使用 1D 和 2D 1H NMR 测定肽-金属配合物的结构和配位

Summary

确定了含 Cu （I） 的金属伴侣模型肽的 NMR 溶液结构，并描述了从样品制备和 1D 和 2D 数据收集到三维结构的详细方案。

Abstract

铜 （I） 与金属伴侣转运蛋白的结合可防止铜氧化和可能参与有害氧化还原反应的有毒离子的释放。在惰性条件下，通过 NMR 波谱在溶液中测定 Cu （I） 结合金属伴侣蛋白肽模型的 Cu （I） 复合物，其中包括序列 MTCSGCSRPG（下划线为守恒）。

NMR 是一种被广泛接受的测定蛋白质和肽溶液结构的技术。由于难以结晶以提供适合 X 射线晶体学的单晶，因此 NMR 技术非常有价值，特别是因为它提供了有关溶液状态而不是固态的信息。在本文中，我们描述了通过 NMR 进行全三维结构测定所需的所有步骤。该方案包括在 NMR 管中制备样品、1D 和 2D 数据收集和处理、峰分配和积分、分子力学计算和结构分析。重要的是，分析首先在没有任何预设金属配体键的情况下进行，以确保以无偏的方式进行可靠的结构测定。

Introduction

肽本身被广泛用作蛋白质模型、潜在的药物先导物和治疗剂。然而，由于结晶困难，它们的小尺寸和高度柔韧性通常无法通过 X 射线确定结构。

核磁共振 （NMR） 可用于确定肽的结构和相互作用。该方法可以提供有关局部和整体结构、结合和低亲和力相互作用的信息，并且适用于困难的样品，因为它可以在溶液状态下完成。

生物系统中的铜转运是通过细胞内铜金属伴侣蛋白实现的，这些蛋白特异性结合 Cu （I） 离子并通过一系列蛋白质-蛋白质相互作用将其递送到目标蛋白质，以保护离子免受氧化并防止有毒铜的释放^2-5。结合位点以保守序列 MXH/TCXanyXanyC 为特征，NMR 和晶体学都表明该序列通过两个半胱氨酸残基的软硫代配体结合 Cu （I），尽管也提出了额外的外部配体^6-8。这些蛋白质的结构-功能关系一直是深入研究的主题⁹。

在此处介绍的研究中，合成了一个包含铜金属伴侣保守序列的肽模型，并在惰性环境中与 Cu （I） 反应。所提出的方案描述了通过 NMR 确定结构的步骤，包括样品制备、数据收集、数据处理、结构生成和结构分析。分析分两步完成：首先生成结构，但没有关于肽与铜离子结合模式的信息。一旦凭经验建立了结合模式，就引入了这些约束以提供高分辨率的结构。结合模式是模型中的关键点，因此以公正的方式确定。

模型肽的 NMR 结构测定是一种非常有价值的技术，经常被化学家和生物学家使用。它可以相对容易地应用于不同条件下的不同肽，因此可以阐明相关机制¹⁰。了解结构解析过程可以更好地了解所提出结构的优缺点。

Protocol

1. 样品制备

1. 载脂蛋白样品：将大约 1-2 mg 肽溶解在 450-500 μl 氘代 NMR 级溶剂中（生物样品的首选溶液是 10% D2O 水溶液或 d6-DMSO ^11-12，如果样品不溶于水或与水发生反应）。
2. 铜反应样品：将大约 1-2 mg 肽和等摩尔量的金属盐溶解在 450-500 μl NMR 溶剂中。
3. 使用烧结玻璃、滤纸或任何其他适合所研究化合物且不吸附它们的技术过滤溶液。这对于去除任何金属颗粒至关重要，因为金属颗粒会影响均匀性。
4. 将溶液转移到 NMR 管中并关闭。确保管材质量与所使用的磁体强度相匹配（有关详细信息，请参见设备表）。
5. 如果样品对氧气敏感，则必须在惰性环境中完成这些步骤，并且管子密封以防止氧化。

