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通过制备型薄层色谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析蝙蝠皮肤脂质中的三酰甘油成分

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DOI：

10.3791/50757

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2013年9月5日

 ,  , 
1Graduate Program of Environmental Science, Arkansas State University, 2Department of Biological Sciences, Arkansas State University, 3Arkansas Biosciences Institute and College of Agriculture and Technology, Arkansas State University

本文内容

摘要

哺乳动物皮肤及其附属结构含有可溶剂提取的脂质，这些脂质可提供具有物种特征性的化学组成。本文介绍了一种常规方法，利用薄层色谱法分离自皮肤及其附属组织中提取的各类主要脂质，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定其甘油三酯谱型。

摘要

哺乳动物的皮肤附属器包含皮脂腺，可向皮肤表面分泌油性物质。皮脂的生成是先天免疫系统的一部分，对病原微生物具有防护作用。皮脂分泌异常及其化学成分改变也是某些皮肤疾病的临床症状。皮脂含有复杂的脂质混合物，其中包括具有物种特异性的三酰甘油。由于多种脂质类别表现出广泛的化学特性，阻碍了对皮脂成分的特异性测定。脂质分析技术通常需要进行化学衍生化处理，这类操作耗时费力，并增加样品制备成本。本文介绍如何从哺乳动物皮肤附属器中提取脂质，通过薄层色谱法分离主要脂质类别，并利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析三酰甘油成分。该方法稳定可靠，可直接测定不同物种及个体间的三酰甘油谱型，且可便捷地应用于任何哺乳动物分类群。

引言

哺乳动物的皮肤组织包括表皮、角质结构（例如 毛发和指甲）以及外分泌腺。皮脂型外分泌腺与毛囊相关联，两者共同构成毛囊皮脂腺单位1。皮脂腺会向皮肤表面释放一种油性分泌物，称为皮脂。皮脂主要由甘油酯类（例如 三酰甘油 [TAGs]）、游离脂肪酰基（FFAs）、甾醇/蜡酯和角鲨烯组成。皮脂的化学组成具有物种特异性2。除了作为先天免疫系统的一部分并发挥抗菌功能3外，皮脂脂质还影响多种重要的生理过程，包括经皮肤的蒸发性水分流失4、细胞完整性与基因调控5以及药物吸收6。皮脂脂质的组成也可作为疾病标志物。皮脂中各大类脂质的比例和含量改变是多种疾病的临床表现，如寻常痤疮7、头皮屑8、脂溢性皮炎8、无脂症9等10。表皮和毛发组织中含有成分各异的脂质谱，包括甾醇及其衍生物、三酰甘油（TAGs）、游离脂肪酸（FFAs）、神经酰胺、磷脂及其他微量脂质成分。由于皮肤脂质可能参与疾病过程，因此确定健康个体与患病个体之间三酰甘油化学组成的差异，可能对疾病的临床诊断具有重要意义。

脂质通常被定义为不溶于水、具有非极性或非极性-极性取代基的有机化合物11。脂质结构可以是长链烃、含氧烷烃（包括蜡酯、游离脂肪酸、醇类、酮类和醛类），或如胆固醇等复杂的环状结构12。根据结构可分为八大类脂质（游离脂肪酸、甘油酯[GL]、甘油磷脂[GP]、鞘脂[SP]、固醇脂质[ST]、类异戊二烯脂质[PR]、糖脂[SL]和聚酮[PK]），不同类别表现出广泛的化学性质差异13。由于各类脂质的化学性质差异较大，理想的方法是无需预先衍生化即可直接进行脂质分子的分析。近年来脂质研究中兴起的一种方法是薄层色谱（TLC）与基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）联用技术14。

