一种快速高效评估致病性的方法 Ustilago maydis 在玉米和大刍草品系上

摘要

本文介绍了一种利用针头注射法将专性寄生真菌病原体Ustilago maydis接种于玉米和类蜀黍植物的方法。针头注射接种法可将真菌病原体精确地递送至植物叶片之间，病原菌在此处通过形成附着胞侵入植物体内。该方法效率高，能够实现U. maydis的可重复接种。

摘要

玉米是全球主要的谷类作物之一。然而，对活体营养型病原菌的易感性是提高其产量的主要限制因素。U. maydis 是一种活体营养型真菌病原体，也是引起玉米黑粉病的致病因子。该病害每年在美国造成约10亿美元的产量损失¹。目前用于控制玉米黑粉病的方法包括轮作、施用杀菌剂和种子处理等²。然而，寄主抗性是防控玉米黑粉病唯一可行的方法。已鉴定出包括玉米、小麦和水稻在内的多种抗不同活体营养型病原菌的作物品种，显著降低了每年的产量损失^3-5。因此，采用一种能够高效且可重复地将病原菌接种至植物叶片间的方法，将有助于快速鉴定对 U. maydis 具有抗性的玉米品系。作为鉴定抗 U. maydis 玉米品系的第一步，本研究采用针头注射接种法及抗性反应筛选法，对玉米、大刍草以及玉米×大刍草渐渗系材料接种 U. maydis 菌株，并筛选抗性植株。

玉米、大刍草及玉米与大刍草的渐渗系，共计约700株植物，被种植后接种了一种菌株 U. maydis，并进行抗性筛选。接种与筛选方法成功鉴定了3个对……具有抗性的类玉米品系 U. maydis. 本文介绍了一种针对玉米、大刍草及玉米与大刍草渗入系的详细针头注射接种及抗性反应筛选方案。本研究证明，针头注射接种法是农业中一种极为重要的工具，可高效递送 U. maydis 在植物叶片之间，并已提供了对……具有抗性的植物品系 U. maydis 可在育种计划中组合并测试，以提高抗病性。

引言

植物真菌病害是农业面临的最严重威胁之一。由于全球人口不断增长带来的粮食需求增加，培育具有更强抗病能力的作物变得愈发迫切。植物病原菌在田间会自然侵染农作物，引发病害，从而对作物产量产生负面影响⁶。研究表明，鉴定并利用抗病植株可提高抗性，减少产量损失。通过用植物病原菌接种植株并筛选抗性品系，已在多种植物物种中鉴定出抗性栽培品种，包括玉米、小麦、水稻和高粱⁷。因此，开发并应用高效的接种方法，将能够实现对大量植株进行接种和抗性筛选。目前已采用多种接种方法，包括浸渍接种、将病原菌细胞悬浮液用移液器滴加至植株心叶，以及针头注射接种^8-11。 无论采用何种方法，都必须将病原菌稳定地引入植株叶片之间，使其通过形成附着胞侵入植物组织，从而确保病原菌的发育和对植物的感染^12,13。

蘸染接种法是将植物幼苗浸入病原菌细胞悬浮液中，而移液接种法则需将病原菌细胞悬浮液滴加至植物幼苗的叶心部位。然而，这两种方法均存在若干问题。首先，两种方法均依赖病原菌从叶面自然侵入植物组织，而这一过程具有高度变异性。大多数病原菌通常通过植物叶片表面的气孔或伤口自然侵入植物体内，但病原菌经由气孔和/或叶片表面伤口穿透叶面的能力存在显著差异。因此，采用上述任一接种方法均难以控制病原菌的侵入过程，可能导致实验数据不一致。其次，在对大量植株进行筛选时，将幼苗逐个浸入病原菌细胞悬浮液中耗时较长，可能限制可处理的植株数量。相比之下，本文所述的针头注射接种法可将病原菌细胞悬浮液直接注入植物叶片之间，有利于促进侵染结构——附着胞的形成。¹⁴病原菌随后利用新形成的附着胞侵入植物，从而消除了病原菌穿透困难的问题。此外，针刺接种法可为接种后的玉米和大刍草植株提供一系列表型。 U. maydis 并表现出良好的侵染效果。这些表型可作为标记，用于确定病原菌细胞悬浮培养物的最佳浓度，从而在不同实验之间以及同一实验内部获得一致的植物表型。

在用病原菌细胞悬浮液接种植物后，通常需要对植物进行筛选，以检测其抗病或感病表型^8-11,15。尽管疾病评级量表已被广泛用于筛选和分类植物表型，但这些量表会因所分析的病原菌不同而有所差异。因此，针对U. maydis与玉米互作建立的疾病评级量表方案，也可用于类似的真菌病原菌研究¹⁶。

