活细胞成像观察α疱疹病毒的顺向运输与传播

摘要

活细胞成像技术可对α疱疹病毒感染过程中的定向运输和细胞间扩散等动态事件进行分析。本文介绍了利用表达荧光融合蛋白的重组病毒株，在原代神经元感染过程中实现病毒组装体可视化的方法。

摘要

活细胞荧光显微镜技术的进步，以及表达荧光融合蛋白的重组病毒株的构建，使得实时观察α疱疹病毒感染神经元过程中的运输与扩散成为可能。新型荧光融合蛋白在病毒膜、被膜和衣壳中的应用，结合活细胞成像技术，已识别出在轴突内进行运输的病毒颗粒组装体。类似工具已成功用于分析病毒颗粒在细胞间的传播，以定量评估在细胞间传递的病毒粒子数量与多样性。尤为重要的是，活细胞成像技术用于顺向运输与传播的研究可产生大量信息，包括病毒颗粒的运输速度、颗粒分布以及蛋白质定位的时间动态分析。结合经典的病毒遗传学技术，这些方法为理解重要的机制性问题提供了关键见解。本文详细描述了为解答α疱疹病毒运输与传播基本科学问题而发展出的成像方法。

引言

α-疱疹病毒（如单纯疱疹病毒1型、2型和伪狂犬病病毒）感染周围神经系统（PNS）的过程涉及病毒生命周期中多个复杂且高度调控的步骤。在初次病毒感染以及后续的宿主间传播过程中，病毒在PNS神经元内的运输至关重要。调控病毒生命周期中两个关键组分的分子机制——病毒组装体沿轴突从细胞体向外定向运输（顺向运输）以及随后病毒颗粒向易感细胞的传播（顺向扩散）——对于理解疱疹病毒的致病机制具有重要意义。

病毒颗粒在神经元中的运输与释放依赖于成熟感染性病毒体的组装^1,2。以往的研究采用固定样本的检测方法，包括免疫荧光（IF）和电子显微镜（EM），用于分析病毒颗粒的组装状态以及与病毒体运输和传播相关的蛋白质相互作用^3-6。然而，病毒体运输过程的动态特性以及化学固定所引入的实验假象，使得对固定样本图像的解读变得复杂^7,8。近年来，已报道多种对HSV和PRV病毒影响极小的病毒-荧光蛋白融合蛋白。绿色荧光蛋白（GFP）与红色荧光蛋白（mCherry或mRFP）常被配对使用，以实现对成熟病毒体三个结构组分中任意两个的成像：即衣壳、被膜和糖蛋白^9-11。利用双标记病毒进行活细胞成像，可直观显示病毒颗粒在运输过程中的组装状态。类似的表达荧光蛋白的病毒株也被用于观察病毒传播后病毒基因组的数量与多样性^12,13。荧光蛋白的特性（综述见^14,15）显著影响对病毒或细胞结构的可视化能力。....

方案

第1节 - 活细胞荧光显微镜的环境控制条件

1. 在进行任何成像实验前30分钟，连接并开始预热显微镜载物台顶部培养箱。
   1. 打开显微镜、透射光和落射荧光光源以及自动硬件控制系统。启动显微镜控制软件NIS Elements，连接显微镜并开始冷却EM-CCD相机。
   2. 将镜头加温器安装至合适的物镜上（60倍或100倍油镜）。注意：根据实验类型选择物镜。100倍微分干涉差（DIC）物镜最适合追踪顺向运输的病毒颗粒组装体，而60倍相差物镜适用于观察顺向扩散。低倍率、非油镜物镜无需使用镜头加温器，因其不与样品直接接触。
   3. 将载物台顶部培养箱安装到显微镜的电动载物台上。确保用于固定样品的适配插件已正确安装。将培养箱控制器的加湿空气管路连接至载物台顶部培养箱的进气口。
   4. 开启培养箱和镜头加温器的控制器，并将温度设定为先前已验证的、针对所用物镜和样品的特定条件（参见讨论部分）。
   5. 打开5% CO₂/95%大气混合气瓶的控制阀，向载物台顶部培养箱供应含CO₂的气体。气体流速应控制在每分钟60至80毫升。流速过快会导致样品严重脱水，即使使用了加湿腔室也无法避免。
2. 在物镜上添加镜油后，立即将待成像的培养样品放入载物台顶部培养箱中。
3. 使培养样品在培养箱中至少平衡10分钟。建议平衡1小时，特别是对于....

结果

顺行运输

将本方案应用于离体SCG培养物感染表达GFP-Us9和gM-mCherry膜融合蛋白的重组PRV 348株，有助于可视化病毒粒子的顺向运输过程（图3 和 补充影片4）。这些融合蛋白被整合到病毒颗粒中，可在运输斑点上被检测到，而上述成像条件在滤光片切换过程中最大限度地减少了移动颗粒上各荧光团之间的偏移。在三分钟的成像窗口内，通常可观察到大量运输斑点，并能快速生成用于共定位分析的大样本量数据。我们此前已利用该方法定量分析了α疱疹病毒轴突靶向蛋白GFP-Us9与其他结构蛋白的共定位情况¹¹。对其他双重组PRV株的类似分析也已有报道¹¹，近期研究进一步扩展了本方案，记录了PRV蛋白与荧光标记的宿主马达蛋白的共运输过程²¹。通过使用快速切换滤光轮和配对的多通带二向色镜，可实现两个或多个荧光通道的快速连续采集。目前我们可实现每秒高达0.8帧的双通道连续成像速度。对于仅受荧光曝光时间和相机读出时间限制的单通道视频显微镜，成像速率可超过每秒6帧。

讨论

活细胞成像的目标是在不显著干扰生物学过程本身的前提下，实时观察其动态变化。这一目标通过优化三个变量来实现：环境控制、成像速度和荧光照明。这些相互关联的变量必须取得平衡，才能获得可行的成像条件。本文所介绍的实验方案采用特定条件以获得代表性结果。在详细阐述具体方法之前，我们将简要讨论环境控制和观测造成的损伤。

在显微镜上建立并维持相关的生物学条件，对于成功监测细胞事件至关重要。实现目标条件依赖于显微镜与培养箱配置中多个特定变量。所有培养箱的设置都应通过在培养箱内对模拟样品进行独立的温度测量来验证，测量需在多个位置进行，包括：物镜接触点、培养皿中心以及培养皿边缘。应优化设置，以尽量减少超过37 °C达1 °C以上的区域，同时确保物镜接触点的温度尽可能接近37 °C。用于成像的每一种培养皿与物镜组合都必须在实验前经过测试和验证。理想情况下，应在成像过程中持续监测所有样品的温度，但对于许多系统而言这并不现实，尤其在使用生物危害性试剂时情况更为复杂。孵育条件的验证非常重要，因为样品在过高或过低的温度下孵育可能导致人为假象或细胞快速退化。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek Corporation; Ashland, MA	P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish	Ibidi USA LLC, Verona, WI	81156
显微镜主机	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
电动显微镜X-Y载物台	Prior Scientific; Rockland, MA	H117 ProScan Flat Top
电动滤光轮	Prior Scientific	HF110 10 position filter wheel
荧光照明光源	Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada	X-Cite 120Q
多波段荧光滤光片组	Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD相机	Andor Technology USA; South Windsor, CT	iXon3 897
Chamlide台面式活细胞培养箱	Live Cell Instruments; Seoul, South Korea	TC-L-10
物镜加热器	Bioptecs; Butler, PA	150803 Controller 150819-12-08 Heater
分析软件	Nikon Instruments Inc.; Melville, NY	NIS Elements