方法文章

一种利用种皮基质培养法进行遗传学研究的实验方法 体外 胚乳如何调控种子萌发 拟南芥

13.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50732

⸱

2013年11月9日

 , 
1Département de Botanique et de Biologie Végétale, Université de Genève

本文内容

摘要

我们介绍了组装种子 coat 床位测定法（SCBA）的步骤 拟南芥 种子。SCBA被证明是探索遗传学的有力工具 体外 胚乳如何在休眠种子中以及响应光信号时控制种子萌发。原则上，当怀疑胚乳影响胚胎生长时，均可应用SCBA。

摘要

的 拟南芥 胚乳由单层细胞构成，包裹在成熟胚胎的外围，在抑制休眠种子或远红光脉冲照射后的非休眠种子萌发过程中发挥关键作用。为了进一步深入了解胚乳所介导的萌发抑制作用背后的分子遗传机制，一项 "种皮基质" 已设计出一种种子包被分析法（SCBA）。SCBA 是一种解剖操作，通过物理方式将种皮与胚从种子中分离，从而可监测胚在下层种皮上的生长情况。值得注意的是，SCBA 能够在种子休眠以及远红光依赖性调控种子萌发的背景下，重建种皮对萌发的抑制活性。由于 SCBA 允许组合使用休眠、非休眠以及遗传修饰的种皮和胚组织，因此可解析控制萌发的遗传通路，特别是胚乳和胚中特异性发挥作用的通路。本文详细描述了构建 SCBA 的实验步骤。

引言

在拟南芥（Arabidopsis）成熟种子中，种皮由外层的种皮（testa）和内层的胚乳（endosperm）组成。种皮是一层来自母体的死组织，而胚乳是直接包围胚胎的一层活细胞组织1。胚乳和胚胎来源于不同的受精事件：胚乳为三倍体组织，包含两份母本基因组和一份父本基因组，而胚胎为二倍体组织，包含一份母本基因组和一份父本基因组2。

传统上认为胚乳的主要功能是作为营养组织。然而，越来越多的证据表明，胚乳在调控种子萌发过程中也发挥着核心作用。这一观点最初在种子休眠现象中得以显现，休眠是新形成种子表现出的一种特性。休眠种子即使处于适宜的萌发条件下也无法萌发。种子在经过一段后熟期后会失去休眠特性，转变为非休眠状态，即在适宜的萌发条件下能够萌发。在包括模式植物Arabidopsis在内的许多植物物种中，种皮对于阻止休眠种子萌发至关重要，因为去除种皮会触发胚的生长和转绿3,4。在Arabidopsis中，Bethke et al. 观察到，即使去除了外种皮（testa）但仍保留包围胚的胚乳时，萌发仍受到抑制5。这些结果强烈表明，胚乳是种皮内部对胚起抑制作用的组织。然而，去除种皮的实验并不一定有助于阐明种皮所提供的萌发抑制作用的本质，也无法明确执行该功能的基因。

我们近期引入了一种种皮铺垫实验法（seed coat bedding assay, SCBA），该方法将种皮与胚体进行物理分离，但保持二者紧密相邻，从而维持由胚乳提供的抑制萌发活性6。SCBA 可组合使用休眠、非休眠以及遗传修饰的种皮和胚体材料，进而解析控制种子萌发、并在胚乳和胚体中特异性发挥作用的遗传通路。在休眠研究中，SCBA 被用于证明胚乳向胚体释放植物激素脱落酸（abscisic acid, ABA），以抑制胚的生长6。此外，我们还可利用 SCBA 鉴定在胚乳和胚体组织中促进休眠的信号转导通路。

通过考察非休眠种子暴露于远红光（FR）脉冲的情况，进一步证实了胚乳在调控萌发中的作用。种子吸胀早期，远红光脉冲已知可抑制种子萌发7,8。当去除种子的种皮后，远红光脉冲无法抑制萌发，这强烈表明胚乳同样能够抑制非休眠种子的萌发9。值得注意的是，分离的胚培养法（SCBA）也可用于重现远红光依赖性的萌发抑制效应。这使得研究者得以证明，远红光依赖性的种子萌发抑制过程同样涉及胚乳中脱落酸（ABA）的释放9。此外，利用SCBA还能够鉴定出在胚乳和胚胎中分别发挥作用、响应光信号以调控非休眠种子萌发的不同光信号通路9,10。

