通过使用 13C-葡萄糖的DNA稳定同位素示踪法鉴定广食性昆虫Spodoptera littoralis肠道中具有代谢活性的细菌

摘要

通过稳定同位素示踪（SIP）结合焦磷酸测序技术，确定了与埃及棉铃虫（Spodoptera littoralis）肠道相关的活性细菌群落。利用该方法，能够以高分辨率和高精确度鉴定群落中具有代谢活性的细菌种类。

摘要

大多数昆虫的肠道内栖息着复杂的共生非致病性细菌群落。在这些微生物群落中，可以识别出共栖或互利共生的细菌种类。后者已被发现对昆虫具有多种功能，例如协助昆虫繁殖¹、增强免疫反应²、信息素的产生³，以及营养供给，包括必需氨基酸的合成^4,等。   

由于这些关联的重要性，人们已做出诸多努力以表征这些群落中的各个成员。然而，这些努力大多基于培养方法，或依赖于生成用于最终鉴定的16S rRNA基因片段测序。遗憾的是，这些方法仅能鉴定肠道中存在哪些细菌物种，而无法提供有关微生物代谢活性的任何信息。

为了表征昆虫肠道中具有代谢活性的细菌种类，我们采用稳定同位素示踪（SIP）技术在活体（in vivo）条件下使用¹³C-葡萄糖作为通用底物。这是一种具有前景的无需培养的技术，能够将微生物的系统发育与其特定的代谢活性关联起来。通过追踪从底物进入微生物生物标志物（如DNA和RNA）中的稳定同位素标记原子，即可实现这一目标⁵。当¹³C同位素掺入DNA后，标记DNA的密度高于未标记的（¹²C）DNA。最终，通过密度梯度超速离心将¹³C标记的DNA或RNA与¹²C未标记的同类分子分离开来⁶。对分离得到的核酸同位素异构体进行后续分子分析，便可建立代谢活性与物种身份之间的联系。

本文介绍了用于表征广食性昆虫（我们的模式系统）Spodoptera littoralis（Lepidoptera, Noctuidae）肠道中代谢活跃细菌的实验方案。通过焦磷酸测序技术对DNA进行系统发育分析，实现了对昆虫肠道菌群的高分辨率和高精度鉴定。实验中以¹³C标记的葡萄糖作为主要底物，并通过人工饲料将其饲喂给昆虫。

引言

已知有大量昆虫物种与细菌存在共生关系⁷在这些共生关系中，微生物在昆虫的生长和发育过程中发挥着重要作用。研究表明，微生物有助于昆虫的繁殖¹，信息素生物合成³，营养，包括必需氨基酸的合成⁴以及对宿主难以消化的食物进行分解。尽管肠道细菌与昆虫的共生关系种类繁多，但关于这些共生关系对昆虫有益功能作用的研究仍相对较少。只有在白蚁中，由原核生物、原生动物和真菌共同参与的木质纤维素共生消化过程得到了广泛研究。^8,9相比之下，关于广食性昆虫肠道中存在的共生关系，目前了解甚少 即 棉铃虫， Spodoptera littoralis 此外，由于广食性昆虫经常更换寄主植物，其肠道相关细菌群落也持续面临与其取食习性相关的新挑战，即摄食含有多种植物次生代谢物的植物。除此之外，鳞翅目昆虫的肠道环境代表 本身 由于肠道pH值较高，对细菌生长构成严苛的环境¹⁰。尤其是在以下情况 S. littoralis，其范围从前肠的10.5， 约 中肠的pH为9，后肠的pH接近7¹¹另一方面，与肠道相关的细菌群落 S. littoralis 很简单。Tang，Freitak， 等¹² 报道了与该昆虫相关的细菌群落中仅包含属于7种不同细菌物种的最多36种菌型。此外，该昆虫在实验室培养过程中无需复杂的饲养程序。再加上其较短的生活周期，便于开展多代研究，使其成为研究肠道微生物互作的理想模式系统。

