方法文章

在纯化的造血干细胞/祖细胞中鉴定DNA突变

DOI：

10.3791/50752

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2014年2月24日

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1Greehey Children's Cancer Research Institute, UT Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cellular and Structural Biology, UT Health Science Center at San Antonio, 3Department of Pathology, UT Health Science Center at San Antonio, 4Department of Microbiology, UT Health Science Center at San Antonio, 5Cancer Therapy and Research Center, UT Health Science Center at San Antonio

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用 LacI 转基因小鼠模型，针对少量纯化的造血细胞进行 体内 诱变分析的实验方法。 可通过分离 LacI 基因，确定自发产生或经基因毒素暴露后产生的DNA突变的频率、位置和类型。 

摘要

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近年来，人们逐渐认识到基因组不稳定性与许多发育障碍、癌症及衰老过程密切相关。鉴于干细胞在维持组织稳态和终身修复中发挥关键作用，可以合理推测干细胞群体对于保持组织基因组完整性至关重要。因此，人们日益关注内源性和环境因素对干细胞及其子代细胞基因组完整性的影响，旨在阐明干细胞相关疾病的病因学机制。

LacI 转基因小鼠携带一种可回收的λ噬菌体载体，该载体编码LacI报告系统，其中LacI基因作为突变报告基因。当LacI基因发生突变时，会表达产生β-半乳糖苷酶，该酶可切割一种显色底物并使其变为蓝色。该LacI报告系统存在于所有细胞中，包括干细胞/前体细胞，并可被轻松回收后用于感染E. coli。将感染后的E. coli在含有合适底物的琼脂糖培养基上孵育后，可对噬菌斑进行计数：蓝色噬菌斑表示含有突变型LacI基因，而无色噬菌斑则含有野生型基因。蓝色噬菌斑（相对于无色噬菌斑）的频率反映了提取DNA的原始细胞群体中的突变频率。对突变的LacI基因进行测序可确定突变在基因中的位置及突变类型。

转 LacI 转基因小鼠模型已被广泛确立为一种 体内 诱变检测方法。此外，该检测所用的小鼠和试剂均可商业获得。本文详细描述了如何利用该模型检测造血系统中干细胞富集的 Lin-IL7R-Sca-1+cKit++（LSK）细胞及其他亚群中自发产生 DNA 突变的频率。

引言

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在大多数组织中，已分化的细胞寿命有限。为了维持组织的功能完整性，长寿的、组织特异性的干细胞会持续产生祖细胞，这些祖细胞进一步分化为执行该特定组织功能所必需的完全分化细胞。干细胞还通过一种称为自我更新的过程来补充自身群体。因此，干细胞负责维持其所处组织的功能完整性。正因如此，干细胞必须具备强大的机制来感知并可能修复受损的DNA。否则，它们可能会积累多种基因组（潜在有害的）异常改变，这些改变可遗传给其子代细胞。了解干细胞在整个生物体生命周期中如何保护其基因组的完整性是一个重要的科学问题，也有助于我们理解为何基因组不稳定性与癌症及其他一些年龄相关疾病相关（详见文献1,2的综述）。

在干细胞或早期祖细胞群体水平上维持组织的基因组完整性，可通过细胞死亡、衰老或分化来清除有缺陷的干细胞（或祖细胞），和/或通过高效修复受损DNA来实现。最近的研究表明，有可能直接在这些稀有细胞群体中检测某些类型的DNA修复过程3-6。研究发现，例如在造血系统中，DNA双链断裂可通过同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）进行修复，其中后者是一种保真度较低的修复方式，因而出错风险更高。这两种机制在造血干细胞（HSCs）中均存在4,5，但在小鼠中，HSCs主要依赖NHEJ，而早期祖细胞则使用HR4。在皮肤干细胞中也观察到了类似现象6。有趣的是，在人类HSCs中，双链断裂的首选修复机制似乎是HR而非N....

