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方法文章

一种研究长期食物限制对戒断大鼠海洛因觅药行为影响的实验方法

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DOI：

10.3791/50751

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2013年11月11日

 ,  , 
1Department of Psychology, Center for Studies in Behavioural Neurobiology/Groupe de Recherche en Neurobiologie Comportementale, Concordia University

本文内容

摘要

本文描述了一种可在食物限制大鼠中显著增强觅药行为的实验方法。在完成海洛因自给药训练后，大鼠进入一段在无药物环境中的戒断期，期间对其进行轻度食物限制。随后，在与药物相关的环境中检测其觅药行为。

摘要

在人类药物成瘾者中，接触与既往用药行为相关的线索或环境可引发戒断期间的复吸。此外，多种环境挑战可加剧这种效应，并增加持续的药物摄入。

本文所述实验方案强调了一种常见的环境挑战——食物限制，对药物渴求行为的影响，这种影响表现为禁欲大鼠中觅药行为的增强。

大鼠被植入慢性静脉内导管，随后训练其按压杠杆以获取 在10至12天内通过静脉注射给予海洛因。海洛因自我给药阶段结束后，将大鼠从操作性条件反射箱中移出，并转移至动物饲养设施中至少饲养14天。在此期间，一组大鼠保持自由进食（饱食组），另一组（食物限制组，FDR组）则接受轻度食物限制，使其体重维持在非限制状态体重的90%。在食物限制的第14天，将大鼠重新转移回药物训练环境，在消除条件下进行觅药行为测试（即. 按压杠杆不会导致海洛因递送。

本实验方案在食物限制的大鼠中，可显著且稳定地增强测试日对海洛因的觅药行为。此外，与我们先前采用的急性食物剥夺操作相比，当前方案更能模拟热量限制对觅药行为影响的临床相关模型。同时，该方案可能更接近人类实际情况，因为大鼠在进行觅药测试前无需经历消退训练阶段，而消退训练是常用复吸模型中的关键组成部分。

引言

药物成瘾治疗中的一个主要难题是，即使经过长期的戒断，复发率仍然很高1,2。对人类成瘾者的研究已确定，环境挑战（例如接触与药物相关的特定线索或环境3以及应激性生活事件4）在复发中起着关键作用。一种常见的、被发现会影响药物摄取和渴求的环境挑战是长期的食物限制。例如，已有报道指出，长期的热量限制与吸烟增加相关5。 此外， 节食的严重程度（热量限制）与年轻女性中药物使用率升高呈正相关6。然而，其潜在的脑机制尚未完全阐明。

由于涉及人体研究的实际和伦理考量，研究人员已开发出动物模型以确定相关的神经机制。我们此前曾使用复吸程序7,8来证明，经历急性（24–48 小时）食物剥夺的大鼠会出现已消退的觅药行为的恢复9,10。然而，复吸程序的一个关键组成部分是消退期，而这一阶段在药物成瘾治疗中并不常见11（但参见 Epstein et al.12 对复吸程序有效性的全面讨论）。此外，在人类饮食干预的特定情况下，只有长期的食物限制而非急性食物剥夺被证明能有效增加药物摄入行为5,13。

因此，我们提出了一种"禁欲程序"14，可用于研究长期食物限制对觅药行为的影响。利用该程序，我们最近证明，在经历14天轻度食物限制后，禁欲状态下的大鼠对海洛因的觅药行为显著增强15。

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方案

1. 动物

所有大鼠的处理均遵循加拿大动物护理委员会的指南，并已获得康考迪亚大学动物研究伦理委员会对所有实验程序的批准。

  1. 选取体重为275-300 g（雄性）或225-250 g（雌性）的大鼠。手术前将大鼠成对饲养于标准塑料笼中，笼内垫有玉米芯 bedding 并提供碎纸屑。
  2. 将大鼠维持在反转的光暗循环周期中（上午9:30关灯）。
  3. 除戒断期外，食物和水均自由供应（ad libitum）。我们使用常规大鼠饲料（20.9% 蛋白质、67.2% 碳水化合物和11.8% 脂肪）。

