基于细胞介电谱的特发性脊柱侧弯预后预测细胞检测方案

摘要

本文介绍了一种基于细胞的检测方法的标准化操作流程，该方法作为一种功能检测手段，利用细胞介电谱技术（CDS）预测特发性脊柱侧弯的预后。该检测可使用新鲜或冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）进行，整个实验过程在4天内完成。

摘要

本方案详细描述了我们实验室开发的一种基于细胞的功能检测实验及分析流程，用于预测无症状及患病儿童特发性脊柱侧弯的预后。该检测通过细胞介电谱技术（CDS），使用一种自动化的基于CDS的仪器，评估外周血单个核细胞（PBMCs）中Gi和Gs蛋白的功能状态，并根据Gi与Gs蛋白刺激反应程度之间的失衡特征，将儿童分为三个功能组（FG1、FG2、FG3）。该分类进一步通过各组间骨桥蛋白（OPN）对Gi刺激反应的差异效应加以验证，其中疾病严重进展者对应于FG2组。提取PBMCs需约10 ml血液，采用Ficoll密度梯度法分离细胞后，将细胞保存于液氮中。进行检测所需的足够数量的PBMCs可在细胞培养两天后获得。基本流程为：首先将细胞与植物血凝素（PHA）共孵育。经过24小时孵育后，更换为不含PHA的培养基，继续培养24小时，随后进行细胞接种和OPN处理。然后通过光谱学方法检测细胞对生长抑素和异丙肾上腺素的反应，这两种物质分别通过其特异性受体激活Gi和Gs蛋白。生长抑素和异丙肾上腺素由集成流体系统同时注入，并持续监测细胞反应15分钟。该检测可使用新鲜或冻存的PBMCs进行，整个过程在4天内完成。

引言

特发性脊柱侧凸是一种病因不明的脊柱畸形，通常定义为伴有椎体旋转的侧方弯曲角度超过10度¹。该疾病影响约4%的儿科人群，最常见于9至13岁之间被诊断^2,3,4。诊断主要通过排除法确定，需在排除其他脊柱畸形病因（如椎体畸形、神经肌肉或综合征性障碍）后方可确诊。传统上，通过亚当斯前屈试验发现躯干不对称，并在体格检查中使用脊柱侧凸测量仪进行测量⁵。随后可通过X线影像观察侧弯情况，并采用科布法测量角度以确认诊断⁶。

一旦确诊，医生在管理脊柱侧弯患儿时的主要关切是脊柱弯曲是否会进展。事实上，弯曲的进展往往难以预测，且在女孩中比在男孩中更为常见⁷。若不进行治疗，弯曲可能显著加重，导致明显的身体畸形，甚至出现心肺问题。当弯曲角度超过70°时，这些表现可能危及生命^8,9。目前用于预防或阻止弯曲进展的治疗方案包括支具矫形和手术。通常，对于弯曲角度在25–40°之间的患者建议使用支具，而弯曲角度大于45°或对支具治疗无效的患者则需进行手术治疗。

