Th17细胞的效应功能与其他T细胞亚群不同，其在炎症性自身免疫疾病中具有核心作用。本体外Th17细胞分化方案提供了一种方法，用于确定初始CD4+ T淋巴细胞是否可分化为Th17细胞，并进一步研究其在自身免疫和宿主应答中的作用。
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摘要
摘要
Th17 细胞是一类独特的 T 细胞亚群，能够产生白细胞介素 17（IL-17），其功能不同于其他 T 细胞亚群，如 Th1、Th2 和调节性 T 细胞。Th17 细胞已被证实是多种自身免疫性疾病中过度炎症免疫反应的核心致病因素。本方法中，我们从小鼠 C57BL/6 的脾脏和淋巴结中纯化 T 淋巴细胞，并在对照环境和 Th17 诱导环境下刺激纯化的 CD4+ T 细胞。Th17 诱导环境包括在抗 CD3 和抗 CD28 抗体、IL-6 以及 TGF-β 存在下进行刺激。在 37 °C 下孵育至少 72 小时，最长可达五天后，通过流式细胞术、qPCR 和 ELISA 检测细胞产生 IL-17 的能力。所获得的 Th17 分化 CD4+CD25- T 细胞可用于进一步阐明 Th17 细胞在自身免疫疾病发生与发展以及宿主防御中的作用。此外，利用不同基因敲除小鼠或疾病模型来源的 CD4+CD25- 淋巴细胞进行 Th17 分化研究，有助于加深我们对细胞命运可塑性的理解。
引言
CD4+ T 淋巴细胞（T 细胞）在免疫系统介导的抗感染微生物防御中发挥关键作用。相反，T 细胞也与 1 型糖尿病、系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发病和进展密切相关。CD4+ T 淋巴细胞的活化依赖于 T 细胞受体（TCR）与同源抗原/主要组织相容性复合物 II 类（MHCII）分子的相互作用，以及 CD28 受体与 B7.1/B7.2 配体的相互作用15。除了 TCR 刺激和 CD28 共刺激外，抗原呈递细胞还提供一种细胞因子环境，该环境决定 T 淋巴细胞的分化状态，从而引导 T 淋巴细胞对特定抗原的应答。不同的病原体/抗原呈递细胞相互作用产生不同的细胞因子环境，使 T 淋巴细胞偏向不同的分化通路，以清除初始病原体。然而，T 淋巴细胞效应通路原本用于清除入侵病原体，却可能被错误地导向自身组织15。因此，深入理解每种特定 CD4+ T 细胞亚群的分化状态，对于阐明如何调节清除病原体与自身耐受之间的平衡至关重要。
除了 Th1、Th2 和可诱导的调节性 T 细胞分化途径外，初始 T 淋巴细胞还可由细胞因子驱动进入 Th17 分化途径。Th1 细胞可对抗胞内病原体，Th2 细胞清除胞外病原体，调节性 T 细胞（Tregs）则抑制炎症反应1, 16；而 Th17 细胞在清除胞外细菌和真菌方面发挥重要作用。Th17 细胞通常以表达谱系特异性转录因子 RORγT 以及产生 IL-17A 为特征，后者可促进巨噬细胞和中性粒细胞的活化1, 7。
Th17 细胞已被证实与多种自身免疫性疾病及其相关的啮齿类动物模型有关。例如，已有研究表明，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）——即多发性硬化症（MS）的啮齿类疾病模型中，IL-23（维持 Th17 表型所必需）而非 IL-12，是致病的关键因素。随后的研究进一步表明，IL-17 产生的减少与 EAE 的预防相关2, 6, 17。此外，Th17 细胞还与其他自身免疫性疾病相关，包括关节炎和系统性红斑狼疮（SLE）10, 16。IL-23 缺陷的 p19-/- 小鼠体内 Th17 细胞数量极低，不仅对 EAE 具有抗性，也对胶原诱导性关节炎（类风湿性关节炎的模型）具有抗性10, 18。此外，在胶原诱导性关节炎发病后，使用中和性 IL-17A 抗体处理的小鼠也被发现其关节损伤得到缓解18。值得注意的是，Th17 细胞在自身免疫性疾病进展中的作用仍有待明确，因为近期研究也发现 Th17 细胞在 1 型糖尿病9, 11 和肠道炎症14中具有保护作用。这些研究证实了 Th17 细胞分化在自身免疫中的重要性。