2. 核磁共振数据收集和处理¹³

1. 记录载脂蛋白和铜反应样品的 1D ¹H 光谱并进行比较。含铜肽谱应显示酰胺区化学位移的显着变化，并且峰被解析，因为 apo 肽具有柔韧性并显示出平均构象，但在与铜反应时，结合肽酰胺具有单一结构（图 2）。
   1. 如果光谱不变，则假定反应失败。
   2. 如果样品变为绿色，则铜将在大气中氧化，这可能会改变其结合特性。
   3. 在这两种情况下，都需要重新制作样本。
2. 找到 NMR 测量的最佳温度条件，使酰胺残基与窄线宽的重叠最小。
3. 在相同条件（温度、pH 值等）下设置 COSY¹⁴、TOCSY¹⁵ 和 NOESY¹⁶ 或 ROESY¹⁷ NMR 实验，并按顺序运行。
   1. COSY（图 3）和 TOCSY（图 4）实验将分别检测相邻和更远距离相邻质子-质子相互作用的通键相互作用。COSY 谱图提供有关 HN-Hα 相关性的信息，而 TOCSY 谱图则提供有关 HN 和相关残基的其他 H 脂肪族质子的信息。
   2. NOESY 和 ROESY（图 5）实验检测了通过空间的接近性，而不依赖于键来提供结构信息。两者之间的选择取决于化合物的有效大小和场强。一些这样的组合给出理论上的零信号（图 6），并且必须运行 ROESY 实验来检测 NOE 相互作用^10,18。
   3. 如果样品在水中，则实验需要具有水抑制的成分。这是使用梯度¹⁹ 最有效地实现的。在这种情况下，在分配后，在纯 D₂O 中重新运行样品以获得 Hα 氢之间以及 Hα 氢之间的相互作用是有利的。
   4. 通过运行大量简短的实验来优化 TOCSY 和 NOESY 或 ROESY 混合时间的持续时间，以找到最大的信号积累和最小的自旋扩散损失。确保这是堆积曲线的线性区域。在 600 MHz 磁场中，肽的常见值包括 TOCSY 的混合时间约为 100 毫秒，NOESY 或 ROESY 实验的混合时间约为 150 毫秒。
   5. 在每个实验之间运行 1D 实验，以确保样品成分在整个数据采集过程中保持不变（图 7）。
4. 使用适当的切趾函数处理光谱，以获得最大的分辨率和最小的信号强度损失，并在 t1 维度上添加零填充。
   1. 进一步校正 F2 中的基线，然后使用二次多项式函数校正 F1 维度。
   2. 根据相应溶剂中残留的水或 DMSO 峰，根据它们与已知标准品（分别为 TMSP 或 TMS）的偏差，仔细校准谱图的化学位移。

3. 使用 SPARKY²⁰ 进行峰值分配和积分

1. 准备一组叠加在 NOESY 或 ROESY 光谱上的 COSY 和 TOCSY 光谱（图 8）。
2. 根据 Wüthrich²¹ 开发的顺序分配方法分配谱图中的所有 NOE 峰。
   1. 首先分配与指纹区域中的 TOCSY 信号重叠的峰，因为这将有助于使用 SPARKY 程序进行后续的峰分配输入（图 9）。记录分配的化学位移（图 10）和 ³JHNHα 值（图 11）。
3. 将峰值转换为距离约束，将 ³JHNHα 值转换为二面角。
   1. 这可以通过整合程序中的峰并使用已知距离的交互作用（例如亚甲基的两个质子之间的距离或芳香族氨基酸的芳香族氢原子之间的距离）将它们转换为距离约束来实现。
   2. 如果峰重叠，并且无法使用积分方法，则可以通过目视估计将其标记为强-中-弱-非常弱，这些名称可以分别转换为最大 2.5、3.5、4.5 和 5.5 Å 的距离。这在处理肽时最有效。
   3. ³JHNHα 值表示根据 Karplus 方程的二面角，其中大多数给定的耦合值可以由多个二面角产生。这些可以表示二级结构（螺旋或片状）、无规则卷曲或其构象平均值。因此，谨慎使用约束或使用它们作为构象结果的确认非常重要。

