我们介绍了组装种子 coat 床位测定法（SCBA）的步骤 拟南芥 种子。SCBA被证明是探索遗传学的有力工具 体外 胚乳如何在休眠种子中以及响应光信号时控制种子萌发。原则上，当怀疑胚乳影响胚胎生长时，均可应用SCBA。
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本文内容
摘要
摘要
的 拟南芥 胚乳由单层细胞构成，包裹在成熟胚胎的外围，在抑制休眠种子或远红光脉冲照射后的非休眠种子萌发过程中发挥关键作用。为了进一步深入了解胚乳所介导的萌发抑制作用背后的分子遗传机制，一项 "种皮基质" 已设计出一种种子包被分析法（SCBA）。SCBA 是一种解剖操作，通过物理方式将种皮与胚从种子中分离，从而可监测胚在下层种皮上的生长情况。值得注意的是，SCBA 能够在种子休眠以及远红光依赖性调控种子萌发的背景下，重建种皮对萌发的抑制活性。由于 SCBA 允许组合使用休眠、非休眠以及遗传修饰的种皮和胚组织，因此可解析控制萌发的遗传通路，特别是胚乳和胚中特异性发挥作用的通路。本文详细描述了构建 SCBA 的实验步骤。
引言
在拟南芥（Arabidopsis）成熟种子中，种皮由外层的种皮（testa）和内层的胚乳（endosperm）组成。种皮是一层来自母体的死组织，而胚乳是直接包围胚胎的一层活细胞组织1。胚乳和胚胎来源于不同的受精事件：胚乳为三倍体组织，包含两份母本基因组和一份父本基因组，而胚胎为二倍体组织，包含一份母本基因组和一份父本基因组2。
传统上认为胚乳的主要功能是作为营养组织。然而，越来越多的证据表明，胚乳在调控种子萌发过程中也发挥着核心作用。这一观点最初在种子休眠现象中得以显现，休眠是新形成种子表现出的一种特性。休眠种子即使处于适宜的萌发条件下也无法萌发。种子在经过一段后熟期后会失去休眠特性，转变为非休眠状态，即在适宜的萌发条件下能够萌发。在包括模式植物Arabidopsis在内的许多植物物种中，种皮对于阻止休眠种子萌发至关重要，因为去除种皮会触发胚的生长和转绿3,4。在Arabidopsis中，Bethke et al. 观察到，即使去除了外种皮（testa）但仍保留包围胚的胚乳时，萌发仍受到抑制5。这些结果强烈表明，胚乳是种皮内部对胚起抑制作用的组织。然而，去除种皮的实验并不一定有助于阐明种皮所提供的萌发抑制作用的本质，也无法明确执行该功能的基因。
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方案
SCBA组装完成后，需在数天内持续监测胚胎的生长情况。因此，在进行种子解剖及SCBA组装之前，必须对种子进行灭菌处理，以避免后续污染，从而确保能够准确评估种皮材料对胚胎生长的影响。
1. 种子灭菌
- 加入50–60 μl成熟且干燥的 拟南芥 将种子置于1.5 ml 微型离心管中，并配制70%乙醇溶液。
- 向含有种子的微量离心管中加入1 ml 70%乙醇溶液，在涡旋振荡器中于室温下以1,200 rpm振荡10分钟。
- 将微量离心管在4,000 × g条件下离心3秒，使种子沉降至管底。
- 使用真空吸头吸除70%乙醇溶液 小心地将种子留在微量离心管底部。
- 向仍含有种子的微量离心管中加入1 ml无菌蒸馏水。
- 室温下以1,200 rpm振荡10分钟。
- 将微量离心管在4,000 × g下离心3秒，使种子沉降至管底。使用真空吸头小心吸除上清液，保留管底的种子。
- 向仍含有种子的微量离心管中加入1 ml无菌蒸馏水。确保水流使种子在管内均匀悬浮。此步骤的目的是避免进一步振荡，以保持种子的完整性。
- 让种子在试管底部静置30秒，通过重力自然沉降。使用真空吸头小心吸除上清液，避免扰动试管底部的种子。
- 重复步骤 1.8 - 1.9 四次。整个灭菌过程约需 30 分钟。
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结果
先前的研究表明，无法合成赤霉素（GA）的突变体种子由于种子中脱落酸（ABA）大量积累而不能萌发11,12。然而，这种萌发障碍依赖于种皮的存在，因为去除种皮可触发胚的生长13。这强烈表明，无法合成GA的种子的胚乳会释放ABA以抑制胚的生长。因此，我们预期在种子包被活性测定（SCBA）中，无法合成GA的种皮会抑制胚的生长，而无法同时合成GA和ABA的种皮则不会表现出这种抑制作用。本研究中使用的是携带T-DNA插入、破坏了编码ent-贝壳杉烯二磷酸合酶的GA1基因（登录号AT4G02780）的ga1-21（Salk插入系Salk_109115）突变体种子，该酶是GA生物合成所必需的14。GA1基因（Col生态型）中的SALK_109115插入系信息可在SALK SIGnAL数据库中查到15（http://signal.salk.edu/）。
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讨论
种子 coat 床培法（SCBA）方案在原理上适用于任何需要 拟南芥 种子萌发受阻（或延迟），且怀疑由胚乳介导了这种抑制作用。后者可通过去除种皮（种皮和胚乳）并观察到胚胎生长速度较其被种皮包裹时显著加快来证实。萌发可能因特定环境物理参数而受到抑制例如 水势或光质）或特定遗传背景中例如 赤霉素合成缺失，如 ga1 突变体，参见 图3).
关于SCBA实验中所需使用的种皮和胚的数量，目前尚无通用规则。这取决于种子批次（尤其是其新鲜程度）以及所要进行的实验类型。因此，关键在于通过每天观察胚在种皮层上的生长情况，针对每种具体情况调整所用解剖材料的用量。然而，通常在使用高度休眠的Arabidopsis生态型时，仅需少量种皮即可。以下展示的是在组装SCBA时成功使用过的种皮与胚的典型用量：
含休眠种子材料的SCBA6：
* 新鲜收获（即休眠状态）的佛得角群岛生态型（.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了瑞士国家科学基金会和日内瓦州的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| 培养皿（100 mm × 20 mm） | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige 和 Skoog 培养基 | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| 琼脂（植物琼脂） | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont 镊子 #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| 注射器针头 | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| 尼龙筛网（SEFAR NYTEX） | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| 生长培养箱 | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| 多效唑（Paclobutrazol） | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
参考文献
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plant....
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