体外 Th17 细胞分化是 T 细胞研究中一种必要方法，因为目前至少存在两个尚需深入探究的复杂问题：1）IL-6 究竟如何调控 Treg 与 Th17 分化之间的平衡；2）IL-17 诱导炎症性疾病的精确机制是什么？本方法采用 C57BL/6 小鼠脾脏和淋巴结中分离的 CD4+CD25- T 细胞。需要注意的是，尽管使用不纯的细胞群体也可诱导 Th17 分化，但获得至少 80% 纯度的 CD4+CD25- T 细胞群体可消除污染担忧，并确保更成功的 Th17 分化结果。为实现适当的 Th17 分化，需将 CD4+CD25- T 细胞在抗 CD3 和抗 CD28 抗体、IL-6 及 TGF-β 存在下进行培养，其中抗 CD3 和抗 CD28 分别提供激活信号 1 和 2。尽管有报道指出仅使用 IL-23 即可实现 Th17 分化，但后续研究证实，IL-23 对维持 Th17 细胞群体的稳定性是必需的，而 IL-6 与 TGF-β 才是 Th17 分化的关键因子3, 18, 19。小鼠研究表明，CD4+ T 细胞仅在经 IL-6 和 TGF-β 刺激后才表达 IL-23 受体13, 18。此外，只要存在 IL-6 和 TGF-β，即使存在 IL-23 阻断抗体，Th17 细胞仍可成功发育18, 19。因此，该 Th17 分化方案提供了成功诱导 Th17 分化的适宜条件。深入理解 Th17 分化及 IL-17 产生的机制，将有助于开发更有效的针对自身免疫性疾病的治疗手段13。
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方案
所有动物使用均按照机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 混合液与培养基的制备
- 无菌 PBS，pH：7.3（1 L）
0.23 g NaH2PO4
1.15 g Na2HPO4
9.0 g NaCl
用去离子水定容。高压灭菌处理。 - 细胞培养基（100 ml）
89 ml RPMI
10 ml 10% FBS
1 ml 抗生素-抗真菌素（ABAM）100 μg 50 mM 2-巯基乙醇（将 3.5 μg 储存液 2-巯基乙醇加入 96.5 μg PBS 中） - FACS 缓冲液（荧光激活细胞分选）（流式细胞术中使用）含 2% FBS 的无菌 PBS
- iTh17 混合液（根据样本数量确定所有混合液及培养基所需体积）
1.5 μg/ml 抗-CD28
20 ng/ml IL-6
5 ng/ml TGF-β
2. 细胞将在以下条件下进行三复孔接种
- 包被平板的抗CD3、抗CD28（此为激活对照组混合物）。
- iTH17：包被平板的抗CD3、抗CD28，联合IL-6、TGF-β。
3. 包被平板的抗CD3抗体（10 μg/ml）
建议至少在向培养板中加入细胞前4小时完成包被抗CD3抗体的培养板的制备。
- 向新的96孔U型底Microtest组织培养板的孔中加入30 μl抗CD3（抗CD3用无菌PBS稀释），轻敲板壁以确保各孔均匀覆盖。37 °C孵育4小时，随后放入冰箱冷藏，直至向板中加入混合液和细胞。
4. 小鼠解剖
- 本实验方案使用购自杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，缅因州巴港）的 C57BL/6 小鼠，年龄为 3–8 个月。
- 采用 CO2 窒息法处死小鼠，并通过后续颈椎脱位确认死亡。
- 用 70% 乙醇对小鼠解剖器械及切口区域进行消毒，然后开始解剖。
- 从腹侧观察，夹住尿道口前方的皮肤，沿腹中线用剪刀向上剪开，直至下颌区域。操作时需注意避免撕裂或剪破腹膜壁内层。
- 将皮肤向后拉开并固定，以便在摘除过程中方便地接触淋巴结。
- 所有采集的淋巴结和脾脏均使用镊子取出，并置于含有 5 ml 自动磁珠分选运行缓冲液（autoMACS Running Buffer，购自 Miltenyi Biotec）的无菌培养皿中（参见 图 2 和 图 3 中的淋巴结与脾脏摘除示意图）。
- 摘除位于每只小鼠腋窝（腋下）胸肌后方的腋窝淋巴结。
- 摘除位于每侧腋窝附近结缔组织中的臂部淋巴结。
- 摘除位于每只小鼠颈部的浅表颈淋巴结。
- 摘除位于髋部区域三根血管交汇处的腹股沟淋巴结。