4. 使用 XPLOR22 生成结构集合的分子力学计算

1. 使用 XPLOR 的正确格式导入距离约束和二面角。（图 12，仅残差间约束）。除了实验发现的距离约束外，XPLOR 还将搜索构象空间以找到符合规范几何化学约束的结构，例如键长、角度、手性等，以生成一个不违反上述参数的系综。这将构成起始集合。
2. 第一次结构测定运行将不对金属使用任何约束。这将显示哪些残基参与金属结合，没有任何偏差。跳至步骤 4.4。
3. 除了 NMR 衍生的距离约束外，还可以将金属结合约束添加到确定的残基中。
   1. 添加适当的参数来描述金属离子及其拓扑。
   2. 必须将适当的物理信息（质量、与其他原子的键长、角度和非键合排斥参数）放入参数文件中。
   3. 将绑定信息添加到拓扑文件中：哪些键形成和断开，以及哪些正式电荷由于绑定而改变。
4. 创建一个通常由 10 名成员组成的小型 ensemble。
   逐渐
   1. 引入约束，从 backbone 到 backbone 的交互开始，然后是 backbone-to-sidechain，然后是 sidechain-to-sidechain 交互，从残差内、顺序到越来越长的交互。这有助于识别作业中的错误。
   2. 将 NOE 能量作为方阱势引入，常数为 50 kcal/mol•Å²。模拟退火应在 1,500 K 下以 1,500 个 3 飞秒的步长进行，在冷却至 500 K 期间以 3,000 个 1 飞秒的步长进行。最后，使用 4,000 次迭代的共轭梯度能量最小化最小化结构;这些是可以在 XPLOR 中更改的变量。
5. 创建通常包含 50 个成员的最终 ensemble。对整个 ensemble 执行步骤 4.4 中的步骤。
   1. 报告找到的每种类型的 NOE 交互的数量，如图 13 所示。
6. 创建一组符合规范化学几何和经验 NMR 衍生约束的结构。
   1. 报告构象的总数、违反 NMR 衍生约束的构象数量，以及整个系综的 RMSD，包括主链和所有重原子 RMSD 值。

5. 结构分析

1. 求解的融合表示肽在 NMR 测量过程中采用的构象空间。局部柔韧性可能在分子的不同区域发生变化，这可能归因于结构或功能原因（结构分析的目的是确定稳定性和作用机制的结构基础）。
   1. 将结构的所有构象导入 MolMol 程序 23 以创建一个起始集成（图 14）。
2. 检查系差以确定分子的局部稳定性。
   1. 通过选择序列上的后续四个残基区域并让程序将 RMSD 计算到最低能量结构或平均值，确定主干和侧链 RMSD 值。
   2. 通过将局部 RMSD 绘制为序列的函数，确定分子的哪些区域显示出局部稳定性（图 15）。
   3. 沿分子的这个区域覆盖集成，并使用此集成进行进一步分析（图 16）。
3. 选择符合 NMR 衍生约束条件（未违反）的低能量构象。这些将形成 "低能耗集成"。
   1. 报告集成中构象的数量、选择它们的标准以及步骤 4.6.1 中定义的 RMSD 值。
   2. 如果已确定金属结合模式，请继续执行下一步。否则：分析低能量系综并确定哪些残基侧链彼此正确接近，以便能够结合金属离子。一旦确定了这些，返回步骤 3.3 并重新进行分析，包括铜结合数据（集成图 17 和低能量构象异构体图 18）。
4. 使用 MolMol 程序的默认搜索参数检查系差并确定分子内的局部二级结构。二级结构由氢键保持，并指示分子的稳定区域。
   1. 确定每个构象异构体的二级结构（图 19）。
      1. 创建一个表，其中包含显示每个二级结构的融合的构象异构体的百分比。
      2. 确定二级结构的区域是否与被局部 RMSD 确定为稳定区域的区域重叠。这种情况经常发生。
5. 确定分子内的距离和氢键。
   1. 将 ensemble 导入 Chimera²⁴。
   2. 使用 Chimera 确定怀疑金属结合的原子之间的分子内距离。计算集成中的平均距离。
   3. 使用 Chimera 确定集合的每个构象异构体中的分子内氢键（图 20），使用程序的默认松弛氢键参数（20%）。
   4. 创建一个显示每个氢键的集合构象异构体百分比的表格。在大多数构象中重复出现的氢键表明稳定的键增加了结构的稳定性。
6. 确定分子内的静电相互作用。
   1. 识别带电侧链之间的交互。
   2. 创建一个表格，其中包含显示每个静电相互作用的融合构象异构体的百分比。
7. 使用 Delphi²⁶ 程序中的 Amber²⁵ 力场计算静电势分布。
   1. 从集成中选择一个具有代表性的构象，以执行静电势计算。
   2. 使用 Poisson-Boltzman 方程和完整的库仑计算推导静电势。所需参数包括溶液的离子强度、溶液的介电值（水为 80;DMSO 为 40）;内部肽（通常在 5.0 左右）;网格的大小（通常为 65'65'65 点）;以及肽与网格边缘之间的最小距离 （10 Å）。就这些值而言，结果通常非常稳定，因为主要结果由肽本身决定（图 21）。
   3. 检查映射到肽范德华表面的静电势（图 22）。
   4. 检查静电势等值面，这些表面描述了具有相同电位的位置。找到表明生物学相关性的等值面，例如可能吸引或排斥其他蛋白质或配体的扩展正或负表面，或表明重要性的分布，例如两亲性分布或不同性质的斑块（图 23）。
8. 总结所有结构发现，看看它们如何相互加强。
9. 在相关的地方重复步骤 4.3-5.7.4。