因此，SCBA 似乎是研究胚乳在种子萌发调控中功能的一种可靠技术，也是一种评估 体外 验证被怀疑控制萌发的基因是在胚乳、胚胎还是两种组织中发挥作用。本文详细介绍了组装SCBA所需的各个步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

SCBA组装完成后，需在数天内持续监测胚胎的生长情况。因此，在进行种子解剖及SCBA组装之前，必须对种子进行灭菌处理，以避免后续污染，从而确保能够准确评估种皮材料对胚胎生长的影响。

1. 种子灭菌

  1. 加入50–60 μl成熟且干燥的 拟南芥 将种子置于1.5 ml 微型离心管中，并配制70%乙醇溶液。
  2. 向含有种子的微量离心管中加入1 ml 70%乙醇溶液，在涡旋振荡器中于室温下以1,200 rpm振荡10分钟。
  3. 将微量离心管在4,000 × g条件下离心3秒，使种子沉降至管底。
  4. 使用真空吸头吸除70%乙醇溶液 小心地将种子留在微量离心管底部。
  5. 向仍含有种子的微量离心管中加入1 ml无菌蒸馏水。
  6. 室温下以1,200 rpm振荡10分钟。
  7. 将微量离心管在4,000 × g下离心3秒，使种子沉降至管底。使用真空吸头小心吸除上清液，保留管底的种子。
  8. 向仍含有种子的微量离心管中加入1 ml无菌蒸馏水。确保水流使种子在管内均匀悬浮。此步骤的目的是避免进一步振荡，以保持种子的完整性。
  9. 让种子在试管底部静置30秒，通过重力自然沉降。使用真空吸头小心吸除上清液，避免扰动试管底部的种子。
  10. 重复步骤 1.8 - 1.9 四次。整个灭菌过程约需 30 分钟。

2. 种子接种

所有后续步骤均在超净工作台内进行，以保持无菌条件。

  1. 准备一个培养皿（直径100 mm，高20 mm），其中含有30 ml萌发培养基。萌发培养基的制备方法为：将含有4.3 g/L Murashige和Skoog培养基、2.5 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES-KOH；pH 5.7）和0.8 g/L琼脂的溶液进行高压灭菌，然后将溶液置于50 °C水浴中冷却，再倒入培养皿中。
  2. 向含有种子的离心管中加入200 μl无菌蒸馏水。重悬种子，并使用带1 ml吸头的标准移液器将种子转移至萌发培养基表面。
  3. 使用真空吸头除去种子周围萌发培养基表面的水分。
  4. 将盛有种子的培养皿在超净工作台内打开盖子放置2小时，以进一步干燥。随后盖上培养皿盖子，继续在超净工作台内静置约90分钟，使自种子消毒程序开始（步骤1.2）以来总时间达到约4小时。

3. 种子解剖

以下步骤需在超净工作台内的体视显微镜下操作。使用5号Dumont镊子（尖端截平）即 钝头）尖端能极大地方便种子的操作（图1A).

  1. 准备一个新的培养皿，内含30 ml萌发培养基。将两张相邻的矩形无菌Whatman 3MM滤纸（1.5 cm × 1.0 cm）放置在培养基表面。 图1B，步骤1）。Whatman 3MM 滤纸在高压灭菌器中灭菌。
  2. 使用无菌镊子将种子转移到Whatman 3MM滤纸上图1B，步骤 2）。
  3. 用截短镊子的并置钝端轻轻按压种子，将单粒种子固定在Whatman 3MM滤纸上图1B，步骤 3）。
  4. 使用注射器针头切开种子的种皮（种皮和胚乳）例如 U100 胰岛素注射器 + 1 ml 注射器，0.33 mm（29 G）× 12.7 mm图1B，步骤4）。形状的 拟南芥 种子呈椭球形，建议沿种子最长半主轴方向切割种皮，切口应尽可能靠近子叶与胚根连接处即 远离根尖）。这有助于在解剖过程的下一步中安全地释放胚胎。
  5. 用截短镊子的并置钝端将种子压在Whatman 3MM滤纸上图1B，步骤5）。此步骤通过3.4步骤中产生的开口将胚胎从种皮中释放出来（图1B，步骤6）。建议在子叶尖端最靠近胚根尖端的部位对种子施加推力（即 远离开口处）。