- 为获取肠系膜淋巴结，需沿腹中线切开腹膜。肠系膜淋巴结位于连接肠道的结缔组织中，通常呈 4–8 个成串排列，外观可能类似“一串珍珠”。务必完整取出整串淋巴结。
- 脾脏位于腹腔内，胃和肠道后方。通过牵拉并从胰腺上分离即可将其摘除。
- 在无菌操作台中使用两张磨砂载玻片研磨器官。将淋巴结或脾脏置于一张载玻片的磨砂面上，用另一张载玻片的磨砂面摩擦，直至组织完全破碎。重复此操作，直至所有淋巴结和脾脏均被研磨完毕。
注意：建议先从淋巴结开始，最后处理脾脏，因为血液会影响在autoMACs缓冲液中观察其余淋巴结。
- 为了将研磨后的器官过滤成单细胞悬液，首先将一片40 μm的尼龙滤膜折叠数次，然后放置在15 ml离心管的管口。尼龙滤膜的尺寸应约为3英寸×3英寸。
- 使用5 ml注射器和21 G针头吸取5 ml autoMACs运行缓冲液和研磨后的器官组织。缓慢将液体滴加至折叠的尼龙滤膜上。注意避免针头刺破滤膜。
注意：一旦获得单细胞悬液，溶液应呈现均匀的浅色，无可见的固体组织碎片。如果仍有固体残留，需重新吸出并通过置于新的15 ml离心管中的新尼龙膜折叠层反复吹打。
- 不使用时，务必始终将细胞置于冰上。
5. 细胞分离
- 为获得最佳结果，使用 Miltenyi Biotec 提供的小鼠 MACS CD4+CD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒，通过 autoMACS Pro 细胞分离仪获得至少 80% 纯度的 CD4+CD25- 细胞群体。CD4+CD25- 细胞群体的阴性保留方案由 Miltenyi Biotec 提供。
6. Th17 细胞分化
- 使用 autoMACS Pro 细胞分离仪分离后，收集 CD4+CD25- 细胞群。
- 用台盼蓝以 1:1000 比例稀释细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 根据细胞计数结果确定细胞浓度后，用细胞培养基将细胞悬液稀释至 1 × 106 个细胞/ml。
- 4 小时后取出已包被抗 CD3 抗体的 96 孔板。
- 用 200 μl PBS 洗涤抗 CD3 包被的孔，重复 2 次。
- 洗涤时，向抗 CD3 包被的孔中加入 200 μl 无菌 PBS，随后将 PBS 移入废液容器中。
- 向各孔中加入 100 μl iTh17 混合液或活化对照混合液（见第 2 点），每组设三个复孔。
- 向已加入 Th17 混合液或活化对照混合液的各孔中分别加入 100 μl 细胞悬液。
- 将细胞孵育至少 72 小时，或最长 5 天（Th17 分化可在 72 小时或 5 天后获得）。
- Th17 分化情况可通过胞内染色与流式细胞术分析、ELISA 或 qPCR 进行评估。
7. 细胞激活 （仅细胞内染色需要）
- 在培养72小时或5天结束时，从培养箱中取出96孔板
- 请记住，Th17 分化可在 72 小时或 5 天后完成。
- 每种条件（例如 将激活对照（activation control）或iTh17细胞的三复孔细胞合并转移至24孔细胞培养板中的一个孔内。此时，同一实验条件下的细胞已合并至24孔培养板的一个孔中，而非保留在96孔U底培养板中的三复孔形式。
- 24孔细胞培养板中每孔的总体积现为600 μl。用细胞培养基将每孔体积补至1 ml。
- 向24孔细胞培养板的每孔中加入PMA（佛波酯，50 ng/ml）、离子霉素（ionomycin，1 μM）和BFA（布雷菲德菌素A，Brefeldin-A，10 μg/ml），终浓度按所列浓度。
- 37 °C 下孵育 4 小时。
8. 胞内染色
- 使用所需的细胞外和细胞内标志物对细胞进行染色，用于流式细胞术分析。为检测 IL-17 的存在，需使用抗 IL-17A 抗体进行细胞内染色。推荐的细胞表面标志物包括 CD4、CD8 和 CD25。
- 使用 BD Bioscience 的小鼠细胞内细胞因子染色入门试剂盒（Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse）进行 IL-17 细胞内染色。