Results

作为正在进行的铜结合蛋白模型研究的一部分，线性肽 MTCSGCSRPG 中保守序列 MT/HCXXC 的结构由溶液态 NMR 确定。在惰性环境下将肽与 CuCl 反应，用通用棒测量 pH 值为 ~3.0。肽的酰胺区在与铜反应后表现出膨胀，从 6.7-8.5 ppm 膨胀到 6.6-9.0 ppm（图 2）。由于轻微的铜氧化导致的谱线加宽在基线中很明显。

铜反应肽样品随时间稳定（图 7），谱图分辨率良好（图 8），并给出了 81 次 NOE 相互作用，这些相互作用是通过 ROESY 实验获得的，因为该分子在 NOESY 光谱中产生的 NOE 相互作用几乎为零（参见图 6 中的理论解释）。

为反应样品衍生的肽的系综，但对金属没有限制，在 50 个未受破坏的结构中，有 47 个在主链原子和重原子上的 RMSD 值分别为 1.44 和 2.07 Å。其中，选择了 13 个低能构象异构体进行进一步分析，...

Discussion

结构信息对理解结合机制的贡献已被广泛接受。肽可用作蛋白质结合和相互作用的模型;然而，它们不适用于结构测定的主要方法，即 X 射线晶体学。核磁共振对于这些系统特别有用，因为结构可以在溶液中很容易溶解。这尤其适用于金属伴侣模拟物的情况，这些模拟物还需要在惰性环境下进行结构测定以防止金属离子氧化。

含有保守的MT/HCXXC基序的MTCSGCSRPG肽结合Cu（I），从apo形式到与铜反应的肽的光谱显着变化可以明显看出。由于 NOESY 频谱中具有零相互作用的频谱，需要在 600 MHz 的领域进行 ROESY 实验，表明肽是紧凑的，因为我们的经验表明，6-7 个残基的较小肽落在 NOESY 状态的零信号中，但这种大小的肽通常会提供足够的信号。在ROESY光谱中，观察到81个交叉峰，其中N个为残基间交叉峰，（81-N）个为残基内交叉峰。与蛋白质相比，这是少量的峰，但在小肽中是预期的;特别是环肽，由于所有侧链都指向外并且彼此之间几乎没有相互作用，因此往往会产生少量相互作用。

由于金属本身无法通过 ¹H NMR 测...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Avance DMX 600 MHz 波谱仪	Bruker
NMR 样品管	Wilmad	535-PP
手套箱	MBraun	LM05-019
冻干机	VirTis	台式 K
肽	BioChemia	定制	>95% 纯度
氯化铜 （1） 氯化	Aldrich	224332
盐酸	BioLab	231-595-7
氢氧化钠	Gadot	1310-73-2
d6-二甲基亚砜	Aldrich	236926
氧化氘	Aldrich	151882