4. 种皮培养基测定法（SCBA）的组装

有关种子外壳和胚胎数量的适当选择，请参见讨论部分。

  1. 准备一个新的培养皿，内含30 ml萌发培养基。在培养基表面放置一片无菌的尼龙网矩形片（3.5 cm × 5.0 cm）。 (图2，步骤1）。
  2. 为避免损伤，可使用注射器针头轻轻推动，将胚胎和种皮移至镊子的金属边缘表面。图2，步骤2）。将胚胎和种皮转移到尼龙网膜上（图2，步骤 3）。
  3. 使用钝头镊子和针将种皮组装成一个紧密排列的单层环形结构，确保种皮之间尽可能紧密接触（图2，步骤4）。尽量充分暴露针头向上刺出的种皮开口。此步骤尚未经过系统性测试，但可能提高SCBA的效率，因为抑制胚生长的可扩散物质预计将直接向胚外扩散，而非远离胚。
  4. 将胚胎以单层环形排列，放置于第4.3步制备的种皮床中央。图2，步骤5）。确保胚胎尽可能彼此靠近。
  5. 在持续光照（40 μmol/m²/s）条件下孵育SCBA2sec在20–21 °C条件下进行。若使用远红光脉冲（FR脉冲）抑制萌发，则在正常光照下组装SCBA，随后按所述方法施加远红光脉冲9 并将培养皿置于黑暗环境中。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

先前的研究表明，无法合成赤霉素（GA）的突变体种子由于种子中脱落酸（ABA）大量积累而不能萌发11,12。然而，这种萌发障碍依赖于种皮的存在，因为去除种皮可触发胚的生长13。这强烈表明，无法合成GA的种子的胚乳会释放ABA以抑制胚的生长。因此，我们预期在种子包被活性测定（SCBA）中，无法合成GA的种皮会抑制胚的生长，而无法同时合成GA和ABA的种皮则不会表现出这种抑制作用。本研究中使用的是携带T-DNA插入、破坏了编码ent-贝壳杉烯二磷酸合酶的GA1基因（登录号AT4G02780）的ga1-21（Salk插入系Salk_109115）突变体种子，该酶是GA生物合成所必需的14。GA1基因（Col生态型）中的SALK_109115插入系信息可在SALK SIGnAL数据库中查到15（http://signal.salk.edu/）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

种子 coat 床培法（SCBA）方案在原理上适用于任何需要 拟南芥 种子萌发受阻（或延迟），且怀疑由胚乳介导了这种抑制作用。后者可通过去除种皮（种皮和胚乳）并观察到胚胎生长速度较其被种皮包裹时显著加快来证实。萌发可能因特定环境物理参数而受到抑制例如 水势或光质）或特定遗传背景中例如 赤霉素合成缺失，如 ga1 突变体，参见 图3).

关于SCBA实验中所需使用的种皮和胚的数量，目前尚无通用规则。这取决于种子批次（尤其是其新鲜程度）以及所要进行的实验类型。因此，关键在于通过每天观察胚在种皮层上的生长情况，针对每种具体情况调整所用解剖材料的用量。然而，通常在使用高度休眠的Arabidopsis生态型时，仅需少量种皮即可。以下展示的是在组装SCBA时成功使用过的种皮与胚的典型用量：

含休眠种子材料的SCBA6：
* 新鲜收获（即休眠状态）的佛得角群岛生态型（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了瑞士国家科学基金会和日内瓦州的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Thermomixer ComfortEppendorf AG5355 000.011Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe ComfortINTEGRA Biosciences AG158 310Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
培养皿（100 mm × 20 mm）Greiner Bio-One GmbH664 102Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige 和 Skoog 培养基Sigma-AldrichM5524Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MESSigma-AldrichM3671Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
琼脂（植物琼脂）Duchefa Biochemie B.V.P1001Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont 镊子 #5Fine Science Tools GmbH11251-10Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
注射器针头BD Micro-Fine324827BD, Franklin Lakes, NJ USA
尼龙筛网（SEFAR NYTEX）SEFAR AG03-50/31Sefar AG, Heiden, Switzerland
生长培养箱CLF Plant ClimaticsPercival I-30BLLXCLF plant Climatics, Wertingen, Germany
多效唑（Paclobutrazol）Sigma-Aldrich46046Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA

参考文献

  1. Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
  2. Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026(2002).
  3. Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -M. Seed development, dormancy and germination. , Blackwell Publishing. 25-43 (2007).
  4. Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
  5. Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
  6. Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
  7. Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
  8. Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
  9. Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
  10. Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
  11. Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
  12. Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
  13. Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
  14. Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
  15. Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
  16. Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章