本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型,针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI 基因,确定自发产生或经基因毒素暴露后产生的DNA突变的频率、位置和类型。
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本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型,针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI 基因,确定自发产生或经基因毒素暴露后产生的DNA突变的频率、位置和类型。
近年来,人们逐渐认识到基因组不稳定性与许多发育障碍、癌症及衰老过程密切相关。鉴于干细胞在维持组织稳态和终身修复中发挥关键作用,可以合理推测干细胞群体对于保持组织基因组完整性至关重要。因此,人们日益关注内源性和环境因素对干细胞及其子代细胞基因组完整性的影响,旨在阐明干细胞相关疾病的病因学机制。
LacI 转基因小鼠携带一种可回收的λ噬菌体载体,该载体编码LacI报告系统,其中LacI基因作为突变报告基因。当LacI基因发生突变时,会表达产生β-半乳糖苷酶,该酶可切割一种显色底物并使其变为蓝色。该LacI报告系统存在于所有细胞中,包括干细胞/前体细胞,并可被轻松回收后用于感染E. coli。将感染后的E. coli在含有合适底物的琼脂糖培养基上孵育后,可对噬菌斑进行计数:蓝色噬菌斑表示含有突变型LacI基因,而无色噬菌斑则含有野生型基因。蓝色噬菌斑(相对于无色噬菌斑)的频率反映了提取DNA的原始细胞群体中的突变频率。对突变的LacI基因进行测序可确定突变在基因中的位置及突变类型。
转 LacI 转基因小鼠模型已被广泛确立为一种 体内 诱变检测方法。此外,该检测所用的小鼠和试剂均可商业获得。本文详细描述了如何利用该模型检测造血系统中干细胞富集的 Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK)细胞及其他亚群中自发产生 DNA 突变的频率。
在大多数组织中,已分化的细胞寿命有限。为了维持组织的功能完整性,长寿的、组织特异性的干细胞会持续产生祖细胞,这些祖细胞进一步分化为执行该特定组织功能所必需的完全分化细胞。干细胞还通过一种称为自我更新的过程来补充自身群体。因此,干细胞负责维持其所处组织的功能完整性。正因如此,干细胞必须具备强大的机制来感知并可能修复受损的DNA。否则,它们可能会积累多种基因组(潜在有害的)异常改变,这些改变可遗传给其子代细胞。了解干细胞在整个生物体生命周期中如何保护其基因组的完整性是一个重要的科学问题,也有助于我们理解为何基因组不稳定性与癌症及其他一些年龄相关疾病相关(详见文献1,2的综述)。
在干细胞或早期祖细胞群体水平上维持组织的基因组完整性,可通过细胞死亡、衰老或分化来清除有缺陷的干细胞(或祖细胞),和/或通过高效修复受损DNA来实现。最近的研究表明,有可能直接在这些稀有细胞群体中检测某些类型的DNA修复过程3-6。研究发现,例如在造血系统中,DNA双链断裂可通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)进行修复,其中后者是一种保真度较低的修复方式,因而出错风险更高。这两种机制在造血干细胞(HSCs)中均存在4,5,但在小鼠中,HSCs主要依赖NHEJ,而早期祖细胞则使用HR4。在皮肤干细胞中也观察到了类似现象6。有趣的是,在人类HSCs中,双链断裂的首选修复机制似乎是HR而非NHEJ3。这种跨物种的功能差异究竟是真实的生物学差异,还是仅仅反映了技术或实验条件的不同,仍有待进一步验证。
干细胞修复受损DNA的能力可能还包括其他DNA修复机制,例如碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)和错配修复(MMR)。BER和NER负责修复单链DNA中的单个或多个碱基对损伤,而MMR则修复碱基-碱基错配以及插入/缺失环;这类DNA损伤无法通过NHEJ或HR机制进行修复。支持这一观点的多项研究来自造血系统,表明这些通路中任一通路的改变与造血干细胞(HSC)区室的异常之间存在关联7-9,并且会增加患骨髓增生异常综合征的风险10-16,该疾病起源于HSC,并随着疾病进展表现出基因组不稳定性逐渐增加的特点17。迄今为止,尚未见在HSC中直接检测BER、NER和MMR活性的报道。