随着基于PCR的测序技术的发展，针对多种生物（例如人类、昆虫或海洋生物）肠道菌群的研究数量显著增加。此外，与过去不同，这些研究结果不再依赖于肠道细菌的分离与培养。几乎99%的细菌无法被培养，且模拟肠道内环境条件十分困难¹²。通过使用PCR技术，可以从肠道菌群的混合DNA模板中选择性地扩增16S rRNA基因片段（该基因为细菌中广泛使用的系统发育标记基因），随后进行测序和克隆。利用这些信息，用户可通过比对公共数据库中的序列数据来鉴定细菌种类^13,14。然而，由于缺乏关于群落中各个物种内在代谢贡献的信息，目前的测序方法在描述细菌群落时仍存在局限性。

稳定同位素探针技术（SIP）是一种具有前景的免培养方法，常用于环境微生物学中分析与特定代谢活动相关的微生物系统发育。该技术通过追踪从标记底物中进入微生物生物标志物（如磷脂衍生脂肪酸、DNA 和 RNA）的稳定同位素标记原子来实现这一目标。⁵在考虑核酸时，该方法基于分离 ¹³通过密度梯度超速离心法将C标记的DNA或RNA与未标记的DNA分离⁶由于DNA标记与代谢活性之间存在这种直接关联，下游­核酸的流式分子分析可鉴定物种并提供有关代谢活性的信息。此外，Pilloni、von Netzer 等人应用的DNA-SIP与焦磷酸测序相结合的方法， 等¹⁵，可实现对大量存在的细菌种类进行特定、简单且灵敏的鉴定 ¹³C标记的DNA组分。迄今为止，该技术已用于描述在好氧条件下土壤中参与生物地球化学过程的细菌群落^16,17 和厌氧条件^18,19除了在环境科学中的应用外，该技术还已被Reichardt报道应用于医学科学领域。 等⁵，描述了人类肠道微生物群中不同系统发育类群在应对不可消化碳水化合物时的代谢活性。

这里我们使用 ¹³C-葡萄糖用于标记肠道中代谢活跃的细菌物种的DNA。葡萄糖是一种大多数细菌物种通过广泛存在的Entner-Doudoroff（ED）途径利用的糖类，尽管已知存在例外情况²⁰这证明了使用 ¹³C-葡萄糖作为一种可靠的代谢探针，可在既定代谢通路中建立目标代谢物与碳源之间的关联。根据具体科学问题的不同，也可选用其他底物， 即 ¹³C-甲烷， ¹³CO₂，或在以下条件下培养的植物 ¹³CO₂ 大气可用于研究代谢活动。

在此，我们介绍了一种用于广食性昆虫S. littoralis（Lepidoptera, Noctuidae）肠道菌群代谢特征分析的实验方案。此外，该技术结合了焦磷酸测序法，能够以高分辨率和高精确度鉴定昆虫肠道细菌群落。实验中使用的主要底物为¹³C标记的葡萄糖。

方案

1. 昆虫饲养

1. 从自养的埃及棉铃虫（Spodoptera littoralis）中获取或购买卵块。将卵块置于无菌培养皿中，在室温（RT）下保存直至孵化。
2. 按以下步骤配制昆虫人工饲料：
   1. 将500 g磨碎的白豆用100 ml水浸泡过夜。
   2. 在1,000 ml蒸馏水H₂O中加入9.0 g抗坏血酸和75 g琼脂，随后煮沸。
   3. 让混合物冷却，待其凝固成白色蜡状固体后，于4 °C保存备用。
3. 将刚孵化的幼虫转移至洁净的塑料盒中，在23–25 °C、长日照条件下（16小时光照，8小时黑暗）以人工饲料饲养。每日更换饲料，直至幼虫完成全部六个龄期的发育。

