通过稳定同位素示踪（SIP）结合焦磷酸测序技术，确定了与埃及棉铃虫（Spodoptera littoralis）肠道相关的活性细菌群落。利用该方法，能够以高分辨率和高精确度鉴定群落中具有代谢活性的细菌种类。
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方法文章
通过使用 13C-葡萄糖的DNA稳定同位素示踪法鉴定广食性昆虫Spodoptera littoralis肠道中具有代谢活性的细菌
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
大多数昆虫的肠道内栖息着复杂的共生非致病性细菌群落。在这些微生物群落中，可以识别出共栖或互利共生的细菌种类。后者已被发现对昆虫具有多种功能，例如协助昆虫繁殖1、增强免疫反应2、信息素的产生3，以及营养供给，包括必需氨基酸的合成4,等。
由于这些关联的重要性，人们已做出诸多努力以表征这些群落中的各个成员。然而，这些努力大多基于培养方法，或依赖于生成用于最终鉴定的16S rRNA基因片段测序。遗憾的是，这些方法仅能鉴定肠道中存在哪些细菌物种，而无法提供有关微生物代谢活性的任何信息。
为了表征昆虫肠道中具有代谢活性的细菌种类，我们采用稳定同位素示踪（SIP）技术在活体（in vivo）条件下使用13C-葡萄糖作为通用底物。这是一种具有前景的无需培养的技术，能够将微生物的系统发育与其特定的代谢活性关联起来。通过追踪从底物进入微生物生物标志物（如DNA和RNA）中的稳定同位素标记原子，即可实现这一目标5。当13C同位素掺入DNA后，标记DNA的密度高于未标记的（12C）DNA。最终，通过密度梯度超速离心将13C标记的DNA或RNA与12C未标记的同类分子分离开来6。对分离得到的核酸同位素异构体进行后续分子分析，便可建立代谢活性与物种身份之间的联系。
本文介绍了用于表征广食性昆虫（我们的模式系统）Spodoptera littoralis（Lepidoptera, Noctuidae）肠道中代谢活跃细菌的实验方案。通过焦磷酸测序技术对DNA进行系统发育分析，实现了对昆虫肠道菌群的高分辨率和高精度鉴定。实验中以13C标记的葡萄糖作为主要底物，并通过人工饲料将其饲喂给昆虫。
引言
已知有大量昆虫物种与细菌存在共生关系7在这些共生关系中，微生物在昆虫的生长和发育过程中发挥着重要作用。研究表明，微生物有助于昆虫的繁殖1，信息素生物合成3，营养，包括必需氨基酸的合成4以及对宿主难以消化的食物进行分解。尽管肠道细菌与昆虫的共生关系种类繁多，但关于这些共生关系对昆虫有益功能作用的研究仍相对较少。只有在白蚁中，由原核生物、原生动物和真菌共同参与的木质纤维素共生消化过程得到了广泛研究。8,9相比之下，关于广食性昆虫肠道中存在的共生关系，目前了解甚少 即 棉铃虫， Spodoptera littoralis 此外，由于广食性昆虫经常更换寄主植物，其肠道相关细菌群落也持续面临与其取食习性相关的新挑战，即摄食含有多种植物次生代谢物的植物。除此之外，鳞翅目昆虫的肠道环境代表 本身 由于肠道pH值较高，对细菌生长构成严苛的环境10。尤其是在以下情况 S. littoralis，其范围从前肠的10.5， 约 中肠的pH为9，后肠的pH接近711另一方面，与肠道相关的细菌群落 S. littoralis 很简单。Tang，Freitak， 等12 报道了与该昆虫相关的细菌群落中仅包含属于7种不同细菌物种的最多36种菌型。此外，该昆虫在实验....
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方案
1. 昆虫饲养
- 从自养的埃及棉铃虫（Spodoptera littoralis）中获取或购买卵块。将卵块置于无菌培养皿中，在室温（RT）下保存直至孵化。
- 按以下步骤配制昆虫人工饲料：
- 将500 g磨碎的白豆用100 ml水浸泡过夜。
- 在1,000 ml蒸馏水H2O中加入9.0 g抗坏血酸和75 g琼脂，随后煮沸。
- 让混合物冷却，待其凝固成白色蜡状固体后，于4 °C保存备用。
- 将刚孵化的幼虫转移至洁净的塑料盒中，在23–25 °C、长日照条件下（16小时光照，8小时黑暗）以人工饲料饲养。每日更换饲料，直至幼虫完成全部六个龄期的发育。
2. 代谢活跃肠道细菌DNA的13C标记
- 取186.1 mg完全13C标记的葡萄糖，用去离子蒸馏水（ddH2O）溶解，并与100 g人工饲料充分混合，用于SIP实验。确保人工饲料中13C-葡萄糖的终浓度为10 mM。该浓度模拟了取食棉花植株的S. littoralis幼虫肠道内in situ的葡萄糖浓度，依据Shao et al.（已投稿）的研究。
- 从饲养....
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结果
为了充分标记昆虫肠道中代谢活跃的细菌，必须使昆虫暴露于富含13C的底物中一段经过预先优化的时间，以确保能够轻松地将标记后的较重DNA组分与未标记的较轻组分分离。在本实验中，我们在人工饲料中添加13C-葡萄糖，终浓度为10 mM，处理时间为1天（图1A）。对照组昆虫的人工饲料中则添加等量的普通葡萄糖（图1B）。如前所述，DNA组分（较重与较轻）的分离是整个实验过程的基础。因此，首先需要从目标组织中提取DNA；在本案例中，即与昆虫肠道相关的细菌群落。为确认提取质量，需进行琼脂糖凝胶电泳，以判断是否成功从待测组织中获得DNA。在图1C中，可在图像顶部观察到一条清晰的基因组DNA条带，表明DNA提取成功。此外，还需使用细菌通用引物进行诊断性PCR，以确认细菌DNA的存在（图1D）。该阳性结果对于决定是否继续进行后续的宏基因组DNA分离至关重要。
超速离心后，待各分离组分中DNA的含量确认且密度测定完成后，以组分编.......
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讨论
大多数昆虫的肠道内栖息着丰富而复杂的微生物群落；通常有 107–109 个原核细胞定植其中，在多数情况下其数量超过宿主自身的细胞。因此，昆虫肠道是多种微生物活动的"热点区域"，体现了从致病性到专性互利共生等多种微生物关系27。尽管已有大量研究描述了昆虫肠道微生物群落的惊人多样性，但对肠道微生物代谢活性的表征仍较为罕见。稳定同位素示踪技术目前提供了一种无需培养、甚至可在in vivo条件下，从复杂的微生物背景中区分出活跃成员的可能性。我们应用这一有价值的工具，在棉铃虫（Spodoptera littoralis）这一昆虫模型系统中研究其肠道微生物群落。由于葡萄糖是棉铃虫肠道中的主要糖类，在本实验中我们通过人工饲料向幼虫饲喂额外但生理剂量的13C-葡萄糖，以追踪肠道菌群中代谢活跃的细菌。同时设置以天然葡萄糖饲喂的平行培养作为关键对照，以便后续比较，确保核酸中任何明显的标记信号并非由方法本身引起的假象（例如DNA的高G+C含量对分离结果的干扰）。葡萄糖接近in situ的浓度进一步减少了.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢Angelika Berg提供的实验室协助。本工作由马克斯·普朗克学会和耶拿微生物通信研究生院（JSMC）资助和支持。
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材料
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参考文献
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H.
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重印与许可