MALDI-TOF MS 因其对肽离子质量的高精度测定，被广泛应用于蛋白质组学研究中，用于鉴定蛋白质并将其与特定的氨基酸序列相关联 "指纹" 由胰蛋白酶消化的蛋白质生成15MALDI-TOF MS 还可用于分析其他生物分子类别，包括甘油三酯（TAGs）等脂质16-18基质辅助激光解吸电离（MALDI）需要使用基质，通常为含有芳香环和共轭双键结构的有机化合物。基质分子可将激光能量温和地传递给待分析物，促进质子转移，并生成单电荷的气相离子19-21离子在高真空条件下经高电压场作用被加速进入飞行时间（TOF）质量分析器，其中离子根据其质荷比决定的速度差异而实现分离。即使是非常大的生物大分子也可被电离且几乎不发生碎裂，从而产生单一电荷的分子离子物种，简化了质谱分析。MALDI-TOF MS 能够无需事先衍生化而直接分析脂质分子，因而被脂质组学研究广泛采用18.

本文介绍了一种常规方法，用于从东部红蝙蝠（Lasiurus borealis）的毛发、皮脂分泌物以及翼膜中分离和分析皮肤脂质。该方法可用于确定蝙蝠皮肤脂质的种间差异，从而阐明白鼻综合征（White-Nose Syndrome, WNS）的发病机制22。WNS 是一种由新近描述的嗜冷真菌Geomyces destructans引起的蝙蝠真菌性疾病23-25。该病已导致超过500万只北美洞栖蝙蝠死亡，并威胁到一些易感蝙蝠物种的生存，可能对农业产业造成数十亿美元的经济损失26,27。为了研究G. destructans感染过程中的变化，从东部红蝙蝠的毛发和翼膜组织中提取脂质，并通过薄层色谱法（TLC）将其分离为不同的主要脂质类别，以分离出甘油三酯（TAG）组分，随后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行分析。TAG含有较短的酰基链，且在MALDI-TOF MS检测中信号明显，基质干扰小，易于检出。

方案

警告：请提前获取处理、运输和储存蝙蝠所需的所有州级和联邦许可。还必须获得所在机构动物护理与使用委员会以及机构生物安全委员会的批准。如果需要接触活体蝙蝠（或神经系统组织），操作人员应接种狂犬病疫苗。本研究中使用的蝙蝠于2010年夏季根据标准方法从阿肯色州的奥扎克-圣弗朗西斯国家森林采集（阿肯色州立大学机构生物安全委员会批准编号 # 135349-1）28。

1. 组织处理与脂质提取

  1. 在采集不同个体的组织样本之前及之间，均需用甲醇清洁所有器械。使用剪刀从皮肤上剪取毛发（约1.0 g），置于125 ml锥形瓶中。用4–6个浸有氯仿:甲醇溶剂（C:M；3:2 v/v）的棉球擦拭翼部表面以采集皮脂，并将这些棉球放入另一个锥形瓶中。
  2. 用含有0.5%丁基化羟基甲苯（BHT）的10 ml氯仿:甲醇（2:1 v/v）提取组织，以防止氧化29仅使用高效液相色谱级溶剂。
  3. 2小时后，向每个烧瓶中加入约0.5 g无水硫酸盐，短暂混合，然后通过滤纸过滤收集溶剂。
  4. 重复步骤 1.2 和 1.3 两次，第一次使用 1:1 C:M，随后使用 1:2 C:M。合并滤液。
  5. 在 N₂ 气流下蒸发合并的滤液2，测定干重后，将脂质残留物溶解于3:2的氯仿:甲醇溶液（含0.5% BHT）中，浓度为10 mg/ml。样品储存于玻璃小瓶中，置于-20 °C保存。通常建议在样品采集后一个月内完成分析，并尽量减少冻融循环次数。