本系列实验方案详细介绍了利用U. maydis细胞悬浮培养物进行针头注射接种，以及对玉米、大刍草和玉米×大刍草渐渗系进行抗病反应筛选的方法。本方案不仅限于将U. maydis通过针头注射接种至玉米植株，也可适用于相对广泛的真菌病原体与植物物种。因此，在同一实验方案中同时提供这两种方法的详细步骤，可使研究人员能够直接应用这些方案进行接种与筛选，或根据目标病原体和植物物种的特点对原始方案进行适当调整和优化。

方案

1. 植物材料的培养

1. 选择用于接种和筛选的植株品系。本研究使用了两个玉米品系、五个大刍草品系以及四十个对U. maydis抗性尚未明确的玉米×大刍草杂交品系（表1）。
2. 为实验组（U. maydis注射）和对照组（水注射）的针头注射接种实验种植种子。每种植物品系均需进行此操作。
3. 在育苗盘中小心播种每种品系的四粒种子（重复四次），用手指将种子轻轻推入土壤约½英寸深，并薄覆一层土（图1A 和1B）。切勿压实种子上方的土壤。播种过深或压紧土壤可能影响幼苗出土。
4. 浇水使种子充分接触土壤。确保土壤完全湿润，且种子在浇水后仍保持在土层之下。
5. 浇水后，将植株置于生长室中，设置昼夜温度分别为28/20 °C，光周期为14/10小时，并使冠层顶部的光合有效辐射约为 500 μmol/m² sec 。白天和夜间的相对湿度分别维持在约70%和90%。
6. 将所有植株置于同一生长室中，以确保整个实验期间生长环境的一致性。
7. 10天后，将植株从生长室中取出，采用针头注射法接种U. maydis细胞悬浮培养物。注意：玉米植株可在播种后7天接种^8–10。然而，大刍草植株在7天时仍过小，因此为保证实验一致性，玉米和大刍草植株均在播种后10天进行接种（见步骤2.12）。

2. 针头注射接种

1. 所有操作均在超净工作台中进行。从冷冻保存中取出 U. maydis 甘油菌种。使用无菌接种环，将 U. maydis 野生型菌株 ½（交配型 a1b1）和 2/9（交配型 a2b2，与 ½ 近等基因型）的甘油菌种分别划线接种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上。不同菌株需分开培养。
2. 将接种有 U. maydis 的 PDA 平板置于 30 °C 培养箱中培养两天。若使用其他活体营养型病原菌，请采用相应的菌株、培养基和培养条件。在两天培养期间密切观察病原菌生长情况，确保 U. maydis 菌株生长良好。
3. 两天后从培养箱中取出 PDA 平板。平板上应有良好的病原菌生长，并形成单菌落（图 2A）。获得单菌落至关重要。若未形成单菌落，应以较低浓度重新划线接种。
4. 所有操作均在超净工作台中进行。使用无菌牙签从 PDA 平板上分别挑取各菌株的单菌落。将带有单菌落的牙签放入 3 ml 马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中。建议每种菌株制备 2–3 份培养物。
5. 将 3 ml PDB 培养物置于 30 °C 摇床培养箱中，200 rpm 振荡培养两天。在两天培养期间监测培养物生长情况，确保正常生长。培养物应呈现明显浑浊。
6. 从摇床培养箱中取出液体培养物，测定 OD₆₀₀ 值，确保细胞培养至 OD 1.0（约 1 × 10⁷ 个细胞/ml）¹⁷。
7. 用去离子水将 U. maydis 细胞悬浮培养物稀释至终浓度为 1 × 10⁶ 个细胞/ml，终体积为 30 ml。该浓度可稳定实现病原菌悬浮液对植物的良好侵染效果¹⁷。

注意：使用不同病原菌株时，应测试多种细胞悬浮液浓度，以确定接种所需的合适细胞滴度^18,19。 所提供的细胞悬浮培养液终浓度可作为滴定的起始参考。应通过观察具有良好侵染效果的植物表型来验证病原菌细胞悬浮培养液的合适浓度（图3A-E）。

8. 接种前将两种 U. maydis 菌株的培养物等体积混合。若仅使用一种病原菌株，则直接进入步骤2.9。每次接种实验均需制备新鲜的 U. maydis 细胞悬浮培养物，且细胞悬浮培养物使用不得超过两天，之后应丢弃。
9. 进行实验性针头注射接种时，将 U. maydis 细胞悬浮培养物抽入3 ml 注射器中，以填满注射器。
10. 进行对照性针头注射接种时，用去离子水¹⁷填满3 ml 注射器。其余操作步骤与实验性针头注射接种相同。
11. 在每个3 ml 注射器末端安装一支0.457 mm × 1.3 cm的皮下注射针头。所选针头尺寸可在将细胞悬浮液注入植物叶片之间时，最大程度减少对植物组织的损伤。
12. 播种后第10天，将实验组和对照组植株从生长室中取出，准备进行针头注射接种（图2B）（参见步骤1.7）。
13. 将装有 U. maydis 细胞悬浮培养物的皮下注射针头小心地以90°角插入实验植株茎部，位置略高于土面。插入针头至茎中部即可，切勿将针头完全穿透茎部（图2C）。
14. 向实验植株注入约100 μl的 U. maydis 细胞悬浮培养物^18,19。具体体积可因幼苗高度略有调整。细胞悬浮液将沿茎部向上推进并进入植株叶心。此时可在叶心中观察到细胞悬浮液的存在。继续对每株植物单独注射100 μl细胞悬浮培养物，直至3 ml 注射器排空为止。
15. 注射完成后，小心将针头从植株茎部拔出。从已排空的3 ml 注射器上取下针头，用去离子水重新填充注射器，再将针头重新安装至注射器上，推动水流通过针头，以清除可能堵塞针尖的植物组织碎片。
16. 对每株实验植株重复执行步骤2.9–2.15。对照组植株采用相同方案，仅以去离子水进行注射。
17. 将接种后的实验组和对照组植株放回生长室中。每日浇水，仅湿润土壤，避免接触植株组织。
18. 每日观察植株，监测病原菌发展情况及植株的抗性反应。