2. 导管和连接器

  1. 批量制备导管，经高压灭菌后可在较长时间内按需使用。
  2. 将硅胶管剪成12 cm长的节段。
    1. 使用牙签在距离导管尖端3 cm处周围涂抹少量硅胶。
    2. 让硅胶干燥24小时，然后进行高压灭菌并储存导管。
  3. 将用作连接器的"5-up"套管的长管部分弯成直角，使其垂直于塑料基座，然后进行高压灭菌并储存。
  4. 在手术当天无菌条件下组装导管，将硅胶管的"长"端套入"5-up"套管弯曲的金属管上，插入深度约为塑料基座的一半。
    1. 通过Tygon管和钝化的22 G针头，将"5-up"套管连接至装有无菌生理盐水的1 ml注射器。
    2. 用生理盐水冲洗导管，以确保液体流通无阻。

3. 静脉导管手术

  1. 在手术前，让大鼠在动物饲养设施（ACF）中适应一周时间。不要对体重低于300–325 g（雄性）或250–275 g（雌性）的大鼠进行手术。
  2. 手术前称重大鼠体重，并通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（90/13 mg/kg）进行麻醉。
    1. 用剃毛器剃除头部以及右肩部位（靠近颈部基部）的毛发，然后用酒精和外科消毒液清洁该区域。
    2. 皮下注射青霉素（450,000 IU/只大鼠）以预防感染，以及2 ml生理盐水（皮下）以维持水合状态。在大鼠眼睛上涂抹眼用凝胶，防止麻醉引起的角膜干燥。
  3. 将大鼠置于俯卧位，使用手术刀在头部顶端、两眼之间做一切口，并向耳部方向尾侧延伸。
  4. 将大鼠转为仰卧位，前肢用胶带固定于操作台表面。用镊子提起锁骨稍前方切口处的皮肤，用小剪刀做一条长约1 cm的纵向切口。
  5. 使用两把直镊子分离 脂肪及其他 组织 ，直至暴露颈外静脉。
  6. 将直镊子的尖端插入静脉下方，抬起并分离静脉与周围组织。小心清除附着在静脉上的任何组织，然后将弯镊子插入静脉下方，以保持静脉抬高并轻微拉伸。
  7. 使用小型弹簧剪刀在静脉上表面做一个小的V形切口。
    1. 使用血管扩张器撑开切口，将导管的"短"端（3 cm）沿静脉向心脏方向插入，直至硅胶滴到达切口位置。
    2. 用三根缝线将导管固定于静脉：一根尽可能靠尾侧，一根位于硅胶滴稍前方，第三根尽可能靠头侧。
    3. 每缝合一次后均通过导管灌注生理盐水，以确保导管通畅且缝线不过紧。
  8. 移除前肢周围的胶带，将大鼠转为腹侧朝下体位。
    1. 将止血钳从头部切口的尾侧插入，推动以分离皮肤与下方组织，形成一个皮下"囊袋"。
    2. 将止血钳经皮下引导至肩部开口处，即导管插入的位置。
    3. 用止血钳穿透结缔组织，并在最靠头侧的位置牢固夹住导管，位置位于"5-up."基部下方。
  9. 拆下"5-up"，将导管的长端经皮下引导，从位于大鼠头部顶端的切口穿出。
    1. 使用剪刀在止血钳夹持位置下方剪断导管，并重新连接"5-up"的长端。
    2. 将导管沿"5-up"的金属轴完全拉至塑料基座处。灌注生理盐水以确认通畅无阻。
  10. 将大鼠置于仰卧位，仅缝合锁骨附近的切口。头部切口应保持 开放 状态。
  11. 将大鼠固定于立体定位仪中。使用止血钳夹住头部顶端的切口皮肤并向外牵拉，清洁并干燥颅骨表面。
  12. 使用手动钻头在颅骨上钻4至5个孔，并将机用螺钉插入孔中，作为头帽的支撑结构。
    1. 将"5-up"连接器置于螺钉之间，并将导管多余长度部分塞入先前用止血钳创建的皮下"囊袋"中。
  13. 使用牙科水泥将"5-up"固定于颅骨顶部。待水泥完全干燥后，将大鼠从立体定位仪中取出。
  14. 给予大鼠术后护理，包括皮下注射酮洛芬（镇痛剂；5 mg/kg）和2 ml生理盐水（皮下）。术后连续再给予酮洛芬2天，以帮助控制疼痛。
  15. 术后48小时 开始，在约2天的恢复期以及海洛因自我给药阶段期间，每日用肝素和庆大霉素的无菌生理盐水混合液（7.5 IU + 12 µg；0.2–0.3 ml）冲洗大鼠导管。