2. 通过制备型薄层色谱法分离脂质

  1. 提前准备经溶剂清洗的1.5 ml微量离心管：用3:2的C:M溶液（氯仿:甲醇）填充，丙酮冲洗，然后空气干燥。此步骤旨在去除可能干扰后续质谱分析的增塑剂。将样品管储存于无尘容器中，并仅戴手套操作，以防止皮肤油脂污染。
  2. 用3:2的氯仿:甲醇（C:M）溶剂对薄层色谱板进行预展开活化。向薄层色谱展开槽中加入足够量的溶剂，使其深度达到1 cm，然后将色谱板放入展开槽中（用玻璃盖盖紧），让溶剂完全上升至板的顶端。此过程约需45分钟。
  3. 移去平板，在通风橱中干燥至溶剂完全挥发（约15分钟），然后置于120 °C烘箱中至少10分钟。在平板顶端用铅笔做标记，以确保加样时保持方向一致。在距平板底边1.5 cm处用铅笔画一条直线，作为样品和标准品点样的基线。
  4. 通过裁剪一张足够大的滤纸，以衬于薄层色谱（TLC）展开室的两个短边和一个长边内壁。将滤纸衬层放入展开室中，当溶剂加入展开室后，滤纸会完全润湿。
  5. 配制100 ml流动相溶剂，即正己烷:乙醚:乙酸（H:E:A；80:20:2，v/v/v）。将溶剂倒入层析缸中，液面深度约为1 cm。用玻璃盖盖住层析缸，沿缸口顶部边缘涂抹硅脂密封。使用前让层析缸平衡过夜。
  6. 用毛细管或移液器将样品手动点样至已制备好的薄层色谱板上，从一端边缘约1.5 cm处开始，连续划线至另一端边缘前1.5 cm处。推荐使用自动点样仪，因其可形成更均匀的条带。在薄层色谱板的外侧通道点样约20 μl的甾醇、游离脂肪酸（FFAs）、甘油三酯（TAGs）和甾醇酯标准品混合物（浓度为10 mg/ml；可使用市售预混制剂）。
  7. 将点样后的薄层色谱板放入已平衡的展开 chamber 中，盖上盖子，展开至溶剂前沿到达板的顶端边缘。使用此处所述的流动相展开约需 45 分钟。从 chamber 中取出色谱板，置于通风橱中挥干多余溶剂约 1 分钟。
  8. 用含0.05%罗丹明6G的95%乙醇溶液喷雾染色，在长波长紫外灯下观察脂质条带，并用铅笔标记Rf 确定样品和标准品中荧光条带的位置。此时可拍摄照片记录。
  9. 确定与TAG标准品对应的条带，用刮刀将硅胶刮下并转移至一张较大的玻璃纸称量纸上。将硅胶转移至一个经溶剂清洗过的1.5 ml微量离心管中。
  10. 向样品管中加入1.0 ml 3:2 C:M溶剂，超声1分钟，离心沉淀二氧化硅，然后将上清液转移至一支预先称重的新管中。重复上一步骤，合并滤液，并在氮气气流下蒸发溶剂2.
  11. 将含有TAGs的干燥残留物在氮气环境下储存2 在4 °C避光条件下孵育，同时通过薄层色谱法（TLC）分离额外的组织样品。样品中含有罗丹明6G，但其在正己烷中不溶，因此在质谱分析前的样品溶解过程中被迅速去除。

3. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行TAG分析

  1. 将10 mg CHCA溶解于1 ml溶剂（49.5%乙醇、49.5%乙腈和1%含0.1%三氟乙酸的水溶液）中，配制新鲜的α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）基质溶液。
  2. 准备促肾上腺皮质激素（ACTH；18-39 片段，2465.1989 Da），用于仪器分辨率和灵敏度测试：将 1 μl ACTH（1 mg/ml）与 39.5 μl 0.1% 三氟乙酸（TFA）混合，得到 10 pmol/μl 的储备液。该溶液可于 -20 °C 保存，以备后续使用。
  3. 取1 μl浓度为10 pmol/μl的ACTH储备液，加入9 μl 0.1% TFA，配制成1 pmol/μl的新鲜工作液，再与10 μl CHCA基质溶液等体积混合，得到浓度为500 fmol/μl的溶液。
  4. 在3:2的氯仿:甲醇（C:M）溶液中配制浓度为10 mg/ml的TAG标准品，用于MALDI仪器校准（例如 三癸酸甘油酯 [470.361 Da]、三辛酸甘油酯 [554.455 Da]、三月桂酸甘油酯 [638.549 Da]、三棕榈酸甘油酯 [722.642 Da]、三棕榈油酸甘油酯 [800.689 Da]、三肉豆蔻酸甘油酯 [806.736 Da]、三油酸甘油酯 [884.783 Da]、三亚油酸甘油酯 [968.877 Da] 和三芥酸甘油酯 [1052.971 Da]。
  5. 以3:2的氯仿:甲醇（C:M）配制10 mg/ml的三油酸甘油酯，作为外部锁质量校准的TAG标准品。
  6. 将储存的TAG样品溶解于正己烷中，配制成10 mg/ml的溶液。
  7. 配制 0.5 M（77.06 mg/1.0 ml）的 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）储备液，使用 90% 甲醇作为样品和标准基质。同时配制 1.0 M（2.0 g/50.0 ml）的 NaOH 溶液。用铝箔包裹盛有 DHB 溶液的试管，避光保存。
  8. 在预清洗的离心管中，加入 10.0 μl DHB 基质、10.0 μl 样品或标准品以及 5.0 μl 1.0 M NaOH，混匀后短暂离心，使混合液沉至管底。
  9. 将1.0 μl的标准品、样品或ACTH点样至MALDI不锈钢靶板上，置于干燥器中直至干燥。将靶板放入仪器中进行数据采集。
  10. 在正离子反射模式下进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析。使用促肾上腺皮质激素（ACTH）和三酰甘油（TAG）标准溶液，按照仪器制造商的说明对仪器进行调谐和校准。
  11. 获取靶板上每个样品点的质谱数据（参数需符合仪器规格；本实验采用的参数为：激光发射频率5 Hz，每点采集约100次以获得平均谱图）。对MALDI质谱数据进行平滑处理并扣除背景后，使用在线搜索引擎LIPID MAPS手动处理离子峰www.lipidmaps.org/tools/ms/glycerolipids_batch).
  12. 将谱图列表复制粘贴至前体离子列表及强度框中。将搜索范围限定为所需的酰基组成。根据各样本谱图中出现的离子质荷比（m/z）鉴定三酰甘油（TAGs）。若已有通过独立的气相色谱-质谱（GC/MS）分析获得的脂肪酸甲酯（FAME）百分比数据，可将这些数据加入以计算存在的三酰甘油的可能概率。

仪器：本研究中使用的质谱仪为沃特斯 MALDI Micro MX（配备 337 nm 20 Hz 的 N2 激光器）。任何厂商生产的具有正离子反射模式功能的 MALDI 仪器均可使用。所用的一般参数设置为：脉冲电压 2,000 V；反射器电压 5,200 V；源电压 15,000 V，数据采集使用 MassLynx 软件（版本 4.0）。这些操作条件可提供高于 12,000 的质谱分辨率。

结果

Folch30描述的从组织中分离总脂质的提取方法是一种简单的操作流程，本文对此进行了适当调整。在组织提取并蒸发溶剂后，脂质通常呈现为淡黄色薄膜。这种黄色很可能来源于蛋白质污染物，可通过液-液萃取去除。但在本实验中无需进行额外的样品处理步骤，因为制备型薄层层析（TLC）能够将三酰甘油（TAG）组分与这些污染物分离开。在所有过滤步骤中加入新鲜的无水硫酸钠，有助于减少水分污染，从而确保脂质称重结果的准确性。

