）从外植块中迁移出来。
3. 用镊子非常轻柔地将肠/琼脂糖切片从胶原凝胶上取下，注意不要损伤下方的凝胶。
4. 在后续的孵育和洗涤步骤中，避免直接接触胶原凝胶，以确保细胞迁移模式不受干扰。每孔加入500 µl 4% 多聚甲醛（PFA）（溶于PBS中），室温固定1小时。
5. 将固定液替换为每孔500 µl DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液（5 µg/ml，溶于PBS中），室温孵育10分钟。
6. 每孔用500 µl PBS洗涤3次，每次5分钟。
7. 拍摄各孔胶原凝胶内嵌的荧光细胞（GFP和DAPI通道）图像。

5. 图像分析

我们广泛使用 ImageJ¹⁷ 对外植体培养后获得的图像进行处理和定量分析。

1. 首先在与荧光细胞照片相同放大倍数下拍摄微米尺标本的图像。使用“直线工具”测量一个微米所占的像素长度。
2. 设置标尺（分析/设置标尺；输入每微米对应的像素数）。
3. 对每张GFP荧光照片，将图像格式转换为8位灰度图（图像/类型/8位）。
4. 调整信号强度（图像/调整/亮度/对比度）。
5. 如有必要，减去背景噪声（处理/减去背景；调整滚动球半径）。
6. 设定阈值以突出显示细胞及细胞团块（图像/调整/阈值），然后应用分水岭算法分割团块（处理/二值化/分水岭）。
7. 分析颗粒以确定感兴趣区域（ROI）并生成细胞数量统计结果（分析/分析颗粒；设置最小尺寸以排除残余像素）。
8. 设置测量选项，包含Feret直径（分析/设置测量）。
9. 将ROI分组并整体测量，以确定Feret直径，作为细胞铺展程度的指标（分析/工具/ROI管理器/更多/OR，然后ROI管理器/添加，以及ROI管理器/测量）。

结果

以下结果代表了采用本文所述技术可获得的典型数据（图1）。使用生长因子（例如 GDNF）可促进表达GFP的肠源性神经嵴细胞从肠组织外植体迁移至胶原凝胶中（图2）。尽管在无生长因子存在时也有部分细胞从外植体中迁移出来，但这些细胞大多不表达GFP标记，代表的是被动迁移。为了准确记录实验结果，有必要将肠组织切片从胶原凝胶中移除，因为该组织仍含有大量荧光标记的细胞，否则会遮蔽位于下方胶原凝胶中的细胞。对这些结果的定量分析表明，在存在GDNF的情况下，胶原凝胶中出现的细胞数量显著增多，且发生了主动迁移（图3）。事实上，被动迁移的细胞通常位于外植体正下方，分布范围不超过肠切片的直径；而主动侵入胶原凝胶的细胞则会远离其起源位置，向更远区域扩散。

讨论

我们展示了如何利用我们的离体（ex vivo）组织块培养技术，在存在GDNF的条件下精确量化肠源性神经嵴细胞（NCC）的迁移潜能。与先前报道中使用近似大小的大块组织不同，采用200 μm厚的振动切片机制备的肠道切片可极大地方便此类精确量化^11,12,15。事实上，这种方法使我们能够在高度可重复的实验条件下处理适量的细胞。值得注意的是，从用于切割组织块切片的小肠最尾端区域中，荧光标记的肠源性NCC分布均匀，因此可对来自同一条肠道的多个切片进行分析（图1A）。此外，由于在此类实验中肠源性NCC和轴突均可能从组织中迁移出去¹¹，因此在培养结束时取出组织块，可使我们专注于分析迁移出的NCC。

最关键的步骤已在方案正文中说明，但由于肠外植体的健康状况对于获得健康的迁移神经嵴细胞至关重要，因此需格外注意。应避免胚胎组织经历突然的温度变化，尤其是在肠道包埋于琼脂糖中的步骤（步骤 3.3）。确保肠道处于室温，而琼脂糖在保持熔融状态的前提下尽可能冷却，以避免 "烹饪" 组织。肠外植体应在充...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 粉末	Wisent	219-010-XK
NaHCO3	Bioshop	SOB999	生物技术级
Steriflip 真空过滤系统（0.22 微米）	EMD Millipore	SCGP00525
青霉素-链霉素溶液，100 倍浓度	Wisent	450-201-EL
胎牛血清	Wisent	095-150	高品级
胶原蛋白 I 型	BD biosciences	354236
NaOH	Bioshop	SHY700	由 10 N 储存液稀释后经无菌过滤
GDNF	Cedarlane	CLCYT305
Falcon 24 孔板	BD biosciences	353047
解剖剪刀	Fisher Scientific	089515
玻璃培养皿	VWR	89000-306
PBS	Sigma	P5493	细胞培养级
解剖显微镜	Leica	M125
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11251-20
琼脂糖	Bioshop	AGA001	生物技术级
手术刀片	Feather	21
通用瞬干胶笔	Krazy Glue	KG824
HM 650V 振动切片机	Thermo Scientific	920110
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
特定试剂与设备列表。