4. 行为学实验步骤

食物限制诱导海洛因觅药行为增强实验操作的时间线见图1。

  1. 操作性条件反射箱
    1. 将家鼠单独饲养在操作性条件反射箱内，该箱子置于配备风扇的隔音木质隔间中。
    2. 每个实验舱由不锈钢金属网格地板、前后透明有机玻璃壁以及两侧金属板壁组成。在右侧壁距离地板9 cm处安装两个可伸缩杠杆，每个杠杆上方设置一个提示灯。按压与药物配对的（有效）杠杆会激活输注泵，而按压未与药物配对的（无效）杠杆则不产生可编程的后果。
    3. 在主动杠杆上方安装一个音调模块（2.9 kHz），并在左侧壁顶部中央位置放置一个红色笼顶灯。
    4. 通过液态旋转接头和由金属弹簧保护的Tygon管路将药物泵连接至导管。此外，在每个实验舱内配备一个食槽和一个饮水瓶，以确保动物可自由获取食物和水。
  2. 适应期：
    1. 手术恢复后，将大鼠转移至操作式训练箱，使其适应环境24小时。
    2. 不要将大鼠连接到金属弹簧，也不要激活提示灯/提示音复合装置。
    3. 确保活动杠杆保持缩回状态，同时使非活动杠杆处于伸出状态，以帮助在训练期间区分两个杠杆。
  3. 海洛因自我给药：
    1. 将五通连接器连接到Tygon管并安装金属弹簧。
    2. 让大鼠在为期10天的实验中，每天进行3次持续3小时的自给海洛因（0.1 mg/kg/注射）训练，每次训练间隔3小时。
    3. 每次实验均在暗期开始后进行（本实验室约为上午9:30），首先伸出活动杠杆和非活动杠杆，同时点亮屋内灯，并启动提示灯光/声音复合信号，持续30秒。
    4. 按压主动杠杆将触发药物泵（5秒，0.13毫升/次输注）并启动20秒的超时周期，在此期间笼内灯关闭，主动杠杆上方的提示灯光/声音组合被激活（固定比率-1，20秒超时）。在超时期间，主动杠杆的按压行为会被记录，但不给予强化。非主动杠杆的按压行为也会被记录，但无任何程序设定的后果。
    5. 每次3小时的训练结束后，活动杠杆被收回，而非活动杠杆则保持伸出状态，直至次日第一次训练开始前1小时。
  4. 禁欲与食物限制：
    1. 完成自我给药训练后，将大鼠从操作性条件反射箱中移出，单独饲养于ACF环境中，并给予自由摄取食物和饮水的权利，持续一天以完成药物洗脱。
    2. 将大鼠分为两组：食物限制组（FDR）和饱食组，根据训练最后5天的体重、输注次数和主动杠杆反应次数进行匹配。
    3. 在药物洗脱日之后，移除FDR大鼠的食物，并于下午1时30分给予约15 g的大鼠饲料。在14天的戒断期间，根据需要调整饲料量，以维持FDR大鼠的体重（BW）约为其自身基线体重的90%。
  5. 觅药测试：在禁药第14天的上午，将大鼠放回操作性条件反射箱并连接至金属弹簧。进行1小时或3小时的测试阶段，期间按压主动杠杆和非主动杠杆产生的结果与自我给药训练阶段相同，但不提供药物。即 在消光条件下

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结果

随时间变化的体重：典型结果表明，在海洛因自我给药训练期间，体重保持稳定。在戒断期间，自由摄食饲料的大鼠体重增加，而食物受限的大鼠体重下降至其原始体重的约90%，或饱食大鼠体重的75-80%（图2）。