除了在机制层面上阐明调控组织完整性的各种过程外,还必须能够测量突变DNA的程度,以便检验这些过程中某一过程发生异常所导致的后果,例如在正常干细胞与基因工程改造的干细胞之间,或在老年与年轻个体之间。然而,由于组织特异性干细胞数量稀少,且缺乏能够维持其"干性"的培养条件,开发相关检测方法十分困难。此外,此类检测方法还应适用于环境和遗传因素的操控。解决这些局限性和要求的一个可行方案是使用经过特殊基因工程改造、可用于检测DNA突变的小鼠模型。
已开发出多种用于突变检测的转基因小鼠模型。例如, LacI 转基因小鼠18 携带一种可回收的λ噬菌体载体,该载体编码 LacI 报告系统,其中的 LacI 基因编码一种抑制因子,可抑制 Lac 操作子,并作为突变报告基因。当发生突变时 LacI 基因,该 Lac 操纵子被激活,从而产生β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶可切割生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷),使其变为蓝色。 cos 侧翼位点 LacI 载体可通过λ噬菌体蛋白实现简便回收,并进一步用于感染 E. coli孵育感染后 E. coli 在含有X-gal底物的琼脂糖上,可对噬菌斑进行计数。蓝色噬菌斑含有假定突变体 Lac-I 携带噬菌体的为蓝色噬菌斑,而清晰的噬菌斑则含有非突变体。蓝色噬菌斑在清晰噬菌斑中的频率反映了原始细胞群体中突变体的频率,该DNA即提取自这一群体。此外,宿主为λ噬菌体的 LacI 靶标可通过PCR技术进行测序,适用于相对高通量的分析。对多个突变体进行测序 LacI 基因将揭示突变谱的重要信息,进而可能提示特定DNA修复通路的潜在缺陷或特定的基因毒性事件。 LacI 转基因系统已在多个实验室中实现标准化19 且试剂可商业获取。该方法的一个主要缺点是 LacI 系统的局限性在于检测大片段缺失或重排的能力有限;因此,需要采用其他方法 例如 为弥补这一不足,需要在中期染色体铺展上使用多色荧光原位杂交(multi-color FISH)。
在 LacI 小鼠模型的 λ 噬菌体载体中,存在一个更小的基因 CII,可用于突变分析。由于其基因较小,且突变体可被筛选,因此该检测方法比 LacI 基因分析更省力且成本更低20。然而,LacI 基因在诱变研究方面更为深入21,且该基因对突变的敏感性已得到充分表征,因此对于哪些氨基酸残基能在显色底物上产生表型反应已有明确的认识22-25。
用于突变检测的其他小鼠模型包括使用ΦX174或LacZ转基因。ΦX174转基因小鼠模型通过最初的A:T→G:C回复突变检测方法26,或可检测一系列碱基对替换的正向突变检测方法27,其成本低于LacI模型。然而,正向突变检测中的突变筛选并不简单,且ΦX174转基因的突变谱不如LacI模型那样被充分表征。在携带LacZ转基因的小鼠模型中,LacZ突变报告基因的回收依赖于对半乳糖敏感并在含半乳糖培养基中生长的E. coli宿主细胞28。该系统的一个缺点是,LacZ靶标的回收还需经过限制性内切酶消化、连接以及E. coli宿主的电穿孔等步骤,因此难以适用于少量细胞的分析。尽管在处理干细胞/祖细胞群体时这并非绝对限制(可通过增加小鼠数量来弥补),但如果需要大量细胞(例如数百万个或更多),该方法将迅速变得不切实际且成本过高。此外,LacZ基因相对较大的尺寸虽然提供了高灵敏度的突变报告功能,但在DNA测序分析和突变谱确定方面却更为繁琐且成本更高。然而,该模型的一个主要优势在于其能够检测大片段缺失、插入以及染色体重排。
由于 LacI、ΦX174 和 LacZ 转基因小鼠模型的所有细胞均携带报告系统,因此只要能够可靠地分离并获得足够数量,这些小鼠模型中的任何一种均可用于检测任何目标细胞类型(包括干细胞和前体细胞)中的诱变作用。由于我们对 LacI 小鼠模型及 LacI 突变检测技术具有丰富的研究经验,因此决定进一步采用该系统对造血干细胞和前体细胞群体中的诱变作用进行分析。