2. 代谢活跃肠道细菌DNA的¹³C标记

1. 取186.1 mg完全¹³C标记的葡萄糖，用去离子蒸馏水（ddH₂O）溶解，并与100 g人工饲料充分混合，用于SIP实验。确保人工饲料中¹³C-葡萄糖的终浓度为10 mM。该浓度模拟了取食棉花植株的S. littoralis幼虫肠道内in situ的葡萄糖浓度，依据Shao et al.（已投稿）的研究。
2. 从饲养盒中转移9–15头健康的二龄幼虫至无菌塑料培养皿中（每皿一头幼虫），培养皿内含添加了¹³C-葡萄糖的新鲜人工饲料。对照组饲喂含等量天然葡萄糖（¹²C-葡萄糖）的人工饲料，其他条件相同。
3. 在培养期间（1天）定期更换人工饲料。培养条件同第1.3步所述。
4. 每种处理分别采集九头幼虫用于后续处理（DNA提取）。每个重复由三个个体组成；每种处理至少设置三个重复。

3. 昆虫解剖

1. 实验开始时，使用70%乙醇对解剖工具进行清洁和消毒（工具包括：Vannas剪刀、镊子以及带有精细一次性刀片的解剖刀）。
2. 用软镊子夹取昆虫，并用蒸馏水对其体表进行表面清洗。将昆虫置于冰上至少30分钟以使其麻醉。
3. 在保持麻醉状态下，将昆虫置于0 °C环境中1小时以处死。通过将死亡的昆虫浸入70%乙醇中数分钟，对其进行体表消毒。
4. 在无菌培养皿中加入约15 mL的1×PBS缓冲液（1×PBS = 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、4.3 mM Na₂HPO₄、1.47 mM KH₂PO₄，调节pH至7.4，经高压灭菌），并在其中进行昆虫解剖。确保在整个解剖过程中，昆虫整个身体完全浸没于溶液中。
5. 从头部开始，沿昆虫左右两侧向肛门方向做切口，开始解剖。完整去除体壁、马氏管和脂肪体。在切开肠道前更换为新鲜缓冲液。根据需要将肠道分为前肠、中肠和后肠。将组织储存于冷冻环境（-80 °C至-20 °C）中，直至进行DNA提取。

4. DNA 提取与扩增

1. 将昆虫组织置于1.5 ml无菌离心管中，使用真空浓缩仪在45 °C下将所有样品干燥。用无菌塑料研磨棒研碎干燥组织。
2. 使用适用于土壤DNA提取的试剂盒提取基因组DNA。将干燥的组织转移至试剂盒的反应管中，并按照制造商提供的说明进行操作。
3. 使用分光光度计测定最终洗脱DNA的浓度。
4. 通过使用通用真细菌引物 27f（5- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3）和 1492r（5- GGTTACCTTGTTACGACTT -3）进行PCR扩增，验证昆虫肠道微生物宏基因组DNA提取是否成功。PCR反应体系设置如下：
   1. 设置一个50 µl的反应体系，包含1x缓冲液、1.5 mM MgCl₂、0.2 mM每种dNTP、0.2 µM每种引物、1 U DNA聚合酶和10 ng模板DNA。₂，10 mM 四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），2.5 U Taq DNA 聚合酶，每种引物 0.5 mM，以及 60 ng 提取的 DNA 作为模板。
   2. 使用PCR仪进行PCR反应，程序如下：94 °C预变性3 min；随后进行35个循环：94 °C变性45 sec，55 °C退火30 sec，72 °C延伸1 min；最后72 °C延伸10 min。
   3. 通过1%琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭EB染色）验证PCR扩增是否成功（将1 g琼脂糖溶于100 ml 1x TAE缓冲液中，加入1 µl EB染色）。取5 µl PCR产物与1 µl 6x上样缓冲液混合后加入凝胶加样孔中。（1x TAE = 40 mM Tris-Base，20 mM冰醋酸，1 mM EDTA，调节pH至8）。
   4. 使用1xTAE缓冲液，300 V、115 mA条件下电泳运行凝胶 ca在电泳槽中电泳20分钟。使用凝胶成像系统（连接数字相机和计算机的紫外透射仪）观察凝胶，并将最终产物的条带大小与同时上样的基因标记物进行比较；扩增产物的正确大小应约为1.5 kb。
5. 将PCR产物于深冻条件下保存，优先选择-80 °C，直至使用。