3. 抗性反应筛选

1. 在接种后 7、10、14 和 21 天（dpi），使用 1 至 5 的抗性反应评分等级对每株植物的抗性反应进行评分并记录（表 2）。随着评分等级数值的增加，病害严重程度也随之增加。1C（叶片黄化）、1A（叶片花青素产生）或 2（小型叶瘤）的抗性反应表明植物具有抗性；3（茎部瘤）、4（基部瘤）或 5（植株死亡）的抗性反应则表明植物感病（图 3A-E 和表 2）^18,19。
2. 对实验组和对照组植株均进行评分，并记录其抗性反应等级。
3. 比较实验组与对照组植株的抗性反应。选择抗性反应评分为 1C、1A 或 2 的实验组植株，这些植株被认为对 U. maydis^18,19 具有抗性。
4. 重复整个实验以验证植株表型。

结果

成功的针头注射接种可通过观察接种植物的表型来确定 U. maydis （实验性的）。大多数实验植株对...敏感 U. maydis 感染。感病植株表现出严重的病害发展，特征为茎部和基部形成瘿瘤，并产生黑色冬孢子（图3D 和 3E, 表2）。由于病害严重，部分植株在接种后死亡。三个对病害具有抗性的玉米 × 类蜀黍渐渗系 U. maydis 被鉴定出来。对于抗性植物 U. maydis，成功的接种表现为轻微的黄化、花青素产生或轻微的叶片虫瘿形成。图3A-C 和 表2).

为了验证实验植株所观察到的表型是由接种处理引起的，需比较实验组植株与对照组植株（接种水处理）的表型。实验组植株在叶片和/或茎部区域表现出如上所述的抗性或感性植株的病原菌发育特征。相反，对照组植株未表现出任何表型，植株非常洁净，植株任何部位均未出现病原菌发育现象，表明实验组植株上的病...

讨论

本研究成功采用针头注射接种法，将一株U. maydis接种至700株玉米和大刍草植株的茎秆中。此外，研究采用修订后的抗病性评级标准对植株进行筛选，以检测病原菌的发育情况。通过结合这两种方法，研究人员在700株玉米和大刍草植株中鉴定出对U. maydis具有抗性的植株品系，这些品系现可整合并用于育种项目，以进一步提升作物的抗病能力。

与大多数接种方法一样，在同一系列植株中重现相同抗性表型的能力至关重要。此外，相同的抗性表型必须在至少两次独立的实验中被观察到^20,21。由于获得植株表型（无论表现为抗性或感病）的能力主要取决于病原菌进入植物组织的能力，因此选择一种能够在每次接种时将病原菌准确递送至植物叶片之间的接种方法显得尤为重要。研究人员在使用活体营养型真菌病原菌（如U. maydis）进行针头注射接种时，常遇到以下几个常见问题：1）接种所用真菌病原菌浓度不当；2）在多次实验中无法重现表型；以及 3）缺乏标准化的抗性反应评分方法。以下将分别针对这些问题进行阐述。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
植物种子			来自原始杂交组合的采集
生长室	Conviron	PGR14 REACH-IN
育苗盘	Hummert International	14-3385-2
土壤（3份松树皮；1份含珍珠岩的泥炭藓）	Hummert International	10-1059-2
超净工作台	Lab Conoco	70875372
病原菌甘油菌种（U. maydis）或目标真菌病原菌			菌种由原始培养物扩增获得
无菌接种环	Fisher Scientific	S17356A
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板	Fisher Scientific	R454311
设定为30 °C的培养箱	Fisher Scientific	11-690-650F
无菌牙签	Walmart		购自Walmart，经高压灭菌处理
马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）	Fisher Scientific	ICN1008617
设定为30 °C的摇床培养箱	New Brunswick	14-278-179
分光光度计	Fisher Scientific	4001000
U. maydis 细胞悬浮培养液（1 × 106 个细胞/毫升）			按方法部分所述由甘油菌种培养获得
3 ml 注射器	Becton Dickinson	309606
0.457 mm × 1.3 cm 皮下注射针头	Kendall Brands	8881250321