造血组织在其各个组分的细胞表面表型方面已有充分表征,包括可长期重建造血的干细胞,这类干细胞可被识别为极为稀有的 Lin-IL7R-Sca-1+cKit++(LSK)/ Flk2-CD150+CD48- 细胞群体29。Mohrin et al.4 证明,LSK/Flk2- 细胞这一略大的群体在研究DNA修复时,仍可作为造血干细胞(HSC)的良好代表,并且与最原始的定向髓系祖细胞(CMP)群体存在显著差异。此外,当将富集HSC的LSK(Flk-2+ 和 Flk-2-)细胞与 Lin-IL7R-Sca-1-cKit++(LS-K 祖细胞)进行比较时,富集程度较低的干细胞富集型LSK群体与祖细胞之间在非同源末端连接(NHEJ)能力上仍存在显著差异5。在本研究中,我们采用富集HSC的LSK(Flk-2+ 和 Flk-2-)细胞,因为我们发现,在该诱变检测中要获得稳定可靠的结果,至少需要 2 × 105 个细胞;而若分选 LSK/Flk2-CD150+CD48 细胞群体,甚至仅分选 LSK/Flk2- 群体,在小鼠数量、成本和实际操作性方面都极难达到这一细胞数量。本方案基于Kohler et al.18 最初建立的方法,详细描述了如何测定LSK细胞、特定分化的髓系细胞群体,以及未经分离的骨髓和脾脏细胞中的自发性DNA突变频率。
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在C57BL/6遗传背景下,LacI转基因小鼠的白细胞不表达Sca-1(图1)。因此,如果使用Sca-1作为细胞纯化的标记物,则需要将这些小鼠与适当的品系杂交以获得Sca-1表达;在本方案中,采用普通C57BL/6(B6)小鼠与LacI(C57BL/6)转基因小鼠(LacI)杂交产生的F1代小鼠(图1)。在本方案所用的细胞群体中,LSK细胞和CMP细胞在骨髓中所占比例最小。为了每次分选至少纯化出2 × 105个细胞,若仅从后肢收集骨髓,则需合并约十只小鼠的骨髓;若同时使用髋部、前肢、脊柱和胸骨的骨骼,则至少需要四只小鼠。
将骨髓和脾脏制成单细胞悬液。少量骨髓直接使用,大部分用于分离纯化LSK细胞及分化中的髓系祖细胞。 即 通过荧光激活细胞分选(FACS)分离CMPs和粒细胞/单核细胞前体细胞(GMPs)。骨髓细胞的分离及这些细胞群体的FACS纯化方法在其他文献中已有描述。30-32大约需要进行六次独立分选,才能识别出不同群体间突变频率的显著差异。
以下用于测量自发性的实验方案 体内 根据多个Stratagene说明书改编的纯化造血亚群中突变频率检测方法33-35,基于 Kohler 的原创工作 等18 现有方案之间最关键的差异33-35 当使用相对少量细胞时,本方案在蛋白酶K孵育所用的试剂体积、时间及温度上有所差异。
1. 样品保存
收集所需细胞群体后,将细胞分装至1 ml离心管中(每份细胞数量参见表1)。在4 °C条件下,以266 × g离心7分钟。小心吸除上清液。将离心管放入液氮中冷冻5分钟,然后转移至-80 °C冰箱中以备后续使用。样品可保存至少6个月。
2. 基因组DNA的提取
3. 托盘的准备工作 E. coli/噬菌体培养(第1天)
每个培养皿将包含两层不同的凝胶:底部为琼脂层,顶部为含有X-gal的琼脂糖层。 E. coli将向后者加入噬菌体溶液。分离出的细胞数量和类型将决定所需培养皿的数量。请查阅 表1 用于计算本实验步骤所需的托盘数量以及相应溶液的用量。以下方案将制备约60个托盘,可由一名有经验的人员轻松处理。
4. 托盘的准备工作 E. coli噬菌体培养(第2天)
5. 基因组DNA的包装(第2天;继续)
6. 基因组DNA涂布(第2天;继续)
7. 假定突变频率的测定(第3天)
8. 假定突变噬斑的验证(第3-5天)
9. 对 LacI G基因进行突变测序
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该 体内 突变检测实验是在大量事件(所有PFU)中测量罕见事件(突变PFU)。当使用少量细胞进行该实验时,结果可能受到假阳性与假阴性结果的显著影响。为解决此问题,我们采用来自三只不同动物的未分选骨髓细胞进行了系列稀释实验。利用1.4 × 106,7.0 × 105,3.5 × 105,以及 1.75 x 105 细胞。结果(图7) 显示输入细胞数量与产生的噬斑形成单位(PFU)数量之间存在线性关系。重要的是,无论使用较少或较多数量的细胞进行测量,突变频率均保持一致。尽管由于细胞数量有限而未直接验证,但没有理由认为这一情况不适用于LSK细胞和GMP细胞。