大约10%被诊断为特发性脊柱侧弯的儿童会出现侧弯进展，需要接受矫正手术¹⁰。目前尚无经过验证的方法或检测手段可用于识别此类患者。因此，所有被诊断为脊柱侧弯的儿童在数年内都需要接受多次放射影像检查，通常持续至骨骼发育成熟。据估计，典型的脊柱侧弯患者在3年期间将接受约22次影像学检查¹¹。由于多次放射影像检查存在潜在风险，因此迫切需要开发替代方法，以在无需使儿童暴露于电离辐射的情况下实现特发性脊柱侧弯的预后评估。为满足这一需求，我们此前已开发出一种基于细胞的筛查检测方法，作为预测性检测手段，用于更早识别有发展为特发性脊柱侧弯风险的无症状儿童。该检测通过检测Gi蛋白的功能状态，并根据CDS系统测定的Gi蛋白刺激最大反应程度，将儿童分为三个功能组（FG1、FG2和FG3），从而预测无症状及已患病儿童的临床结局¹²。该系统广泛用于评估多种细胞类型中G蛋白介导的信号转导^13,14,15,16。其通过测量细胞表面受体激活后阻抗的变化，反映细胞对外界刺激的总体整合反应。细胞被接种至底部带有电极的微孔板中，系统施加微小电压，从而产生细胞外和跨细胞电流。当向孔内注入化合物后，细胞表面受体被激活，引发信号转导事件，导致细胞发生改变，进而影响细胞外和跨细胞电流的流动，从而改变测量所得的信号强度。采用该方法发现，与健康对照个体相比，脊柱侧弯患者及更易发展为脊柱侧弯的儿童对Gi蛋白刺激的反应性较低，其功能分组依据相对于对照组反应程度降低的百分比确定。FG3的分组范围固定为10%至40%，FG2为40%至60%，FG1为60%至90%¹²。

最近，我们通过证明这三个功能组可根据对Gi和Gs刺激反应失衡的特征进行明确区分，对该方法进行了改进。事实上，我们发现FG3中对Gi刺激的反应占主导地位，而在FG2中未观察到明显的失衡现象。相反，FG1则表现出对Gs刺激反应的主导性。此外，我们还提供了证据，表明属于FG2的患者进展至需要手术干预的风险更高¹⁷。通过证明骨桥蛋白（OPN）在不同功能组间对Gi刺激反应具有差异性作用，该分类检测的精确性进一步得到提高。

本文记录了本实验室目前进行此项功能检测所采用的实验与分析步骤的详细过程。

方案

整个操作均在无菌生物安全柜中进行，所有与细胞接触的溶液和设备必须保持无菌。

1. 基本溶液的配制

1. 根据表1配制溶液。
2. 平衡盐溶液（BSS）于室温保存，其余溶液于4 °C保存，直至使用时取出。
3. 使用前将低温培养基置于水浴中加热数分钟至37 °C。

2. PBMC 的制备与保存

1. 在经EDTA处理的采血管中采集10 ml全血，用于制备两份PBMC样品，每份使用5 ml全血。
2. 将5 ml全血从经EDTA处理的采血管转移至一个50 ml离心管中。
3. 加入等体积的BSS，并通过轻柔吹打混匀样品。
4. 在两个15 ml Falcon管中各加入3 ml Ficoll。
5. 在每根管中的Ficoll液面上小心地叠加4.5 ml稀释后的血液混合液。
6. 让离心管静置最多5分钟，以利于血液与Ficoll之间形成清晰的分层。
7. 在室温下以400 × g离心30分钟，离心过程中不启用刹车。
8. 小心从离心机中取出离心管，避免扰动分层结构。PBMC位于BSS与Ficoll的界面处，肉眼可见。
9. 用移液器小心吸取两根管中界面处的浑浊PBMC层，并转移至一个新的50 ml离心管中。
10. 加入20 ml完全培养基。
11. 在室温下以288 × g离心7分钟。
12. 通过抽吸去除上清液。
13. 用500 μl补充培养基重悬细胞沉淀。
14. 加入等体积的冻存液。
15. 将细胞悬液转移至冻存管中。
16. 将冻存管放入含有异丙醇的冻存盒中。
17. 将冻存盒置于-80 °C环境中过夜。
18. 将冻存的PBMC样品转移至液氮中进行长期保存。

3. 功能检测

1. 第1天

1. 将液氮中保存的细胞样品置于37 °C水浴中约1分钟，或直至完全解冻。
2. 用无菌移液管将细胞悬液转移至50 ml离心管中。
3. 加入15 ml完全培养基，于室温下以200 × g离心5分钟。
4. 通过抽吸去除上清液。
5. 用1 ml PHA培养基轻轻重悬细胞沉淀。
6. 用相同的培养基补足体积至20 ml。
7. 将管盖松开，以允许空气进入。
8. 将离心管置于37 °C、CO₂培养箱中过夜，使静止期淋巴细胞转化为快速增殖的淋巴母细胞。