使用H:E:A作为流动相，通过制备型薄层色谱（TLC）对哺乳动物皮肤脂质进行分析时，通常可分离出四种不同的条带，分别对应于（从原点开始）甾醇、游离脂肪酸（FFA）、三酰甘油（TAG）以及甾醇酯/蜡酯/角鲨烯（图1）。在某些情况下，若采用高效分析型（HP）TLC并以H:E:A为流动相，甾醇酯、蜡酯和角鲨烯会彼此分离，呈现为三条独立的条带。在本研究采用的条件下，甾醇酯与蜡酯未被分开。如果需要对这些条带进行分辨，可将流动相更换为异辛烷:乙醚（95:5 v/v），并通过扫描光密度法对高效薄层色谱（HPTLC）板进行分析。其他因素也可能导致分离效果不佳。通过在展开槽中放置滤纸、在盖子上涂抹凡士林以确保密封性、前夜充分平衡展开槽，以及保持TLC展开槽的清洁，通常可消除这些问题，从而获得稳定且高质量的TLC分离结果和数据。

显示了从东部红蝙蝠中分离出的三酰甘油（TAG）的代表性基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）图谱（见图2和图3）。这些图谱包含质荷比（m/z）在850–910范围内的TAG离子峰，该范围对于从非水生哺乳动物中分离的TAG具有典型性。添加1.0 M NaOH可促进形成比H+离子更稳定的单电荷Na+离子。除了提高稳定性外，H+和K+离子的缺失也使图谱分析更为简便。质荷比（m/z）850–910范围内的离子峰对应于TAG中主要的酰基组分，即16:0、18:0、18:1和18:2脂肪酸（FA）部分（见表1）。TAG可能的脂肪酸组分可初步通过MALDI-TOF质谱图中出现的总离子m/z值来确定，并据此推断不同物种和个体之间的差异。然而，若需获得酰基组分的具体比例，则必须使用串联质谱（MS/MS）或气相色谱（GC/MS）。通过观察图谱中二酰甘油区域的峰，可进一步推断酰基比例信息（见图4）。二酰甘油是由MALDI源中TAG发生碎裂而产生的，在m/z 590–650范围内可观察到。通过省略1.0 M NaOH的添加，可增强TAG的碎裂16。东部红蝙蝠的翼膜组织在m/z 879.7处呈现一个主导峰，而毛发组织的主导峰位于m/z 881.8（分别见图2和图3）。在毛发组织中，m/z 907.8、879.7和855.7（POP、PPoS）处的峰强度大致相等（约50%），而853.7处的峰强度约为40%。

组成元素组成观测质量
Na+TAGs Na+TAGs
SSOC57H108O6911.8
OOS, LSSC57H106O6909.8
OOO, LnSS, LSOC57H104O6907.8
LOO, LLSC57H102O6905.8
LLO, OOLnC57H100O6903.7
LLLC57H98O6901.7
LLLnC57H96O6899.7
LLnLnC57H94O6897.7
LnLnLnC57H92O6895.7
OSPC55H104O6883.8
LSP, OOP, SOPoC55H102O6881.8
LOP, LnSP, LSPoC55H100O6879.7
LLP, LnOP, LOPoC55H98O6877.7
LnLP, LLPo, LnOPoC55H96O6875.7
LnLnP, LnLPoC55H94O6873.7
LnLnPoC55H92O6871.7
PPSC53H102O6857.8
POP, PPoSC53H100O6855.7
OOM, PPL, PoPoS, POPoC53H98O6853.7
PPLn, PPoL, PoPoO, MyOOC53H96O6851.7
LLM, LnOMC53H94O6849.7
PPP, SSLaC51H98O6829.7
PPPo, OSLaC51H96O6827.7
PPoPo, PMyOC51H94O6825.7
LnLnLaC51H86O6817.6
MMS, SLaP, PPMC49H94O6801.7
SLaPo, PPoM, PPMyC49H92O6799.7
PoPoM, OOCaC49H90O6797.7
MMPC47H90O6773.7
MMPo, OCaPC47H88O6771.7
OCaPoC47H86O6769.6
MMM, PPCa, PMLaC45H86O6745.6
PoPCa, PoMLaC45H84O6743.6
PoPoCaC45H82O6741.6
LaLaP, MMLa, MCaPC43H82O6717.6
LaLaPoC43H80O6715.6
OOC39H72O5643.5
OLC39H70O5641.5
LLC39H68O5639.5
SPC37H72O5619.5
OPC37H70O5617.5
LPC37H68O5615.5