5. DNA 分离——氯化铯梯度超速离心法

1. 按如下步骤准备用于超速离心的梯度试剂：
   1. 通过将603.0 g氯化铯（CsCl）逐渐溶解于ddH₂O中，并定容至500 ml，配制7.163 M的氯化铯（CsCl）溶液。
   2. 使用三位数精度天平，对1.0 ml该CsCl溶液进行三次重复称重，准确测定其密度。室温下该密度通常介于1.88至1.89 g/ml之间。
   3. 通过将50 ml 1 M Tris-HCl（pH 8.0）、1 ml 0.5 M EDTA（pH 8）和3.75 g KCl溶于ddH₂O并定容至500 ml，配制梯度缓冲液（100 mM Tris、100 mM KCl和1 mM EDTA）。使用0.22 µm滤膜过滤除菌，并进行高压灭菌处理。
2. DNA分离
   1. 根据第4.3步测定的处理后昆虫个体DNA浓度，将属于同一次重复实验的昆虫样本合并，并将其DNA浓度归一化，以确保每个样本对混合样品的贡献相等。最终DNA浓度为500–5,000 ng（需再次测定最终浓度）适用于超速离心过程²¹。
   2. 配制梯度介质：将定量的DNA、梯度缓冲液和4.8 ml 7.163 M CsCl溶液混合，总体积为6.0 ml，置于无菌15 ml螺口离心管中（形成梯度介质-DNA混合液）。
   3. 使用注射器和针头，小心地将制备好的梯度介质-DNA混合液转移至5.1 ml超速离心管中（填充至管颈底部）。避免产生气泡或剧烈泵送。每次离心运行中至少设置一个空白梯度对照（以ddH₂O代替DNA），作为参考梯度。
   4. 将各超速离心管填充所需梯度介质后，配对平衡，使每对管之间的重量差异不超过10 mg。使用"Tube Topper"密封管口，并通过倒置离心管并手动施加适度压力，确保密封无泄漏。
   5. 使用具有八个孔位的近垂直转子，用于装载5.1 ml超速离心管进行超速离心。按照制造商说明小心密封转子孔位，并将转子装入超速离心机。设定超速离心条件：转速50,000 rpm（约177,000 × g），温度20 °C，真空条件下运行40小时。选择最大加速度和无刹车减速模式。
   6. 离心结束后，使用镊子小心从转子中取出离心管，置于试管架中，避免扰动管内已形成的梯度。应尽快处理梯度分馏样品，以尽量减少扩散效应。
3. 通过分馏法从等密度分离梯度中回收DNA
   1. 使用精确的高效液相色谱（HPLC）泵系统进行梯度分馏，该系统可通过从超速离心管顶部置换液体的方式均匀分离梯度。将HPLC泵（100%流速梯度）连接至装有1 L置换用ddH₂O的瓶子，并用23 G 1英寸长针头紧密连接泵管。向ddH₂O中加入足量溴酚蓝染料，使其呈现深蓝色，以便于观察梯度介质与ddH₂O置换界面。
   2. 将泵流速设定为850 µl/min，并平衡系统，直至针头末端滴出单滴蓝色ddH₂O为止。
   3. 将超速离心管小心固定于铁架台上，用23 G 1英寸长针头刺穿管底。将泵连接至超速离心管：将连接泵管的针头插入离心管顶部，直接从管底收集液滴至无菌1.5 ml微量离心管中。每30秒收集一管，每管约425 µl，每个梯度共收集12管。注意：最后一管（第12管）通常含有置换用ddH₂O，应予以弃去。
   4. 分馏完成后，按照步骤5.1.2所述方法，使用分析天平测定所有分馏组分的密度。
   5. 向每管分馏液（约425 µl）中加入1 µl甘油（20 µg/µl，溶于ddH₂O，已高压灭菌）作为低浓度DNA沉淀的载体，充分颠倒混匀。
   6. 加入两倍体积（850 µl）的聚乙二醇（PEG）溶液（将150 g聚乙二醇6000和46.8 g NaCl溶于ddH₂O，定容至500 ml，过滤、除菌并高压灭菌。PEG溶液终浓度为30% PEG 6000和1.6 M NaCl），再次颠倒混匀10次。
   7. 将离心管在室温下静置至少2小时（必要时可过夜），以沉淀DNA。
   8. 在13,000 × g下室温离心30分钟，应可见明显沉淀。
   9. 小心用移液器吸除上清液，并用500 µl 70%乙醇洗涤沉淀。在相同条件下再次离心10分钟。
   10. 小心弃去上清液，在室温下空气中干燥沉淀15分钟。
   11. 将干燥的DNA沉淀重新溶解于30 µl ddH₂O中，轻轻敲击管壁使其充分混匀。按照步骤4.3的方法测定各梯度组分中的DNA浓度。如需长期保存，将样品储存在-20或-80 °C条件下。