2. 第2天

1. 从培养箱中取出试管，完全拧紧管盖，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
2. 通过抽吸去除上清液。
3. 用 1 ml 完全培养基轻轻重悬细胞沉淀。
4. 用相同的培养基补足体积至 20 ml。
5. 将试管盖松松拧上，以允许空气进入。
6. 将试管置于 37 °C 的 CO₂ 培养箱中过夜，以扩增细胞数量。

3. 第3天

1. 从培养箱中取出试管，完全拧紧管盖，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。
2. 通过抽吸去除上清液。
3. 用 10 ml RPMI-1640 重悬细胞，于室温下以 200 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞两次。
4. 在 600 μl RPMI-1640 中轻柔重悬细胞沉淀。
5. 使用自动细胞计数仪和细胞活力分析仪测定细胞浓度和细胞活力。
6. 加入适量 RPMI-1640，调整细胞浓度至 1.5 × 10⁵ 个细胞/20 μl。
7. 在 1.5 ml 离心管中用重组 OPN（rOPN）或对照溶剂（PBS）处理细胞。
   1. 将 100 μl 细胞悬液转移至两个无菌的 1.5 ml Eppendorf 管中。
   2. 在其中一个管中加入 rOPN，使其终浓度为 0.5 μg/ml。
   3. 在第二个管中加入等体积的 PBS。
   4. 使用设定为 100 μl 的无菌移液器，轻轻吹打两次，使每种条件下的溶液混匀。
8. 准备小型样品 96 孔微孔板。
   1. 向每个孔中加入 5 μl RPMI-1640。
   2. 以 200 × g 离心 3 分钟，去除可能存在的气泡。
9. 接种未经处理的细胞以及经 rOPN 或 PBS 处理的细胞。
   1. 在将细胞从离心管转移至微孔板前，轻轻吹打一次，确保细胞悬液均匀。
   2. 每孔加入 40 μl 细胞悬液，未经处理的细胞设四复孔，rOPN 或 PBS 处理的细胞设两复孔。参见图 1中的实验设计。该设计可在同一块微孔板上检测 12 名患者样本。
   3. 将细胞板置于无菌操作台中静置 5 分钟，使细胞充分休息并均匀沉降至孔底，然后再放入培养箱中。
10. 将微孔板置于 37 °C 的 CO₂ 培养箱中孵育 18 小时，以优化 OPN 的作用效果。

4. 第4天

1. 使用化合物进行检测。
   1. 将培养板从培养箱中取出，在室温下放置约30分钟。
   2. 通过将10 μl储存液（10 mM）加入990 μl RPMI-1640培养基中，配制1 ml浓度为100 μM的生长抑素和异丙肾上腺素溶液。
   3. 根据图2所示，在相应的孔中加入20 μl化合物，完成化合物板的加样。
   4. 用预先切割好的可穿刺密封膜覆盖化合物板，以避免在基于CDS的系统中孵育前或孵育期间因蒸发导致化合物浓度变化。
   5. 将细胞板、移液枪头和化合物板装入基于CDS的系统中。
   6. 在基于CDS的仪器软件中为该板命名。
   7. 选择合适的实验程序。用于PBMC分类的已编辑程序名为'Agonist Non-adherent cells Small Sample Plate RT 15 min'。进入程序选择框，在程序列表中选择该程序。
   8. 点击'开始'以启动程序。
   9. 集成流体系统通过向每孔注入5 μl液体，同时将化合物加入所有孔中，最终在总体积为50 μl的条件下达到10 μM的终浓度。
   10. 基于CDS的系统在加入化合物后自动采集15分钟的数据。
2. 数据分析
   1. 选择用于计算非贴壁细胞提取值的低频和高频范围。
   2. 选择漂移校正，以校正随时间推移发生的基线阻抗测量值的线性变化。
   3. 选择数据滤波，以减少由于电子噪声和化合物添加引起的动力学反应测量中的波动。
   4. 在整个分析时间内选择“最大-最小值法”（Max-Min method）。
   5. 在“板格式”选项下将数据导出至Excel。
   6. 使用以下公式计算ΔG值：通过从Gs刺激的平均反应幅度（RmGs）中减去Gi刺激的平均反应幅度（RmGi），得到ΔG：
      ΔG = RmGi - RmGs
   7. 使用以下公式计算OPN对Gi介导反应的倍数效应百分比（Fe）：将存在OPN时Gi刺激的平均反应幅度（RmGiOPN）除以存在PBS时Gi刺激的平均反应幅度（RmGiPBS），再乘以100：
      Fe = 100 × (RmGiOPN/RmGiPBS)
   8. 参考表2对患者进行分类。