表1. 三酰基甘油和二酰基甘油的钠加合物的脂肪酸组成、元素组成及同位素质量。 Ln=亚麻酸（18:3），L=亚油酸（18:2），O=油酸（18:1），S=硬脂酸（18:0），P=棕榈酸（16:0），Po=棕榈油酸（16:1），M=肉豆蔻酸（14:0），My=肉豆蔻脑酸（14:1），La=月桂酸（12:0），Ca=癸酸（10:0）。

脂质的薄层色谱；甾醇分离；脂质谱图；生物化学分析。
图1. 使用正己烷:乙醚:乙酸（80:20:2 v/v/v）作为流动相进行广谱脂质类别分离的薄层色谱图。 位于甾醇和游离脂肪酸（FFA）之间的条带未通过标准品鉴定，但可能是脂肪醇或蜡质二酯。

显示分子量峰分析的质谱图。
图 2. 东部红蝙蝠（L. borealis）翼组织中钠加合三酰甘油（TAG）的 MALDI-TOF 质谱图在 m/z 700 - 950 范围内的扩展 TAG 区域。 在 m/z 853.7（OOM、PPL、PoPoS、POPo）和 m/z 879.7（LOP、LnSP、LSPo）处鉴定出峰。 点击此处查看高清大图。

质谱结果；光谱分析、峰强度、分子鉴定、化学分析。
图3. 东部红蝙蝠（L. borealis）毛发组织中钠加合物三酰甘油（TAG）的MALDI-TOF质谱图扩展区域（m/z 700 - 950）。 在 m/z 905.8（LOO, LLS）和 m/z 907.8（OOO, LnSS, LSO）处鉴定出峰。 点击此处查看高清大图。

质谱图，显示分子离子峰的 m/z 值，用于蛋白质分析。
图 4. 东部红蝙蝠（L. borealis）翼组织中钠化 DAG 片段的 MALDI-TOF 质谱图的 DAG 区域（m/z 530 - 730）。 在 m/z 643.5（OO）和 m/z 615.5（LP）处鉴定出峰。点击此处查看大图。

讨论

本文介绍了一种简单且稳健的方法，用于通过制备型薄层色谱法（TLC）分离从哺乳动物皮肤组织中提取的宽泛脂质类别，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定甘油三酯（TAG）的谱型，且无需对脂质分子进行耗时的衍生化处理。利用MALDI-TOF MS获得高质量甘油三酯谱图的关键步骤包括：1）尽可能减少污染或氧化，成功提取目标化合物；2）通过色谱法实现充分的分离与纯化；3）MALDI-TOF MS具备高分辨率和高质量精度。

本文通过提取和分离东部红蝙蝠翼膜中的中性脂质组分，获得甘油三酯（TAG）的质谱谱型。尽管本研究使用了一种蝙蝠物种（哺乳纲：翼手目），但这些方法可推广应用于任何哺乳动物皮肤脂质的研究。蝙蝠皮肤脂质的特征主要为胆固醇，含有较低含量的甘油三酯（TAGs）、游离脂肪酸（FFAs）、角鲨烯以及甾醇/蜡酯。蝙蝠皮脂中的脂质比例与人类不同：其中角鲨烯含量较低（相比之下，人类可达16%），而胆固醇比例较高（人类为1–7%，蝙蝠则为26–62%）22,31。人类毛发中甘油三酯含量约为3%，而东部红蝙蝠毛发中该比例可达28%。从蝙蝠中提取脂质样本的方法与其他物种相似。本研究中使用浸有溶剂的棉球去除皮脂，也可通过将含有溶剂的小瓶或样品管多次倒置接触皮肤表面来实现提取。此外，专用胶带产品也提供了提取表面脂质的替代方法32。正确进行脂质提取的关键环节是尽量减少皮肤油脂的污染。这一问题可通过以下方式轻松解决：使用装有甲醇的挤压瓶喷洒所有玻璃器皿和工具，在处理每个样品之间用纸巾擦拭工具，并佩戴检查用手套。为防止多不饱和酰基的氧化，需添加BHT，无论样品在何种温度下储存，均应使用该抗氧化剂。

