肽-金属配合物结构与配位测定的1D与2D 1H NMR方法

摘要

已测定含 Cu(I) 的金属伴侣模型肽的核磁共振（NMR）溶液结构，并详细描述了从样品制备、一维和二维数据采集到三维结构解析的完整实验方案。

摘要

金属伴侣转运蛋白结合一价铜（Cu(I)）可防止铜被氧化，并避免释放可能参与有害氧化还原反应的有毒离子。在惰性条件下，通过核磁共振波谱法测定了包含序列MTCSGCSRPG（下划线部分为保守序列）的一价铜结合金属伴侣蛋白肽段模型的Cu(I)配合物在溶液中的结构。

核磁共振（NMR）是一种广泛用于测定蛋白质和多肽溶液结构的技术。由于难以获得适合X射线晶体学研究的单晶，核磁共振技术显得尤为重要，尤其因为它提供的是溶液状态而非固态的信息。本文描述了通过核磁共振进行完整三维结构测定所需的所有步骤，包括在核磁共振管中进行样品制备、一维和二维数据的采集与处理、化学位移归属与积分、分子力学计算以及结构分析。重要的是，分析最初在没有任何预设金属-配体键的情况下进行，以确保以无偏倚的方式获得可靠的结构测定结果。

引言

多肽被广泛用作蛋白质模型、潜在的药物先导化合物以及其自身的治疗剂。然而，由于结晶困难，它们的分子尺寸较小且具有高度柔性，通常难以通过X射线确定其结构。

核磁共振（NMR）可用于测定肽的结构及其相互作用。该方法可提供有关局部和整体结构、结合情况以及低亲和力相互作用的信息，且由于可在溶液状态下进行，适用于难以处理的样品。

生物系统中的铜转运由细胞内铜金属伴侣蛋白介导，这些蛋白特异性结合 Cu(I) 离子，并通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用将铜离子递送至靶蛋白，从而保护铜离子不被氧化，并防止有毒铜的释放^2-5。其结合位点的特征为保守序列 MXH/TCXanyXanyC，核磁共振（NMR）和晶体学研究均表明，该序列通过两个半胱氨酸残基的软硫醇配体结合 Cu(I) 离子，尽管也有研究提出可能存在额外的外部配体^6-8。这些蛋白的结构与功能关系一直是深入研究的课题⁹。

在本研究中，合成了一种包含铜金属伴侣蛋白保守序列的多肽模型，并在惰性环境中与 Cu(I) 发生反应。本文所述的实验方案详细介绍了通过核磁共振（NMR）进行结构测定的各个步骤，包括样品制备、数据采集、数据处理、结构生成及结构分析。分析分为两个阶段：首先，在不引入多肽与铜离子结合方式信息的情况下生成初始结构；随后，基于实验确定的结合模式，将相应的约束条件....

方案

1. 样品制备

1. 脱辅基样品：将约1-2 mg肽溶解于450-500 µl 氘代核磁共振级溶剂中（生物样品首选溶剂为含10% D2O的水溶液，或当样品不溶于水或与水发生反应时使用d6-DMSO^11-12）。
2. 铜结合样品：将约1-2 mg肽与等摩尔量的金属盐溶解于450-500 µl 核磁共振溶剂中。
3. 使用烧结玻璃、滤纸或任何适合待测化合物且不会吸附样品的过滤技术对溶液进行过滤。此步骤至关重要，可去除任何金属颗粒，避免影响溶液均一性。
4. 将溶液转移至核磁管中并封口。确保核磁管质量与所用磁体强度相匹配（详见仪器参数表）。
5. 若样品对氧气敏感，则上述操作必须在惰性气氛下进行，并将核磁管密封以防止氧化。

2. 核磁共振数据采集与处理¹³

1. 记录 1D ¹H谱的脱辅基样品与铜反应后样品并进行比较。含铜肽的谱图应在酰胺区域显示出明显的化学位移变化，且峰形分辨度提高，因为脱辅基肽具有柔性，呈现多种构象的平均信号，而与铜结合后，肽段的酰胺基团形成单一稳定结构。图2).
   1. 若光谱未发生变化，则认为反应失败。
   2. 如果样品变为绿色，则说明铜已在空气中氧化，这可能会改变其结合特性。....

结果

作为铜结合蛋白模型持续研究的一部分，通过溶液态核磁共振（NMR）测定了线性肽 MTCSGCSRPG 中保守序列 MT/HCXXC 的结构。该肽在惰性环境条件下与 CuCl 反应，用通用试纸测得 pH 值约为 3.0。肽的酰胺区在与铜反应后出现展宽，化学位移范围从 6.7–8.5 ppm 扩展至 6.6–9.0 ppm（图 2）。基线中可见轻微铜氧化引起的谱线展宽。

铜反应后的肽样品随时间保持稳定（图7），其谱图分辨率良好（图8），通过ROESY实验获得了81个NOE相互作用，而分子在NOESY谱图中几乎未产生NOE相互作用（理论解释见图6）。

对于反应样品衍生的肽段，采用无金属约束的集合计算，得到50个结构中有47个未违反约束条件，主链和重原子的RMSD值分别为1.44和2.07 Å。其中，选取了13个低能量构象进行进一步分析，其主链和重原子的RMSD值分别为0.25和0.61 Å。

.......

讨论

利用结构信息来理解结合机制的作用已被广泛认可。多肽可作为蛋白质结合与相互作用研究的理想模型；然而，它们并不适用于主要的结构测定方法——X射线晶体学。核磁共振（NMR）特别适用于这类体系，因为其结构可在溶液状态下直接解析。这一点对于金属伴侣蛋白模拟物尤为关键，此类体系还需在惰性环境中进行结构测定，以防止金属离子被氧化。

含有保守的MT/HCXXC基序的MTCSGCSRPG肽能够结合Cu(I)，这一点通过其从无金属状态到与铜反应后的肽光谱发生的显著变化得以证实。由于NOESY谱图中无相互作用信号，因此需要在600 MHz磁场下进行ROESY实验，这表明该肽结构紧密；根据我们的经验，6-7个残基的小肽通常处于NOESY谱图信号缺失的范围，但此类大小的肽通常仍能产生足够的信号。在ROESY谱图中共观察到81个交叉峰，其中N个为残基间交叉峰，(81-N)个为残基内交叉峰。与蛋白质相比，这一峰数量较少，但在小肽中属预期结果；尤其是环状肽，由于所有侧链均向外伸展，彼此间相互作用较少，因而通常只产生较少的交叉峰。

由于金属本身无法通过

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Avance DMX 600 MHz 核磁共振波谱仪	Bruker
NMR 样品管	Wilmad	535-PP
手套箱	MBraun	LM05-019
冷冻干燥机	VirTis	benchtopK
多肽	BioChemia	定制合成	>95% 纯度
氯化亚铜	Aldrich	224332
盐酸	BioLab	231-595-7
氢氧化钠	Gadot	1310-73-2
d6-二甲基亚砜	Aldrich	236926
重水	Aldrich	151882