训练期间的给药次数及主动/非主动杠杆反应：随着训练天数的增加，给药次数和主动杠杆反应逐渐上升，而非主动杠杆反应则无明显变化（图3）。通常情况下，主动杠杆反应在整个训练过程中持续增加，并最终稳定在较高水平；非主动杠杆反应在整个训练期间始终保持在较低水平，表明大鼠能够准确区分两个杠杆。最后，获得的给药次数在训练过程中逐渐增加，并稳定在一个低于主动杠杆反应频率的水平。这种行为分离的出现是由于每次药物输注后存在20秒的超时（timeout）期。

测试日主动杠杆与非主动杠杆反应：食物限制组大鼠在主动杠杆上的反应显著高于饱食组大鼠（我们通常观察到处理组之间存在约250%的差异，见15）。非主动杠杆反应在食物限制组...

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讨论

此处描述的实验程序具有较强的表面效度，原因如下：1）允许动物自主摄入药物并控制给药过程；2）采用的给药途径与人类成瘾者中常见的途径一致；3）能够反映（相对）长期的药物暴露与戒断期；4）在药物寻求测试前避免了复吸实验程序中必需但在人类成瘾者中极少出现的消退训练过程14。此外，该程序还模拟了长期的食物限制状态，这在考虑热量限制对药物寻求行为影响时被认为至关重要5。

在本方案中，大鼠在整个药物自我给药期间（24小时/天）均饲养于操作性条件反射箱内。通过使用一种 "小组" 在该方案中，大鼠在每天一次的训练结束后被转移回ACF，从而允许每天对多个组别进行训练。然而，这种方法可能更适用于可卡因训练，因为海洛因更适宜在以下情况下给予 "主页" 环境16我们尚未评估使用“squad”选项对实验流程效率的影响。另一种提高流程通量的方法是将两组大鼠的药物自我给药训练错开10至12天。采用此设计时，第二组大鼠进行自我给药训练的同时，第一组大鼠在ACF中经历戒断期。第二组大鼠的自我给药训练必须在第一组计划进行...

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披露

所有实验程序均获得康考迪亚大学动物研究伦理委员会的批准，符合加拿大动物护理委员会的指导方针。作者声明不存在任何竞争性财务利益。FS 和 TD 对本文所述实验方案的开发及论文撰写均作出了同等贡献。

致谢

这项工作得到了自然科学基金的资助 & 工程委员会发现计划（美国：298915）、魁北克研究基金-健康（CSBN）以及加拿大研究主席计划（美国）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
名称公司目录编号
氯胺酮（Vetalar，100 mg/ml）Bioniche Animal Health通过当地经销商获得
赛拉嗪（Rompun，100 mg/ml）拜耳通过当地经销商获得
盐酸海洛因美国北卡罗来纳州研究三角园国家药物滥用研究所
1 mg/ml 安那芬注射液 20 ml 小瓶CDMV，加拿大12868
仪器设备
名称公司目录编号
硅胶管（内径 0.02，外径 0.037）Fisher Scientific1118915A
GE 海洋硅通用电气SE-1134
Tygon 管（内径 0.02，外径 0.060）VWR63018-044
套管针（22 G，5个装）Plastics OneC313G-5up
液体旋转接头，塑料，22 GLomir Biomedical, Inc.RSP1
固定速度输注泵（3.3 转/分钟）Coulbourn InstrumentsA73-01-3.3
大鼠测试笼Coulbourn InstrumentsH10-11R-TC
不锈钢网格地板Coulbourn InstrumentsH10-11R-TC-SF
室内光照-大鼠Coulbourn InstrumentsH11-01R
单一高亮度提示-大鼠Coulbourn InstrumentsH11-03R
2.9 kHz 音调模块Coulbourn InstrumentsH12-02R-2.9
可伸缩杠杆-大鼠Coulbourn InstrumentsH23-17RA
平衡臂Coulbourn InstrumentsH29-01
隔音衰减箱康考迪亚大学自制
系统控制器 2Coulbourn Instruments系统对照 2
系统电源底座Coulbourn InstrumentsH01-01
Habitest 通用 LincCoulbourn InstrumentsH02-08
环境连接板 & Linc 电缆Coulbourn InstrumentsH03-04
图形状态标记法 3Coulbourn InstrumentsGS3

参考文献

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