6. 通过焦磷酸测序进行DNA表征

1. 确保未标记的天然（¹²C）DNA 密度范围为 1.705 g/ml 至 1.720 g/ml，而 ¹³C 标记的 DNA 密度约为 1.720–1.735 g/ml。注意，从环境样品中提取的天然 DNA 和 ¹³C 标记 DNA 均可能分布在多个梯度组分中。预期轻链 DNA 主要位于第 9–11 组分，重链 DNA 主要位于第 4–6 组分。
2. 根据密度分离后 DNA 的特定峰分布，合并关键组分，构建一个单一的"整合"代表性组分。或者，也可采用其他方法分析分离后的各组分，例如同位素比值质谱法（IRMS）²² 或变性梯度凝胶电泳（DGGE）²³ 等指纹图谱技术，以在测序前选择合适的组分。
3. 对每个独立梯度中整合后的重链、中链和轻链组分中 PCR 扩增得到的细菌 16S rRNA 基因进行焦磷酸测序。利用该方法可鉴定在稳定同位素探针（SIP）孵育样品中具有代谢活性的细菌类群及其相对丰度。焦磷酸测序操作如下：
   1. 使用 Roche 454 FLX 仪器配合 Titanium 试剂进行扩增子焦磷酸测序。
   2. 使用融合引物 Gray28F（5'-GAGTTTGATCNTGGCTCAG-3'）和 Gray519r（5'-GTNTTACNGCGGCKGCTG-3'）^24,25，在其末端分别连接相应的引物接头 A/B 和样本特异性的多重标识序列（MID），制备带条形码的扩增子用于多重测序。
   3. 采用 Hot Start Taq 聚合酶进行一步法 PCR 扩增，共 30 个循环，以构建测序文库。
   4. 按照试剂供应商提供的操作流程对扩增子进行测序，并从前向（Gray28F）延伸读长，具体方法参见 http://www.researchandtesting.com/。

7. 焦磷酸测序数据分析

1. 使用 "微生物生态学定量分析"（QIIME）软件流程²⁶ 对 454 焦磷酸测序生成的原始序列读长进行分析。按以下步骤进行处理：
   1. 首先，使用 process_sff.py 脚本将 454 测序仪生成的 sff 文件转换为 FASTA、QUAL 和 Flowgram 文件。
   2. 验证映射文件（基于 check_id_map.py），并使用 split_libraries.py 脚本将多重测序读长分配至相应的生物样本。采用滑动窗口大小为 50、平均质量阈值为 25 的参数修剪低质量末端，同时从数据集中剔除短且模糊的序列（长度 <200 bp）。
   3. 使用 denoise_wrapper.py 对 454 数据进行去噪处理。
   4. 接下来，采用多种操作分类单元（OTU）挑选方法（使用 pick_otus.py，序列相似性阈值设为 97%），将高质量读长聚类为操作分类单元（OTUs）。
   5. 使用 pick_rep_set.py 从每个 OTU 中选取一条代表性序列。
   6. 基于 assign_taxonomy.py 对代表性序列集进行分类学注释。使用核糖体数据库项目（RDP）分类器，设定记录分类注释的最低置信度为 0.80。
   7. 使用 PyNast 算法（align_seqs.py，最低序列一致性百分比设为 75）将代表性序列集与预先比对的 Greengenes 核心 16S 序列进行比对。
   8. 此外，运行 identify_chimeric_seqs.py 以去除嵌合序列，避免其进入后续分析。
   9. 在构建系统发育树（make_phylogeny.py）之前，使用 lanemask 模板（filter_alignment.py）去除所有缺口位点（对系统发育推断无用）。
   10. 最后，使用 make_otu_table.py 生成 OTU 表，描述各细菌谱系在每个样本中的出现情况。利用 OTU 表构建热图，用于比较细菌的丰度与活性。
   11. 如有需要，可分别计算样本内和样本间的 alpha 多样性与 beta 多样性。同样地，也可绘制稀疏曲线（多样性随测序深度变化的图谱）以及主坐标分析（PCoA）图，以展示微生物群落之间的关系。