- 对于每个样本，离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 μl FACS 缓冲液（含 2% FBS 的 PBS）中。
- 将重悬的细胞转移至 96 孔流式细胞术板中。
- 以 1,200 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 加入 200 μl PBS FACS 缓冲液，以 1,200 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 将细胞重悬于 100 μl FACS 缓冲液中，并加入 100 μl 细胞外抗体（Ab）混合液（细胞外抗体混合液用 FACS 缓冲液配制）。室温避光孵育 15 分钟。
- 重复步骤 8.1.4。
- 重复步骤 8.1.5 两次。
- 将细胞重悬于 100 μl BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液中。室温避光孵育 20 分钟。
- 加入 100 μl 1x BD Perm/Wash 缓冲液，以 1,200 rpm 离心 5 分钟，弃去上清液。重复一次。
- 加入 50 μl 细胞内抗体混合液（细胞内抗体混合液用 1x BD Perm/Wash 缓冲液配制）。室温避光孵育 15 分钟。
- 重复步骤 8.1.10。
- 将细胞重悬于 200 μl BD 染色缓冲液中。
- 将重悬的细胞加入含 200 μl BD 染色缓冲液的流式细胞术管中（终体积为 400 μl）。
- 4 °C 避光保存，直至准备上机检测。
9. 流式细胞术分析
- 圈选活细胞群体。
- 从活细胞群体中，圈选 CD4+CD8- 群体。
- 从 CD4+CD8- 群体中，圈选 IL-17A+ 群体。
- 根据我们先前的实验结果，100% 的 IL-17A+ 群体均为 CD25+。
*总绝对细胞数在合并样本三复孔后获得
**CD4+CD25+IL-17A+ 细胞的绝对数量通过总细胞数乘以活细胞门控百分比以及流式细胞术测定的表达谱系特异性标记物 CD4、CD25 和 IL-17A 的总细胞百分比计算得出。
10. qPCR 和 ELISA
- 将不用于流式细胞术分析的细胞置于1.5 ml离心管中，以13,000 rpm离心5-10分钟。离心后沉淀中的细胞将用于qPCR分析。qPCR分析使用Biorad的PTC-200 Peltier Thermal cycler进行。
- 收集离心后管中的上清液用于ELISA检测。IL-17A ELISA检测使用BD Biosciences购买的抗体对TC11-18H10（捕获抗体，货号555068）和TC11-8H4生物素标记抗体（检测抗体，货号555067）。IL-17A ELISA标准品来自eBioscience（货号14-8171-80）。
- 去除上清液后，将剩余用于qPCR分析的细胞重悬于175 μl RNA裂解缓冲液中（立即用于RNA提取、cDNA合成和qPCR，或储存于-80 °C以备后续使用）。
- IL-17A和肌动蛋白（看家基因）的引物序列请参见表II
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结果
该 Th17 分化实验方案首先摘除脾脏以及腋窝、臂部、肠系膜、颈部和腹股沟淋巴结。各淋巴结位置示意图见于 图2 和 3. 图1 和 5 均提供了本实验方案中所述方法的可视化展示。
该 Th17 细胞分化方案专注于从 CD4+CD25- T 淋巴细胞群体中进行诱导分化。值得注意的是，autoMACS Pro 细胞分选系统能够高效地从合并的淋巴结和脾脏组织中富集我们目标的 CD4+CD25- 细胞群体（图4）。未分选的合并淋巴结与脾细胞，以及经 autoMACS 分选后的各组分均使用抗CD4和抗CD25抗体染色，并进行流式细胞术分析（图4）。图4A 展示了通过流式细胞术检测未分选合并淋巴结和脾脏中 CD4+CD25+ 与 CD4+CD25- 淋巴细胞百分比的代表性图谱。该分离方法还可从 C57BL/6 小鼠中获得富集的 CD4+CD25+ 调节性T细胞（Treg）群体，可用于其他实...