结果

所有样品的细胞活力相当，数值均稳定在86%至96%之间。相比之下，各样品间的细胞数量差异较大。表3）。在使用的32个样本中，有两个样本细胞数量不足，未进行分类。下图示例展示了根据Gi与Gs信号通路失衡程度进行功能分类的结果 图3该图的纵轴分为三个部分，分别表示已确定动态范围的功能组 > FG3为+10，FG2介于+10至-10之间，最后 < -10 对于 FG1。在本研究检测的 30 名患者中，分别有 14 名、6 名和 5 名患者明确归类于 FG3、FG2 和 FG1，另有 5 名患者（编号为 345、353、370、371 和 382）处于分类范围的临界值。对 OPN 对 Gi 刺激反应影响的评估显示，OPN 增强了患者 353 和 371 的反应。相反，在接受重组 OPN（rOPN）处理后，患者 345 和 382 的反应降低了超过 50%，而患者 370 的反应降低幅度小于 50%。因此，根据我们的分类标准（表2），我们能够将患者353和371归为FG1，患者345和382归为FG2，患者370归为FG3。同时，对所有患者进行了Gi蛋白刺激反应的筛查，并与对照组受试者进行比较。结果如预期，所有患者的反应性均低于对照组，且通过新方法归入相同功能组的患者表现出相似的最大反应水平（图5）。此外，各功能组患者之间的差异与我们经典的分类范围一致 ¹²，验证了我们的新流程。在圣心医院专科门诊定期随访的大样本脊柱侧弯患者分类结果显示，在中度病例中，三个功能组的分布情况相似，而在重度病例中，FG2组占主导地位（图6），识别出被归入该功能组的患者面临更高的疾病严重进展风险，并表明该分类检测在特发性脊柱侧弯的预后评估中具有应用价值。

溶液A	无水D-葡萄糖	0.1%
	CaCl2 2H2O	0.05 mM
	MgCl2	0.98 mM
	KCl	5.4 mM
	Tris	145 mM
溶液B	NaCl	140 mM
平衡盐溶液（BSS）	溶液A	1体积
	溶液B	9体积
完全培养基	RPMI-1640	500 ml
	抗生素-抗真菌剂	1%
	FBS	10%
补充培养基	RPMI-1640	50 ml
	抗生素-抗真菌剂	1%
	FBS	40%
冻存培养基	RPMI-1640	50 ml
	抗生素-抗真菌剂	1%
	FBS	40%
	DMSO	20%
PHA培养基	RPMI-1640	500 ml
	抗生素-抗真菌剂	1%
	FBS	10%
	植物血凝素	1%

表1. 基本溶液。

ΔG 对应的动态范围	官能团	Fe 对应的动态范围
ΔG< -10	FG1	Fe>100%
-10 <ΔG< +10	FG2	Fe<50%
ΔG> +10	FG3	50%