该诱变检测实验中最重要的步骤是基因组DNA的提取(步骤2)。虽然DNA浓度理想情况下应≥500 ng/μl,但本方案在40–150 ng/μl范围内同样效果良好。更为关键的是260/280比值(应为>1.8–2.0)和分子量(应在300–500 kb左右)。对于不熟悉该检测的操作者,建议检...
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本文所述的体内诱变检测方法基于Kohler et al.18最初构建的LacI转基因小鼠模型。该模型利用携带lacI报告基因的λ噬菌体载体。cos位点位于载体两侧,可实现载体的简便回收,并随后包装成具有感染性的噬菌体颗粒,用于感染E. coli。若被噬菌体感染的E. coli中含有发生突变的LacI基因,则会形成蓝色噬菌斑。蓝色噬菌斑出现在无色背景之上,从而极大简化了突变体的计数工作。通过DNA测序技术可确定所发生突变的位置和类型,这有助于进一步研究诱变的潜在机制。
我们对该诱变检测方案所做的改进使其可用于经FACS纯化的造血细胞群体。然而,我们发现,要获得足量的高质量DNA,可重复的分析仍需要至少2 × 105个造血细胞。由于长期重建造血干细胞(HSCs)的频率极低29,目前尚无法对这些HSCs进行诱变分析。本方案中使用的干细胞富集群体——LSK细胞,除包含Flk-2
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作者声明 不存在相互竞争的经济利益。
我们感谢 David R. Rodriguez(文学硕士)在本文的平面设计和摄影方面提供的帮助。本研究得到了 GCCRI、美国国立卫生研究院衰老研究所(NIH/NIA,项目编号:5R21AG033339)以及癌症中心支持基金(P30CA054174)对德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校(UTHSCSA)流式细胞术核心设施和高级核酸核心设施的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LacI 转基因小鼠 | BioReliance 公司 | ||
| RecoverEase DNA 提取试剂盒(包含 RNace-It 核糖核酸酶混合液) | 安捷伦科技(Stratagene) | 720202 | |
| Transpack 包装提取物,包括橙色和蓝色 Transpack 管以及 SCS-8 大肠杆菌 | 安捷伦科技(Stratagene) | 200221 | |
| DNA 分子量标准 – λ DNA 阶梯 | 伯乐 | 170-3635 | |
| 0.025 mM 孔径膜 | Fisher(Millipore) | VSWP 025 00 | |
| 245 mm2 生物测定培养皿(托盘) | Fisher (Corning) | 07-200-600 | |
| NZY肉汤(粉末) | Fisher(Teknova) | N1144 | |
| 琼脂 | Fisher | BP1423-500 | |
| 琼脂糖 | Fisher | E-3120-500 | |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Fisher | AC34843-5000 | |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 | |
| 蛋白酶K | 罗氏 | 3-115-852 | |
| PCR 扩增 Taq 聚合酶试剂盒 | 5 端 | 2200500 | |
| Agencourt AMPure XP 纯化试剂盒 | 贝克曼库尔特 | A63880 |
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