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讨论
在此，我们描述了实现该目标的实验方案 体外 Th17分化。研究Th17分化具有重要意义，因为T淋巴细胞向Th17亚群的分化对于有效清除人类病原体至关重要。13相反，IL17的产生与自身免疫性疾病的发展进程相关13Th17细胞分化方法适用于多种研究场景，因其可应用于众多不同的小鼠免疫调节与自身免疫疾病模型。该方法有助于解答关于T淋巴细胞分化为Th17细胞的能力问题，本实验方案中以IL-17A的产生及转录因子RORγT的表达作为Th17细胞分化的标志。此外，已有研究证实，Th17细胞还可通过产生IL-17F、IL-22和GM-CSF进行鉴定。 8, 12该方案相较于其他已知的T淋巴细胞分化方案（如Th1或Th2分化）具有重要意义，因其可用于补充这些方案，从而更深入地理解T淋巴细胞效应功能与免疫系统运作之间的关系。
进行这些实验时，有几个关键步骤需要考虑。Th17 细胞的分化可以通过纯度不高的 CD4+CD25- 细胞群体实现，但为了获得最有效且可靠的结果，建议 CD4+CD25- 细胞群体的纯度至少达到...
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披露
无须声明任何披露事项。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院临床与转化科学奖（NIH/NCATS Clinical and Translational Science Awards）对佛罗里达大学的资助（TL1 TR000066 和 UL1 TR000064）、美国国立卫生研究院 R01AI056152 项目的多样性补充资助、BD 生物科学试剂资助以及佛罗里达大学的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂/材料 | |||
| 无菌聚酯培养皿 | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm × 15 mm |
| autoMACS 运行缓冲液 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| 优质显微镜载玻片，磨砂面 | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3" × 1"1 mm |
| 5 ml 21G1 无乳胶注射器及针头 | BD生物科学 | 309632 | |
| Corning 15 ml 离心管 | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 尼龙 40 微米 | 迈阿密水产养殖 | 尼龙 40/26 | |
| 96孔U型底微量组织培养板 | BD生物科学 | 35-3077 | |
| 康宁科斯特24孔细胞培养板 | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf管 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD3e | BD 生物科学 | 553057 | |
| 纯化的NA/LE仓鼠抗小鼠CD28 | BD 生物科学 | 553294 | |
| 小鼠 IL-6 重组蛋白 | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFβ | R&D Systems | 240-B-002 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue 大鼠抗小鼠 CD4 | BD生物科学 | 558107 | |
| APC 标记的抗小鼠 CD8a 大鼠抗体 | BD 生物科学 | 553035 | |
| PE标记的抗小鼠CD25抗体 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 大鼠抗小鼠 IL-17 | BD 生物科学 | 560820 | |
| 小鼠细胞内细胞因子染色初学者试剂盒 | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ 调节性T细胞分离试剂盒，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | 康宁，赛尔格罗 | 10-040-CM | |
| B 2-巯基乙醇–乙醇 | MP Biomedical | 194834 | 有害的 |
| 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA） | |||
| 钙离子霉素（Ionomycin Calcium Salt） | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | 危险的 |
| 布雷菲德菌素A（BFA） | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A 捕获单抗 | BD 生物科学 | 555068 | |
| ELISA IL-17A 检测单克隆抗体 | BD 生物科学 | 555067 | |
| ELISA IL-17A 标准品 | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA 试剂盒 | BD 生物科学 | 555148 | |
| TMB 底物试剂盒 | BD 生物科学 | 555214 | |
| <强>仪器设备 | |||
| autoMACS Pro 细胞分离仪 | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ 离心机 | 赛默飞世尔科技 | ||
| Napco 系列 8000 WJ CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| PTC-200 帕尔帖热循环仪 | 伯乐（Bio-Rad） |
参考文献
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重印与许可