表2. 根据使用 ΔG 和 Fe 确定的动态范围对官能团进行分类。

患者	存活率 (%)	细胞浓度 (×106/ml)	备注
343	88.7	11.64
344	90.5	13.6
345	94.4	8.54
346	94.3	25.79
347	94.2	27.36
348	94.6	8.52
349	91.2	0.82	细胞数量不足
350	90.3	8.92
352	92.6	8.28
353	91.3	12.75
354	86.9	7.62
355	91.2	7.51
356	90.3	9.36
358	95.1	16.94
359	92.3	13.89
360	89.4	7.67
361	93.5	7.84
365	86.5	2.2	细胞数量不足
368	92.6	15.69
369	93.4	10.9
370	92.5	19.93
371	88.8	10.68
374	93.9	16.86
376	92.9	15.67
377	93.1	9.99
378	93.6	13.57
379	92.6	19.86
380	91.1	8.46
381	93.9	14.82
382	92.1	23.06
383	92.9	11.82
384	89.1	7.73

表3. 使用自动细胞计数器和活力分析仪测定的细胞活力百分比和细胞浓度。

图 1. 细胞接种设计。

图 2. 化合物分配方案设计.

图 3. 基于 CDS 系统的功能分类动态范围。该图显示了特发性脊柱侧弯患者外周血单个核细胞（PBMC）对 Gi 和 Gs 刺激反应失衡程度的 ΔG 值。这些值是通过 CDS 基础系统在 10 μM 生长抑素和异丙肾上腺素刺激下测得的。每个数据点代表两次重复实验中两种反应的 ΔG 值。

图4. rOPN对PBMCs细胞响应Gi刺激的影响。细胞在含或不含0.5 μg/ml rOPN的条件下血清饥饿处理18小时，随后用10 μM生长抑素刺激以启动Gi介导的细胞反应。图中数据来源于最大-最小阻抗值，代表双重复实验的平均反应结果。

图 5. 对照组与脊柱侧凸患者外周血单个核细胞中 Gi 蛋白的功能状态。将来自对照组个体和脊柱侧凸患者的外周血单个核细胞（PBMCs）暴露于浓度递增的生长抑素中，以通过内源性生长抑素受体激活 Gi 蛋白。细胞反应通过如实验步骤部分所述的基于CDS的系统进行测定。曲线由最大-最小阻抗值生成。每条曲线代表非线性回归结果。数据已归一化为对照组个体细胞中的最大反应，每个数据点对应于重复实验的平均反应值。 点击此处查看高清大图。

图6. 不同阶段脊柱侧弯患者中功能组的分布。在圣心医院（Sainte-Justine Hospital）长期随访的一大群脊柱侧弯患者中，包括794例中度病例（曲度在10–44°之间）和162例重度病例（曲度大于45°），根据其对Gi与Gs刺激反应失衡的程度进行分类。反应程度通过基于CDS的系统在10 μM生长抑素和异丙肾上腺素刺激下测定。

讨论

我们已描述了一种用于特发性脊柱侧弯的基于细胞的预后检测的详细步骤，该方法适用于新鲜分离或在液氮中冷冻保存长达一年的外周血单个核细胞（PBMCs）。由于在检测大量个体时使用新鲜分离的PBMCs较为繁琐，因此本方案采用冷冻PBMCs，这在临床实践中更具可操作性。然而，最初使用冷冻PBMCs时，在解冻过程中出现了细胞聚集的问题，有时导致不同批次检测之间的变异性。为最大程度提高检测的可重复性，我们建议避免冻融循环，并仅使用一次冷冻样本。该方法非常简便，可在短时间内准确检测Gi蛋白功能缺陷。利用此方法，可对无症状儿童和脊柱侧弯患儿进行简便分类，从而更准确地预测其临床结局，且对健康无任何风险。然而，在根据个体对Gi蛋白刺激的最大反应程度相对于健康对照组进行分类时¹²，对照组受试者需满足若干条件。实际上，为了建立合适的对照队列，对照组受试者必须与患者在年龄和性别上相匹配，不能服用任何药物，并需提供个人及家族既往病史等隐私信息。这些要求可能成为招募对照组受试者的重要障碍。因此，通过分析同一受试者对Gi与Gs蛋白刺激反应之间的失衡程度来进行分类，是消除使用对照组需求的理想方法。