结果

为了充分标记昆虫肠道中代谢活跃的细菌，需将昆虫暴露于富含¹³C的底物中，持续一段预先优化的时间，以确保标记后的重DNA组分能够与未标记的轻组分有效分离。在本实验中，人工饲料中添加¹³C-葡萄糖，终浓度为10 mM，处理时间为1天（图1A）。对照组昆虫的人工饲料中则添加等量的普通葡萄糖（图1B）。如前所述，DNA组分的分离（重链与轻链）是整个实验的基础。因此，首先需从目标组织中提取DNA；在此案例中，即与昆虫肠道相关的细菌群落。为确认提取DNA的质量，必须进行琼脂糖凝胶电泳，以判断是否成功从待测组织中获得DNA。在图1C中，可见图像顶部有一条明显的基因组DNA条带，证实DNA提取成功。此外，还需使用细菌通用引物进行诊断性PCR，以检测细菌DNA的存在（图1D）。该阳性结果对于决定是否继续进行后续的宏基因组DNA分离至关重要。

超速离心后，待确认各分离组分中DNA的含量并完成密度测定，将每管中各组分的平均密度...

讨论

大多数昆虫的肠道内栖息着丰富而复杂的微生物群落；通常有 10⁷–10⁹ 个原核细胞定植其中，在多数情况下其数量超过宿主自身的细胞。因此，昆虫肠道是多种微生物活动的"热点区域"，体现了从致病性到专性互利共生等多种微生物关系²⁷。尽管已有大量研究描述了昆虫肠道微生物群落的惊人多样性，但对肠道微生物代谢活性的表征仍较为罕见。稳定同位素示踪技术目前提供了一种无需培养、甚至可在in vivo条件下，从复杂的微生物背景中区分出活跃成员的可能性。我们应用这一有价值的工具，在棉铃虫（Spodoptera littoralis）这一昆虫模型系统中研究其肠道微生物群落。由于葡萄糖是棉铃虫肠道中的主要糖类，在本实验中我们通过人工饲料向幼虫饲喂额外但生理剂量的¹³C-葡萄糖，以追踪肠道菌群中代谢活跃的细菌。同时设置以天然葡萄糖饲喂的平行培养作为关键对照，以便后续比较，确保核酸中任何明显的标记信号并非由方法本身引起的假象（例如DNA的高G+C含量对分离结果的干扰）。葡萄糖接近in situ的浓度进一步减少了...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜蒙特 #5 镜面抛光镊子	精细科学工具公司	11251-23
范纳斯弹簧剪	精细科学工具公司	15000-00
Speed Vacuum 浓缩仪 5301	艾本德德国公司	5305 000.304
塑料研钵杵	卡尔·罗斯有限公司 德国	P986.1
NanoVue 分光光度计	GE 医疗英国公司	28-9569-58
Mastercycler pro/热循环仪	艾本德德国公司	6321 000.515
Agagel 标准水平凝胶电泳槽	Biometra	已停产
超速离心机（Optima L-90K）	贝克曼	A20684
超速离心机转子（NVT 90）	贝克曼	362752
HPLC 泵	安捷伦	1100
Quick-Seal 聚丙烯离心管	贝克曼	342412
Transilluminator UVstar 15	Biometra