生物分子分析通常需要色谱步骤，以将目标分子与杂质分离。本方法采用薄层色谱法（TLC），避免了气相或液相色谱对仪器设备的要求，且获得可靠、可重复结果所需的技术经验较少。根据目标脂质类别，可使用多种不同的流动相。此外，采用高效薄层色谱（HPTLC）板结合扫描光密度法，可实现定量分析。尽管薄层色谱法的变体种类繁多，无法在此一一列举，但脂质薄层色谱中一些常用的流动相包括：用于分离磷脂和糖脂的氯仿:甲醇:水体系，以及用于分离非极性脂质的异辛烷:乙醚体系28。在将三酰甘油（TAGs）与其他脂质类别分离方面，H:E:A溶剂体系效果稳定，并可提供可比的结果。

使用薄层色谱（TLC）的另一个优势在于，无需对分析物进行预先衍生化，即可利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）快速分析目标条带。在本研究中，通过超声处理将薄层板上的硅胶去除，并用溶剂洗脱分析物，随后经离心分离吸附剂，再蒸发洗脱溶剂以获得分析物。或者，也可将基质直接涂布于薄层板上已分离的分析物条带处，随后直接进行MALDI-TOF MS分析33。MALDI-TOF MS的成功分析依赖于充分的样品制备以及操作人员对仪器调谐和校准的熟练程度。仪器应每日使用涵盖目标分子分子量范围的标准品进行校准。还应每日使用促肾上腺皮质激素（ACTH）确认仪器具备适当的灵敏度和分辨率（例如 ≥10,000）。

哺乳动物体表皮脂中的脂质成分可能在细菌/真菌病原体的定植过程中发挥作用。因此，了解不同物种及个体间化学成分的差异，可能为人类和野生动物疾病的发生过程提供线索。患病个体与健康个体之间的种内差异可能表现为有助于疾病检测和诊断的临床标志。此外，若存在特定抑制微生物生长的化合物，则可将其鉴定并用于疾病的治疗与预防。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

在实验室方法的开发过程中，Scott Treece、Katelyn Arter、Jeremy Ragsdell、Tony LaMark James、Amy Fischer、Hannah Blair 和 Cheyenne Gerdes 提供了协助。我们感谢 Medina-Bolivar 实验室（Luis H. Nopo-Olazabal；阿肯色生物科学研究所）在薄层色谱扫描密度测定方面的帮助。本项目所使用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）由美国国家科学基金会EPSCoR研究基础设施改进计划——阿肯色ASSET计划P3中心（EPS-0701890）在阿肯色生物科学研究所提供。本研究的资金由美国鱼类及野生动物管理局/阿肯色州野生动物拨款、国家洞穴学会以及印第安纳州立大学北美蝙蝠研究与保护中心提供。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丁基化羟基甲苯MP Biomedicals, LLC101162www.mpbio.com
TLC 柔性板Whatman4410-222www.whatman.com
ACTHSigma-Aldrich Chem. Co.A8346-5X1VLwww.sigmaaldrich.com
三油酸甘油酯Sigma-Aldrich Chem. Co.44895-U 
TLC 脂质标准品TLC 18-1www.nu-chekprep.com
MALDI TAG 标准品Nu-Check Prep., Inc.NIH Code 53B 
MALDI TAG 标准品Sigma-Aldrich Chem. Co.17810-1AMP-S 
带聚四氟乙烯盖的玻璃小瓶U.S. National Scientific Co.B7800-2www.nationalscientific.com/
DHBSigma-Aldrich Chem. Co.50862-1G-F 
CHCASigma-Aldrich Chem. Co.C8982-10X10 mg 
SebutapeCuDermS100 

参考文献

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