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方案

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在C57BL/6遗传背景下，LacI转基因小鼠的白细胞不表达Sca-1（图1）。因此，如果使用Sca-1作为细胞纯化的标记物，则需要将这些小鼠与适当的品系杂交以获得Sca-1表达；在本方案中，采用普通C57BL/6（B6）小鼠与LacI（C57BL/6）转基因小鼠（LacI）杂交产生的F1代小鼠（图1）。在本方案所用的细胞群体中，LSK细胞和CMP细胞在骨髓中所占比例最小。为了每次分选至少纯化出2 × 105个细胞，若仅从后肢收集骨髓，则需合并约十只小鼠的骨髓；若同时使用髋部、前肢、脊柱和胸骨的骨骼，则至少需要四只小鼠。

将骨髓和脾脏制成单细胞悬液。少量骨髓直接使用，大部分用于分离纯化LSK细胞及分化中的髓系祖细胞。 即 通过荧光激活细胞分选（FACS）分离CMPs和粒细胞/单核细胞前体细胞（GMPs）。骨髓细胞的分离及这些细胞群体的FACS纯化方法在其他文献中已有描述。30-32大约需要进行六次独立分选，才能识别出不同群体间突变频率的显著差异。

以下用于测量自发性的实验方案 体内 根据多个Stratagene说明书改编的纯化造血亚群中突变频率检测方法33-35，基于 Kohler 的原创工....

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结果

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的 体内 诱变试验通过在大量事件（所有PFU）中测量罕见事件（突变PFU）来进行。当使用较少数量的细胞进行该试验时，结果可能受到假阳性与假阴性结果的显著影响。为解决这一问题，我们采用来自三只不同动物的未分选骨髓细胞进行了系列稀释实验。利用1.4 x 10⁵6，7.0 × 105，3.5 × 105，以及 1.75 × 105 细胞。结果（图7) 显示输入细胞数量与产生的PFU数量之间存在线性关系。重要的是，无论使用较少或较多数量的细胞进行测量，突变频率均保持一致。尽管由于细胞数量有限而未直接验证，但没有理由认为这一情况不适用于LSK细胞和GMP细胞。

该突变检测实验中最重要的步骤是基因组DNA的提取（步骤2）。虽然DNA浓度理想情况下应≥500 ng/μl，但本方案在40–150 ng/μl范围内也能良好运行。更为关键的是260/280比值（应>1.8–2.0）以及分子量（应在300–500 kb左右）。建议不熟悉该实验操作的研究者检查所.......

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讨论

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本文所述的体内诱变检测方法基于Kohler et al.18最初构建的LacI转基因小鼠模型。该模型利用携带lacI报告基因的λ噬菌体载体。cos位点位于载体两侧，可实现载体的简便回收，并随后包装成具有感染性的噬菌体颗粒，用于感染E. coli。若被噬菌体感染的E. coli中含有发生突变的LacI基因，则会形成蓝色噬菌斑。蓝色噬菌斑出现在无色背景之上，从而极大简化了突变体的计数工作。通过DNA测序技术可确定所发生突变的位置和类型，这有助于进一步研究诱变的潜在机制。

我们对该诱变检测方案所做的改进使其可用于经FACS纯化的造血细胞群体。然而，我们发现，要获得足量的高质量DNA，可重复的分析仍需要至少2 × 105个造血细胞。由于长期重建造血干细胞（HSCs）的频率极低29，目前尚无法对这些HSCs进行诱变分析。本方案中使用的干细胞富集群体——LSK细胞，除包含Flk-2

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披露

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作者声明 不存在相互竞争的经济利益。

致谢

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我们感谢 David R. Rodriguez（文学硕士）在本文的平面设计和摄影方面提供的帮助。本研究得到了 GCCRI、美国国立卫生研究院衰老研究所（NIH/NIA，项目编号：5R21AG033339）以及癌症中心支持基金（P30CA054174）对德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校（UTHSCSA）流式细胞术核心设施和高级核酸核心设施的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
LacI 转基因小鼠 BioReliance 公司
RecoverEase DNA 提取试剂盒（包含 RNace-It 核糖核酸酶混合液）安捷伦科技（Stratagene）720202
Transpack 包装提取物，包括橙色和蓝色 Transpack 管以及 SCS-8 大肠杆菌安捷伦科技（Stratagene）200221
DNA 分子量标准 – λ DNA 阶梯伯乐170-3635
0.025 mM 孔径膜 Fisher（Millipore）VSWP 025 00
245 mm2 生物测定培养皿（托盘） Fisher (Corning)07-200-600
NZY肉汤（粉末）Fisher（Teknova）N1144
琼脂FisherBP1423-500
琼脂糖FisherE-3120-500
N,N-二甲基甲酰胺FisherAC34843-5000
X-galResearch Products Intl Corp (RPI)B71800-10.0
蛋白酶K罗氏3-115-852
PCR 扩增 Taq 聚合酶试剂盒5 端2200500
Agencourt AMPure XP 纯化试剂盒贝克曼库尔特A63880

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
  2. Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).

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标签

LacI DNA LacI

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