采用基于CDS的系统进行该预后检测具有重要意义，因为它能够在同一实验中同时提供Gi和Gs介导的细胞反应。尽管使用本实验设定的动态范围可对多数患者进行明确分类，但仍有少数患者的检测值处于范围边界，如本报告结果所示。为了区分这些个体，我们引入了OPN对Gi刺激反应影响的评估，证明OPN在三个功能组之间对Gi介导的细胞反应产生差异性效应。事实上，我们发现，在OPN存在的情况下，FG1中对Gi刺激的反应增强，而FG2和FG3中的反应则降低，其中FG2的降低更为显著。尽管OPN成本较高，但该趋化因子的使用对于区分模糊病例至关重要，从而提高了我们分类检测的准确性。然而，该检测存在一个缺点：在我们的实验条件下，使用基于CDS的系统观察细胞反应时，每孔至少需要1.5 × 10⁵个细胞。某些患者的样本细胞数量不足以进行检测。在此情况下，必须召回患者进行额外采血，这可能引起家属担忧，并给医疗和实验室人员带来困扰。我们实验室已计划开展前瞻性研究以解决这一问题。

然而，目前的实验方案依赖于简单且经过验证的细胞制备方法，同时采用经过验证的无标记系统自动进行检测^{13, 14}，以监测细胞的反应。与用于其他疾病预后判断的基因检测平台相比，该检测平台的成本相对较低。此外，所有一次性耗材（包括采血管、枪头、特殊电极微孔板以及锥形管和Eppendorf管）的费用也不高，估计完成约一千名患者的检测总成本低于3000美元。尽管该估算未包含样本制备和检测操作所需的人工成本，但该检测方法仍明显比下一代测序平台更经济实惠。值得注意的是，不仅应将其与基因检测平台进行成本比较，更应特别关注其在AIS领域与放射影像学检查相关的成本。目前，美国有超过一百万名儿童、加拿大约有十万名儿童被诊断为特发性脊柱侧弯，北美地区每年用于脊柱侧弯儿童X射线检查的诊断与监测总费用超过25亿美元。因此，我们基于细胞的检测方法有望适用于特发性脊柱侧弯儿童的常规筛查和监测，既无健康风险，又具有更低的成本。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
RPMI	Wisent, Inc	350-005-CL
FBS	Therno Scientific Hyclone	SH3007103
DMSO	Sigma Aldrich	D2650
Ficoll-Plaque Plus	GE Healthcare	17144003
抗生素-抗真菌剂	Invitrogen	15240-062
植物血凝素	Invitrogen (Gibco)	10576-015
重组人骨桥蛋白	R&D Systems, Inc	1433-OP/CF
生长抑素	Tocris	1157
异丙肾上腺素	Tocris	1743
PBS	Wisent, Inc	311-010-CL
无菌移液器吸头	Axygen Scientific	301-06-451
无菌Eppendorf管	Ultident	24-MCT-150-C
50 ml锥形管	VWR International	89039-658
Cellkey小样品96孔微孔板	Molecular Devices	1026496
Cellkey吸头	Cybio	OL3800-25-559N
预切割穿刺密封膜	Excel Scientific, Inc	XP-100
设备
Vicell XR	Beckman Coulter	731050	自动细胞计数仪
细胞培养罩	Forma Scientific	1284	II级生物安全柜
液氮储存罐	Thermo Scientific	CY5093570
水浴锅	VWR International	89032-204
标准光学显微镜	Leica Microsystems	DMIL LED
细胞培养孵箱	Thermo Scientific	51019557	37 °C，5% CO2
低速离心机	Thermo Scientific	75004364
Cellkey系统	Molecular Devices	1019185	基于CDS的仪器